svampen Candida guilliermondii är utbredd i naturen, inklusive den mänskliga mikrobioten i hud-och slemhinneytorna.22 även om denna art visar en minskad virulens jämfört med andra Candida-arter,3 anses den för närvarande vara en framväxande patogen, med en stor förekomst i Latinamerika.18C. guilliermondii har erkänts som det etiologiska medlet för en mängd olika kliniska infektioner, inklusive disseminerade,främst hos immunkomprometterade patienter, 22 och nosokomiala utbrott hos kirurgiska patienter med intravaskulära enheter.13 för närvarande inkluderar den rekommenderade behandlingen för invasiv candidiasis hos neutropeniska patienter caspofungin (CFG) eller micafungin (MFG) som första linjens terapier, liposomalt amfotericin B (lamm) och anidulafungin (AFG) är alternativ, medan flukonazol (FLC) rekommenderas endast när mottagligheten för detta läkemedel bekräftas.23 flera studier har dock visat att C. guilliermondii har en minskad känslighet för FLC8, 15, 19 och terapeutiska misslyckanden associerade med isolat med höga amfotericin B (AMB) minimala hämmande koncentrationer (Mic) har rapporterats.9,12,24 även om nästan 90% av isolaten visar echinocandins Mikrofoner lika med eller lägre än kliniska brytpunkter (CBP) av mottaglighet (2 kg/ml), 17 liknar andra arter av Candida, såsom C. parapsilosis, vissa isolat av C. guilliermondii visar Mikrofoner betydligt höga.8,15 tillgängliga data om AFG-effekten vid invasiv candidiasis är begränsade och läkemedlets potentiella roll i klinisk praxis är dåligt känd.23 i detta sammanhang kan djurstudier spela en viktig roll för en bättre förståelse av in vitro–in vivo-korrelationen.11 Därför var vårt huvudmål att utvärdera AFG: s in vitro-och in vivo-aktiviteter mot olika isolat av C. guilliermondii, jämföra resultaten med AMB och FLC.
material och metodersvampi isolat
fyra kliniska isolat av C. guilliermondii (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 och UTHSC 10-3207) användes i in vitro-studien och två av dem (UTHSC 11-685 och UTHSC 11-142) valdes ut för murinmodellen på grundval av deras olika in vitro-känslighet. Isolaten identifierades genom att sekvensera den interna transkriberade distansregionen (ITS) och D1–D2-domänerna i rRNA, jämföra sekvenserna med de av typen stam av denna art.
in vitro-studier
in vitro-känsligheten hos de fyra stammarna för AMB, FLC och AFG utvärderades med hjälp av en referensbuljongmikrodilutionsmetod,6Candida parapsilosis ATCC 22019 och Candida krusei ATCC 6258 inkluderades som kvalitetskontroller.
tidsdödande kurvor utvecklades för alla stammar enligt tidigare studier.5,20 i korthet bereddes en stamlösning av varje antifungal, AMB (Sigma–Aldrich Co., St. Louis, USA) och AFG (Pfizer Inc., Madrid, Spanien) löstes i dimetylsulfoxid och FLC (Pfizer Inc., Madrid, Spanien) i destillerat vatten. Vidare bereddes läkemedelsutspädningar i 9 ml standard rpmi 1640-medium för att erhålla koncentrationer av 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 och 32 mg / ml av varje läkemedel. Isolaten subkultiverades vid 35 C i 24 timmar på potatisdextrosagar (PDA) plattor. Kulturer av C. guilliermondii suspenderades i steril saltlösning och de resulterande suspensionerna justerades vid 5 106 kolonibildande enheter (CFU)/ml av hemocytometerantal och genom seriell plätering på PDA för att bekräfta livskraften. Utspädningar och kontroller (drogfria) inokulerades med 1 ml av svampsuspensionerna, vilket resulterade i ett startinokulum på 5 kg 105 cfu / ml och inkuberades vid 35 kg C. en alikvot på 100 kg från varje rör uppsamlades vid 0, 2, 4, 6, 8, 24, och 48h efter ympning och späddes i destillerat vatten; 30 oc av dem odlades på PDA-plattor och inkuberades vid 35 oc C för 48h för CFU/ml bestämning. En CFU-minskning av 99,9% eller 3 log10-enheter i enlighet med utgångsinokulatet ansågs fungicid, medan en minskning av
log10-enheter ansågs fungistatisk. Detektionsgränsen var 50CFU / ml. All time-kill kurva studier utfördes i duplicate.In vivo-studier
manliga of-1-möss (Charles River; Criffa SA, Barcelona, Spanien) med en medelvikt på 30g användes i experimentet. Möss hölls i standardlådor med fri tillgång till mat och vatten. Alla djurförfaranden övervakades och godkändes av Universitat Rovira i Virgili Animal Welfare and Ethics Committee.
möss gjordes neutropen en dag före infektion med en intraperitoneal (IP) injektion av 200 mg/kg cyklofosfamid (Genoxal; Laboratorios Funk SA, Barcelona, Spanien) plus en intravenös (IV.) injektion av 5-fluorouracil (Fluorouracilo; Ferrer Farma SA, Barcelona, Spanien) vid 150 mg/kg.10,14 dagen för infektion, möss utmanades i.v. med 1 msk 108cfu/djur av var och en av de två stammarna av C. guilliermondii, UTHSC 11-685 och UTHSC 11-142, i 0,2 ml steril saltlösning i den laterala svansvenen.3,4
grupper om åtta djur fastställdes slumpmässigt för varje stam och läkemedel. Grupperna behandlades enligt följande: amfotericin B-deoxikolat (AMBd) (Xalabarder Pharmacy, Barcelona, Spanien) i doser på 0, 8 mg/kg i.v. en gång om dagen (QD); liposomalt amfotericin B (lamm) (Gilead Sciences S. A., Madrid, Spanien) vid 10 mg/kg i. v., QD; FLC (Pfizer Inc., Madrid, Spanien) vid 25 mg/kg oralt (p. o.) genom sondmatning, två gånger dagligen (BID); och AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Storbritannien) vid 10 mg/kg kroppsvikt/dos IP, QD. Alla behandlingar började 24 timmar efter utmaning och varade i 7 dagar. Kontrollerna fick ingen behandling. För att förhindra bakterieinfektioner fick alla möss 5 mg/kg dag ceftazidim subkutant från dag 1 till 7 efter infektion. Möss kontrollerades dagligen och avlivades dag 8 Efter infektion med CO2-anoxi. Effekten av varje läkemedel utvärderades genom vävnadsbörda minskning och histopatologiska studier. Njurar avlägsnades aseptiskt, och en av dem vägdes och homogeniserades i 2 ml steril saltlösning. Seriella 10-faldiga utspädningar av homogenaten pläterades på PDA och inkuberades i 48 timmar vid 35 kub C för CFU/g-beräkning. För histopatologistudien fixerades den återstående njuren med 10% buffrad formalin, dehydratiserad, paraffininbäddad och skivad i 2 kg sektioner, vilka färgades med hematoxylin–eosin (H-E) och periodisk syra-Schiff (PAS) fläck för undersökning genom ljusmikroskopi.
statistik
Koloniantal från vävnad analyserades med Mann-Whitney U-test, med användning av Graph Pad Prism 4.0 för Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). När P-värdena var under 0,05 ansågs skillnaderna vara statistiskt signifikanta.
Resultati vitro-studier
Mic: er av AMB var 0,25–1 kg/ml, 0,06–0,25 kg/ml för AFG och 0,5-1 kg/ml för FLC. Efter avstängningarna av känslighet för AMB,FLC och AFG mot C. guilliermondii var 16 alla isolat mottagliga för de tre läkemedlen. Kvalitetskontrollstammar känslighet var inom de accepterade områdena.6
amb: s dödande kinetik visade en snabb fungicid aktivitet som ökade med läkemedelskoncentrationen. Vid koncentrationer motsvarande MIC visade det läkemedlet en fungicid effekt mot tre av de fyra testade isolaten (Fig. 1). Denna aktivitet startade omedelbart efter inokulering i koncentrationer över 1 kg/ml, den fungicida slutpunkten uppnåddes efter 4 timmar vid 32 kg/ml. AFG vid koncentrationer över 0,5 occurg/ml visade fungicid aktivitet som började efter 4 timmars inkubation. Den fungicida endpointen uppnåddes vid 12-24h inkubation vid 32 occurg/ml (Fig. 2). FLC visade fungistatisk aktivitet mot alla fyra isolaten (Fig. 3).
tidsdödande kinetikanalyser av AMB mot fyra stammar av C. guilliermondii. (■) 0.03 µg/ml (▴) 0.12 µg/ml (□) 0.5 µg/ml (○) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, (▿) 8µg/ml, (♦) 32µg/ml, (●) kontroll. Streckade linjer representerar en CFU-minskning av 3log10 enheter i tillväxt jämfört med det initiala inokulatet (fungicid aktivitet), streckade linjer indikerar kvantifieringsgränsen för testet.
tidsdödande kinetikanalyser av AFG mot fyra stammar av C. guilliermondii. (■) 0.03 µg/ml (▴) 0.12 µg/ml (□) 0.5 µg/ml (○) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, (▿) 8µg/ml, (♦) 32µg/ml, (●) kontroll. Streckade linjer representerar en CFU-minskning med 3 log10 enheter i tillväxt jämfört med det initiala inokulatet (fungicid aktivitet), streckade linjer indikerar kvantifieringsgränsen för testet.
tidsdödande kinetikanalyser av AFG mot fyra stammar av C. guilliermondii. (■) 0.03 µg/ml (▴) 0.12 µg/ml (□) 0.5 µg/ml (○) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, (▿) 8µg/ml, (♦) 32µg/ml, (●) kontroll. Streckade linjer representerar en CFU-minskning med 3 log10 enheter i tillväxt jämfört med det initiala inokulatet (fungicid aktivitet), streckade linjer indikerar kvantifieringsgränsen för testet.
tidsdödande kinetikanalyser av FLC mot fyra stammar av C. guilliermondii. (■) 0.03 µg/mL (▴) 0.12 µg/ml (□) 0.5 µg/ml (●) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, (▿)8µg/ml, (♦) 32µg/ml, (●) kontroll. Streckade linjer representerar en CFU-minskning av 3log10 enheter i tillväxt jämfört med det initiala inokulatet (fungicid aktivitet), streckade linjer indikerar kvantifieringsgränsen för testet.
tidsdödande kinetikanalyser av FLC mot fyra stammar av C. guilliermondii. (■) 0.03 µg/mL (▴) 0.12 µg/ml (□) 0.5 µg/ml (●) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, (▿)8µg/ml, (♦) 32µg/ml, (●) kontroll. Streckade linjer representerar en CFU-minskning av 3log10 enheter i tillväxt jämfört med det initiala inokulatet (fungicid aktivitet), streckade linjer indikerar kvantifieringsgränsen för testet.
in vivo-studier
lamm vid 10 mg / kg var det enda läkemedlet som kunde minska svampbelastningen i njurar hos möss infekterade med var och en av de två stammarna, vilket var reduktionen signifikant högre än den för de andra terapierna (p 0,04). AMBd och FLC kunde bara minska vävnadsbördan hos möss infekterade med stammen som visade de lägsta mikrofonerna för dessa två läkemedel, dvs 0,25 kg/ml för AMB och 0,5 kg/ml för FLC (p 0,008). I fallet med AFG var svampbelastningsreduktionen blygsam och lägre än för AMBd, och det minskade signifikant vävnadsbelastningen i njure endast med avseende på kontrollgrupp för stam UTHSC 11-685 (P=0,002) (Fig. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 och FLC 50; cP0. 05 kontra AFG 10 och FLC 50.
den histologiska studien visade fokal infiltration av svampceller i njurar hos obehandlade djur och hos möss behandlade med AMBd, FLC eller AFG. Njurar av möss behandlade med lamm visade endast en mild svampinvasion. Tecken på nekros, inflammatoriskt svar eller parenkymförändringar observerades inte heller i kontroller varken hos behandlade djur (Fig. 5).
förekomst av svampinfiltrering (svart pil) i njursektionen hos en kontrollmus infekterad med C. guilliermondii, vid 8 dagar efter infektion (periodisk syra Schiff-färgning, förstoring 1000 kcal). Bar=10 occurm.
diskussion
in vitro-studierna visade inte minskad känslighet för C. guilliermondii-isolat för FLC eller AFG. I överensstämmelse med tidigare studier visade amb: s tidsdödande kurvor en koncentrationsberoende fungicid aktivitet mot alla isolat, 4,5,7 och FLC visade en fungistatisk effekt oavsett den testade koncentrationen.7 Det är känt att AMBd uppvisar en högre effekt än dess lipidformulering, särskilt i njure, när de administreras båda i samma doser.1 farmakokinetiska studier visade emellertid att efter administrering av 0, 75 mg/kg amb var Cmax för AMB som uppnåddes i mössserum 0, 30 occurg/ml.25 AMB MIC för ett av de två testade isolaten är dock högre än detta värde; därför använde vi en hög dos lamm för att nå högre koncentrationer.1 faktum är att administreringen av lamm vid 10 mg/kg var effektiv för att minska svampbelastningen hos båda stammarna. Detta faktum korrelerade med dödningskurvor, där AMB uppnådde sin fungicida aktivitet mot de två isolaten som testades in vivo, vid koncentrationer av 1 kg/ml. Så vitt vi vet är detta den första studien som försökte upprätta ett samband mellan dödande kinetik och in vivo experimentell effekt av AFG och FLC mot kliniska isolat av C. guilliermondii. Endast en tidigare studie om echinocandiner finns, särskilt på caspofungin (CFG) vid spridd infektion av C. guilliermondii. CFG vid 1 mg/kg var effektivt för att minska njursvampbelastningen hos möss infekterade med en stam av C. guilliermondii med en MIC på 8 kg/ml, medan tidsdödande avslöjade att ingen fungicid aktivitet uppnåddes vid koncentrationer av 64 kg / ml.4 omvänt visade vår studie en koncentrationsberoende aktivitet av AFG, som vid 32 kg/ml utövade en fungicid aktivitet,som tidigare rapporterats, 17 vid 24 timmar och vid 8 kg/ml. Tidigare studier rapporterade AFG-koncentrationer i serum och njure på cirka 13 kcal/ml efter 7 dagars behandling i doser på 10 mg/kg.21 här kunde AFG endast blygsamt minska svampbördan i njurarna hos neutropeniska möss infekterade med en av de två testade stammarna, vilket inte verkar vara relaterat till den låga AFG-Mic-skillnaden mellan de två testade stammarna (1 utspädning), vilket tyder på att svaret på AFG-behandling är stamberoende. På samma sätt kunde FLC också bara minska svampbördan i njure hos möss utmanade med en av de två stammarna trots den administrerade dosen som når serumkoncentrationer över Mic: erna,2 vilket inte heller var förvånande på grund av dess fungistatiska aktivitet.
Sammanfattningsvis visade vår studie den högre aktiviteten och effekten av lamm mot de två stammarna av C. guilliermondii, i motsats till den dåliga effekten av FLC och AFG. Ytterligare studier med fler isolat av C. guilliermondii som representerar ett bredare spektrum av AFG-Mikrofoner bör dock utföras för att bedöma om det finns något samband mellan MIC-värden och AFG-effekt.
intressekonflikt
ingen att deklarera.
