CPZ dämpar kolit oberoende av TRPV1

för att utmana mekanismen genom vilken CPZ-lavemang dämpar experimentell kolit inducerade vi dextransulfatnatrium (DSS) kolit i vildtyp (WT) och TRPV1-bristfälliga möss (varje grupp N = 8). Även om det finns motstridiga rapporter utvecklade TRPV1-bristande möss DSS-kolit och viktminskning i samma grad som de kongena WT-mössen i vårt laboratorium, vilket överensstämmer med våra resultat från modellen av tnbs-kolit som vi tidigare hade publicerat7,8,9,10,11,12. För Cpz-enema-behandlingar använde vi samma koncentration av CPZ (531 occurm) som tidigare rapporterades för att dämpa DSS (5%) kolit i rats8. Förloppet av kolit övervakades dagligen genom kroppsviktmätningar och endoskopi. Två gånger dagligen appliceringar av Cpz (531 occurm) enemas dämpade DSS− kolit i samma grad i både WT och TRPV1−/ – möss, vilket återspeglades av en förbättrad endoskopisk poäng och minskad förlust av kroppsvikt (Fig. 1A-C). H&e fläckar från den distala kolon i slutet av 7-dagars DSS-experimentet avslöjade förstörd slemhinnevävnadsarkitektur med många infiltrerande immunceller i kolon av kontroller. Detta var i skarp kontrast till en allmänt intakt slemhinna och frånvaron av signifikant immuncellinfiltrering i kolonerna hos Cpz-behandlade möss av båda genotyperna (Fig. 1D). I enlighet med dessa fynd reducerades den histologiska poängen kraftigt i de Cpz-behandlade mössen av båda genotyperna (Fig. 1E).

Cpz aktiverar TRPA1

in vivo-observationen att CPZ-lavemang effektivt hämmade kolit i TRPV1 nollmutanta möss ställde frågan på TRPV1-oberoende neuronala effekter av CPZ. Eftersom TRPA1 hade visat sig vara avgörande i olika modeller av inflammation inklusive kolit6,12,14, testade vi om CPZ verkar på TRPA1.

CPZ-inducerade Joniska strömmar genom hTRPA1

Lappklämsexperiment utfördes i spänningsklämläge på HEK293t-celler som uttrycker rekombinant hTRPA1 (hTRPA1-HEK293t-celler). Vid en innehavspotential på -60 mV inducerade CPZ (10 kg) en inre ström som nästan fullständigt hämmades (93% hämning, n = 5) av den selektiva TRPA1-antagonisten HC-030031 (HC, 10 kg) (Fig. 2A). I alla celler i vilka en Cpz-inducerad inåtström registrerades, framkallade carvacrol (100 occurm) en etablerad TRPA1-agonist också stora inåtströmmar vid samma hållpotential, vilket demonstrerade funktionellt uttryck av hTRPA1. Dessa htrpa1-HEK293-celler utsattes också för spänningsramper från -100 till +100 mV med 400 ms varaktighet var 4: e sekund (Fig. 2B). Det CPZ-inducerade, strömspänningsförhållandet visade något utåt rättelse och en reverseringspotential nära 0 mV (Fig. 2C). Strömmarna som framkallades av CPZ (10 kg) hämmades av HC (10 kg). Effekten var mer uttalad vid negativa potentialer (89% 5% inhibering vid -80 MV, genomsnittlig SD, n = 7) än vid positiva potentialer (80% 9% inhibering vid +80 MV).

Cpz-inducerad kalciuminflöde genom hTRPA1

selektiv verkan av CPZ på TRPA1 bekräftades genom användning av kalciummikrofluorimetriteknik. htrpa1-HEK293-celler stimulerades av två applikationer av CPZ (50 occurm) för 10 s vid 5-min intervaller (Fig. 2D). De selektiva antagonisterna HC (20 kg) och a-967079 (10 kg) applicerades i 1 minut före och under den första Cpz-utmaningen. CPZ-svaret avskaffades fullständigt av båda antagonisterna. Det är värt att notera att avlägsnandet av HC ledde till en kalciuminflöde, troligen på grund av kvarvarande CPZ-verkan, medan denna off-effekt var frånvarande i fallet med A-967079 som kan lossna långsammare (Fig. 2D). Vi analyserade sedan koncentrationsberoende av CPZ-effekter. Ökande Cpz-koncentrationer (100 nM, 500 nM, 5 kg och 50 kg) applicerades på htrpa1-HEK293-celler i 20 s vardera med 3-min intervaller. Från och med 100 nM framkallade alla koncentrationer av CPZ kalciumtransienter med allt större amplituder (Fig. 2E). Carvacrol (100 occurm) applicerades i slutet av experimentet för att kontrollera för funktionellt TRPA1-uttryck, men carvacrol-svaret efter 50 occurm CPZ var påfallande litet, vilket tyder på korsdesensibilisering. Otransfekterade hek293-celler utsattes för samma Cpz-applikationer och endast den högsta koncentrationen som testades (50 GHz) inducerade en minimal ökning av kalcium. Vi förväntade oss att CPZ skulle engagera de tre kritiska cysteinresterna i kanalens N-terminala domän eftersom det är en elektrofil förening. HEK293-celler som uttrycker WT hTRPA1 och celler som uttrycker trippelcysteinmutanten hTRPA1-3C (C621S, C641S, C665S) utsattes för Cpz-applicering (1 kg, 20 s) följt av den icke-elektrofila agonisten carvacrol (100 kg, 20 s) och den mycket elektrofila AITC (50 kg, 30 s). Ionomycin applicerades i slutet av experimentet som en positiv kontroll. Amplituden för kalciumtransienten som framkallades av 1 kg Cpz reducerades väsentligt (>80%) i celler som uttrycker hTRPA1-3C jämfört med celler som uttrycker WT hTRPA1 (Fig. 2F), medan skillnaden i Cpz-känslighet mellan genotyperna avskaffades vid 100 kg Cpz-koncentration (Fig. 2G). AITC-svaret minskade i mutantcellerna, medan carvacrol framkallade stora kalciumjontransienter i både WT-och 3C-mutanter. Sammantaget indikerar dessa cellsvar att den relativt höga styrkan hos CPZ beror på de tre kritiska cysteinerna. Men när koncentrationen av CPZ är 100 gånger högre tar andra bindningsställen över aktiveringen av hTRPA1. Denna höga koncentration av lipofil CPZ kan också interagera med det cellulära lipidmembranet, indirekt aktiverande TRPA1, som tidigare visats för lipid A-komponenten i lipopolysackarider16. Dessutom, i närvaro av den elektrofila rensaren N-acetyl cystein (NAC) vid en mättnadskoncentration (15 mM) 50 oc Cpz kunde inte framkalla något svar. Vid avlägsnande av NAC framkallade CPZ stora kalciumtransienter i hTRPA1-transfekterade HEK293t-celler (Fig. 2H) som bekräftar att CPZ fungerar som en elektrofil agonist för hTRPA1.

CPZ aktiverar en subpopulation av AITC-känsliga dorsala rot ganglion (DRG) neuroner

DRG-neuroner bibehölls i primärkultur och undersöktes med kalciummikrofluorimetri. Celler stimulerades av CPZ (50 oc, 20 s), följt av AITC (100 oc, 30 s), capsaicin (CAP, 1 oc, 10 s) och KCl (60 mM, 30 s). Figur 3A illustrerar exempel på DRG-neuroner som svarar på alla dessa fyra stimuli. En typisk fraktion av DRG-neuroner aktiverades av AITC (301 av 906 neuroner, 33%, n = 8 möss) som indikerar funktionellt uttryck av TRPA1. En subpopulation av dessa AITC-känsliga neuroner aktiverades också av CPZ (185 av 301 neuroner, 61%). Känsligheten för CPZ var nästan helt begränsad till AITC-responsiva neuroner. Av totalt 200 Cpz-känsliga neuroner aktiverades också 185 (93%) av AITC, vilket indikerar en stark överensstämmelse av känslighet för CPZ och AITC (Fig. 3). Som i fallet med hTRPA1-Uttryckande HEK293-celler var kalciumtransienterna som framkallades av CPZ i DRG-neuroner koncentrationsberoende med ett EC50-värde uppskattat till 30 oc Cpz och det lilla AITC-svaret efter 100 oc Cpz föreslog igen korsdesensibilisering (Fig. 3B, C). Figur 3D visar överlappningen av CPZ, CAP och AITC-respons i WT DRG-neuroner vid givna koncentrationer: 14% av DRG-neuronerna svarade på AITC men inte på CAP (125/906), 16% svarade på CAP men inte på AITC, medan CPZ inducerade kalciumtransienter i 78% av neuronerna som svarade på både AITC och CAP (137 av 176). För att visa specificiteten hos de observerade effekterna exponerades TRPV1−/− och TRPA1−/− DRG-neuroner för ovanstående protokoll. Cirka 90% av de TRPV1-bristfälliga DRG-neuronerna som var AITC-känsliga svarade också på CPZ (509/572-celler), medan ingen av de 448 TRPA1-bristfälliga DRG-neuronerna som testades visade kalciuminflöde som svar på CPZ (100 occm) som illustreras av representativa exempel i Fig. 3E, F.

systemisk desensibilisering genom TRPA1 dämpar smärta

Efter att vi hade upptäckt att CPZ är en potent TRPA1-agonist förstod vi varför de första CPZ-klyftorna (två gånger dagligen) uppenbarligen var smärtsamma i WT-mössen. Vi kvantifierade sedan Cpz (531 occurm) enema-inducerat nocifensivt beteende hos friska djur (varje n = 6) genom att räkna de vridande reaktionerna och registrera visceromotoriska reflexsvar (VMRs) genom integrerad elektromyografi (EMG) i bukmuskelväggen (Fig. 4A, B). Under upprepningen av Cpz-behandlingarna två gånger dagligen noterade vi att TRPA1 knockouts inte visade smärtrelaterat beteende när som helst. Dessutom presenterade WT-mössen en progressiv minskning av initialt starka smärtresponser med en brant nedgång runt dag 3 vilket ledde till en slutligen fullständig desensibilisering i båda nocifensiva parametrarna. Denna förlust av colonic smärtuppfattning i annars normala möss höjde förväntan att enemas kan ha levererat CPZ en farmakodynamisk mängd tillräcklig för att inducera systemisk hypoalgesi. För att testa denna hypotes använde vi ögontorkningstestet med hjälp av AITC (100 occm) och lock (1 mM) (Fig. 4C, D) (n = 6). Båda testerna visade en distinkt dämpning av ögontorkningsantal i WT-mössen som hade behandlats med CPZ-lavemang (fram till 12-16 timmar före testet). Dessa effekter medierades troligen av TRPA1-desensibilisering snarare än TRPV1-block, eftersom TRPV1-bristfälliga möss var okänsliga för senapsolja (AITC, 100 mic) instillation i ögat i samma grad som WT-möss (Fig. 4C). Omvänt var CPZ-enemas ineffektiva i TRPA1 – / – möss, när dessa möss utmanades av CAP-instillationer i ögat (Fig. 4D).

eftersom upprepade lavemang är en obehaglig administreringsväg, testade vi för en eventuell anti-nociceptiv effekt av peroral CPZ (531 baccarat) i dricksvattnet. Dricksregimen över 10 dagar tolererades väl utan några uppenbara biverkningar. Under kontinuerlig oral Cpz-administrering ökade paw-abstinensfördröjningen till strålningsvärmestimulering (Hargreaves-metoden) gradvis i båda bakbenen (Fig. 4E). Toleranstiden var ungefär fördubblad på dag 7 och förblev signifikant förhöjd från dag 2 till 10. Efter 2 veckors återhämtning med rent dricksvatten hade abstinenslatenser återgått till baslinjenivån. Den mekaniska responsen på stimulering med den linjärt ökande kraften hos ett elektrodynamiskt von Frey-filament påverkades inte signifikant under de tio dagarna av Cpz-drickande (Fig. 4F). Frågan uppstod om värme och kemisk hypoalgesi representerade en klasseffekt av desensibiliserande TRPA1-agonister eller om det var specifikt för CPZ. Således administrerade vi AITC i en liknande och väl tolererad koncentration (500 oc) via dricksvattnet. Samma dosregim för AITC som beskrivits för CPZ resulterade i en progressiv ökning av paw-abstinens latens till strålningsvärmestimulering som var signifikant mindre än den som inducerades av CPZ (Fig. 4E). Mekanisk respons ändrades inte under AITC-dricksregimen (Fig. 4F).

CPZ orsakar långvarig desensibilisering av TRPA1/TRPV1 som uttrycker peptidergiska sensoriska neuroner

vi ställde sedan frågan om desensibilisering av hela djur av CPZ kunde reproduceras på cellulär nivå. För detta ändamål utförde vi kalciumbildningsexperiment med isolerade DRG-neuroner som hade erhållits från kontrollmöss och från djur behandlade i 7 dagar två gånger dagligen med CPZ-lavemang. Dessa neuroner behölls nödvändigtvis i kultur för 16 till 24 h, i närvaro av NGF. Totalt 399 neuroner från kontrollmöss och 584 neuroner från enema-behandlade möss laddades med Fura-2 och kalciumtransienter framkallade av AITC, carvacrol, CAP och en KCl-rik lösning registrerades. Svaren på dessa TRPA1 (AITC och carvacrol) och TRPV1 (CAP) agonister var inte signifikant olika i DRG-neuroner från kontrolldjur och lavemang-behandlade djur (Fig. S1). TRPA1 mRNA-uttryck (qPCR) var emellertid ungefär två gånger uppreglerad i lumbosakral DRG beredd omedelbart efter det slutliga Cpz-lavemanget (Fig. S2) medan ingen förändring i TRPA1-uttryck detekterades när 24 h hade förflutit in vivo efter den slutliga lavemang. TRPV1 mRNA förändrades inte under båda omständigheterna. Således hade transkriptionell uppreglering av TRPA1-genuttrycket ägt rum på grund av flera CPZ-lavemang, men vändes snabbt när Cpz-tillförseln avbröts. Under DRG-odlingsförhållanden hade samma epigenetiska reversering sannolikt ägt rum och all kvarvarande CPZ tvättades troligen ut, så att ingen kvarvarande desensibilisering faktiskt kunde förväntas. Eftersom cellmodellerna inte återspeglade den outlasting CPZ-inducerade desensibiliseringen av hela djuren in vivo, letade vi efter en annan stark indikator på den överraskande systemiska effekten. Majoriteten av nociceptiva neuroner är peptidergiska och uttrycker övervägande kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP) och substans P (SP)15,17. Vid depolarisering, som genom KCl och kalciuminflöde, på grund av aktivering av spänningsstyrda kalciumkanaler, frigörs dessa neuropeptider från nervfibrerna i en kvasi-efferent funktion (neurogen inflammation). Å andra sidan är aktiverade TRP-kanaler mycket bra kalciumledare i sig och behöver inte stöd av några spänningsstyrda natrium-eller kalciumkanaler för att framkalla vesikulär exocytos av CGRP18. Således kan stimulerad frisättning av CGRP fungera som ett index för (peptidergisk) nociceptoraktivering. På samma sätt har vasoaktiva neuropeptider olika effekter på inflammationsprocessen i sig och utarmning eller desensibilisering av den peptidergiska sensoriska neuronpopulationen har visat sig dämpa kolit19,20,21. För att avgöra om Cpz (531 occurm) enemas desensibiliserar genom TRPA1, lokalt och systemiskt, använde vi isolerade muskolon-och hudpreparat. Kolon av friska C57BL / 6-möss (n = 8) exponerades för CPZ (100 occurm) som inducerade massiv CGRP-frisättning (Fig. 5); efterföljande tillämpningar av AITC (100 kcal) 5 min eller 15 min efter CPZ (Fig. 5A, B) kunde inte längre inducera CGRP-frisättning, vilket tyder på en djup akut funktionell korsdesensibilisering mot TRPA1-agonisten. Denna effekt kan inte bero på utarmning, eftersom det efterföljande KCl-svaret (60 mM) var normalt. Kolon från möss som hade behandlats upprepade gånger med Cpz (531 occurm) enemas in vivo, två gånger dagligen för 7 d isolerades och testades 12-16 h efter den sista enema. Varken CPZ (100 okt) eller AITC (100 okt) inducerade någon CGRP-frisättning i detta tillstånd (Fig. 5C, D); i synnerhet reducerades CAP (30 nM)-inducerad CGRP-frisättning kraftigt men avskaffades inte (Fig. 5E). Däremot var KCl (60 mM)-inducerad CGRP-frisättning genom ospecifik depolarisering inte bara oreducerad utan faktiskt förbättrad efter CPZ-lavemang. Detta indikerade att kolonnervfibrerna inte var utarmade av CGRP utan snarare överfyllda, men ändå väsentligen desensibiliserade på ett hållbart sätt till kemisk aktivering genom TRPA1 såväl som TRPV1 (n = 6). Slutligen visade också hudpreparatet, isolerat 12-16 h efter den sista Cpz-enema, att AITC (100 kg) och CAP (1 kg)-inducerad CGRP-frisättning reducerades kraftigt i enlighet med den kroppsövergripande desensibilisering som observerades i beteendetesterna (Fig. 5F, G, se Fig. 4A-F) (n = 6).