resultat

identifiering av IL-7-Receptor-kedjan (CD127) som en markör för minnes-T-celler. När vi letade efter nya markörer för att definiera effektor-och minnes-T-cellundergrupper i musen analyserade vi ytuttryck av IL-7-receptorn 2Br-kedja/CD127 (Fig. 1a). Under primära svar på Lm kan distinkta subpopulationer av antigenspecifika mjält-t-cellpopulationer särskiljas baserat på CD127-uttrycksnivåer. CD127 låguttryckande celler (CD127low) dominerar under den akuta effektorfasen. Under övergången till minnes-T-cellfasen försvinner emellertid CD127low-celler gradvis, medan populationer som uttrycker höga nivåer (CD127high) förblir anmärkningsvärt stabila i storlek över tiden (Fig. 1 a och c). Dessa distinkta kinetiska värden tyder starkt på att CD127-uttryck är en selektiv egenskap för T-celler med lång livslängd. Under effektorfasen migrerar CD127low CD8+ T-celler företrädesvis till icke-lymphoida organ, medan endast CD127high CD8 + T-celler detekteras i LN (Fig. 1b). Mjälten representerar ett” mellanliggande organ ” där alla olika subpopulationer finns tidigt efter immunisering (22, 23). Senare under minnesfasen kännetecknas antigenspecifika T-celler i alla organ av en Cd127hög fenotyp (Fig. 1 b och c). Jämförelse av kapaciteten av CD127low och CD127high antigen-specifika T-celler för att proliferera som svar på stimulering avslöjade slående skillnader mellan de två delmängderna. Såsom visas i Fig. 1D, renade Listeria-specifika Cd127höga T-celler prolifererar snabbt efter anti-CD3-stimulering, medan CD127low T-celler prolifererar dåligt. Det är osannolikt att dessa skillnader i proliferation återspeglar en fördel med CD127-positiva celler genom Ab-medierad IL-7R-stimulering eftersom olika Mab-kloner med känd CD127-aktiverande eller blockerande aktivitet visade samma effekt i kortvariga in vitro-stimuleringsanalyser (data visas inte).

för att mer direkt visa att T-celler med lång livslängd är exklusivt närvarande i CD127 – höguttrycksfacket tidigt efter in vivo-priming utförde vi adoptivöverföringsstudier med hjälp av en nyligen utvecklad reversibel MHC-multimerfärgningsteknik (21) för att funktionellt isolera antigenspecifika T-celler direkt ex vivo. Efter adoptiv överföring av CD127high LLO91-99-specifika T-celler från möss infekterade i 10 dagar med Lm, var de överförda cellerna fortfarande detekterbara flera veckor senare i mjälten hos naiva mottagarmöss (Fig. 2a), medan cellnumren efter överföring av Cd127låga celler var vid detektionsgränsen. Denna observation berodde inte på skillnader i in vivo-migration av överförda CD127 high och CD127low-celler, eftersom vi hittade liknande skillnader för lungan (Fig. 2a) och andra organ (LN och lever, data visas inte). För att ytterligare stödja tolkningen att CD127high T-celler uteslutande upprätthåller antigenspecifika minnesceller utmanades mottagarmöss efter adoptivöverföring med Listeriainfektion. Återigen, endast hos möss som hade fått Cd127höga T-celler före infektion var snabb expansion av överförda LLO91-99-specifika T-celler detekterbara (Fig. 2b). Återigen berodde detta resultat inte på skillnader i migration eftersom underhåll eller expansion av överförda CD127low T-celler inte kunde detekteras i något annat organ (Fig. 2b och data som inte visas). Även om dessa resultat från adoptivöverföringsstudier starkt stöder hypotesen att T-celler med långlivat minne uteslutande finns i cd127high T-celler, observerade vi också betydande begränsningar av detta experimentella tillvägagångssätt. I synnerhet minnes-T-celler med omedelbar effektorfunktion verkar vara ganska känsliga för adoptivöverföringsexperiment och dör snabbt efter rening och IV-applikation; även om de överlever i månader till år om de lämnas orörda in vivo (11). Således, även om våra resultat från adoptivöverföring överensstämmer med tolkningen att CD127 är en markör för T-celler med lång livslängd, kan vi inte utesluta att inneboende problem med överlevnad av distinkta t-cellsubpopulationer också bidrar till resultatet av dessa experiment.

Costaining av antigenspecifika t-cellpopulationer med CD127 och CD62L möjliggör diskriminering mellan minne T-Cell subpopulationer. Ytterligare karakterisering av cd127high T-cellpopulationen visade att den kan delas in i subpopulationer som uttrycker höga och låga nivåer av CD62L (Fig. 3). Direkt ex vivo funktionell analys (21) av renade T-celler (10-12 dagar efter infektion, när alla subpopulationer samtidigt kan detekteras i mjälten) avslöjade ytterligare funktionella skillnader. Medan cd62llow t-cellundergrupper visar kraftig och omedelbar ex vivo cytolytisk aktivitet, visar CD127high/ CD62Lhigh T-celler mycket dålig lys av peptidbelagda målceller (Fig. 3). Intracellulär cytokinfärgning av sorterade subpopulationer avslöjade att CD127high/CD62Llow T-celler, som CD127low/CD62Llow-delmängden, producerar effektorcytokinerna INF-gastronomi och tumörnekrosfaktor; däremot producerar CD127high / CD62Lhigh-delmängden IL-2 men inte IFN-coronaviruset och tumörnekrosfaktor. Således möjliggör markörkombinationen av CD127 och CD62L identifiering av T-cellsubpopulationer med egenskaper som är mycket lik de som beskrivits tidigare hos människor. CD127low / CD62Llow T-celler visar alla kända egenskaper hos en verklig effektor-t-cellpopulation (TE, dålig proliferativ aktivitet, begränsad in vivo-överlevnad och omedelbar effektorfunktion). Cd127high/CD62Lhigh delmängd matchar egenskaperna hos TCM, och CD127high / CD62Llow T-celler passar beskrivningen av TEM.

generering av distinkta minne T-Cell subpopulationer beror på CD40L-medierad T-Cell hjälp. Eftersom vi kände att det kan vara problematiskt att uteslutande basera tolkningen att CD127-uttryck kan användas som en markör för att skilja mellan effektor och långlivade minne T-celler på adoptiva cellöverföringsexperiment, bestämde vi oss för att analysera musmutanta linjer med defekter i genereringen av T-cellminne. Om CD127 verkligen är en” tidig ” minne t-cellmarkör, borde vi kunna identifiera skillnader under tidiga och sena tidpunkter inom CD127-positiva delmängder hos möss med minnesfel.

eftersom nya studier visade vikten av T-cellhjälp för generering av långvariga minnessvar (2-4) bestämde vi oss för att bestämma om närvaron eller frånvaron av CD4+ T-cellhjälp under CD8+ T-cellpriming leder till skillnader i de antigenspecifika t-cellundersättningskompositionerna som detekterades i den tidiga posteffektfasen. MHC II-bristfälliga möss, som saknar konventionella CD4 + T-celler, har ett defekt CD8+ – minnessvar och skyddskvaliteten minskar med tiden (2-4). Färgning för T-cell subpopulationer 10 dagar efter primär infektion visade att CD127high/CD62Llow delmängd är nästan helt frånvarande i MHC II–/– möss (Fig. 4a); de andra subpopulationerna är närvarande vid frekvenser som liknar dem i WT C57BL/6-möss. Dessa data visar att frånvaron av T-cellhjälp förhindrar effektiv generering av en T-celldelmängd med en effektorminnefenotyp, vilket verkar vara avgörande för Snabb in vivo-expansion och effektorfunktion.

eftersom viktiga mekanismer för CD4 + T-cellhjälp förmedlas genom interaktionen mellan CD40 och CD40L (24-26) undersökte vi om CD40L–/– möss visar en fenotyp som liknar den hos MHC II–/– möss. I enlighet med andra nyligen genomförda studier (27) visar CD40L–/– möss inga skillnader i bakteriell belastning eller bakteriell clearance efter primär Listeriainfektion (data visas inte) och har normala primära CD8+ T-cellsvar på en subletal dos av Lm (Fig. 4c). Men deras förmåga att snabbt rensa återinfektion med en högre dos av Lm (10 10 xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx) reduceras (Fig. 4B), korrelerar med nedsatt CD8 + – minne T-cellsvar (Fig. 4C) och en mycket reducerad CD127high/CD62Llow delmängd (Fig. 4 e och f) under den tidiga posteffektorfasen. Under reinfektion med Listeria är proliferation av svarande T– celler i CD40L–/ – möss ekvivalent med den hos cellpopulationer i WT-möss, vilket indikerar att fenotypen inte beror på en allmän defekt i den proliferativa kapaciteten hos minnes-T-celler (Fig. 4D) utan snarare till minskat antal minnes-T-celler som kan reagera omedelbart på antigenreencounter. Denna fenotyp demonstrerades genom in vivo-märkningsexperiment där BrdUrd införlivades under hela expansionsfasen (Fig. 4D) och genom in vivo BrdUrd pulsjaktstudier som övervakar förlusten av etikett på proliferation (data visas inte).

minskad generering av T-Cellundergrupper med en Effektorminnefenotyp tidigt efter Priming överförs till den sena minne-t-Cellpoolen. Våra data visar att i frånvaro av CD4+ T-celler eller CD40L reduceras CD127high/CD62Llow T-cellens delmängd avsevärt tidigt efter priming. Dessutom har vi (Fig. 4b) och andra (3-5) visade att nedsatt T-cellhjälp under T-cell priming leder till förändringar i kvaliteten på skyddande immunitet mot reinfektion med Lm eller lymfocytisk koriomeningitvirus. För att tydligare länka den observerade defekten i tidig generation av CD127high / CD62Llow T-celler med kvaliteten på efterföljande t-cellminne i dessa möss analyserade vi antigenspecifika t-cellpopulationer under minnesfasen (5 wk efter primär Listeriainfektion) mer detaljerat. Vid denna tidpunkt måste analys av antigenspecifika T-celler utföras på celler som härrör från olika vävnader på grund av deras distinkta migrationsbeteende. Förutom mjälten valde vi LN som en representativ vävnad för lymfoida organ och lungan som ett typiskt perifert, icke-lymphoidfack. Vid denna tidpunkt är de antigenspecifika T-cellerna i dessa organ nästan alla Cd127höga (Fig. 1B); cellerna i lungan är CD62Llow (data visas inte), medan de flesta antigenspecifika minnes-T-celler i LN är CD62Lhigh (Fig. 5b). För att bestämma antalet antigenspecifika minnes-T-celler med tydlig omedelbar effektorfunktion i de olika organen, utförde vi intracellulär cytokinfärgning för IFN-GHz. Såsom visas i Fig. 5A, CD40L – / – möss kännetecknas av väsentligt minskat antal antigenspecifika minnes – T-celler med omedelbar effektorfunktion jämfört med WT-möss. Detta resultat är sant på frekvensnivån (procent) inom CD8 + T-cellfacket och i absoluta tal (Fig. 5a). MHC-tetramerfärgning av LN-härledda lymfocyter (Fig. 5B) avslöjade nästan identiska antal antigenspecifika T-celler med en CD62Lhigh fenotyp. Vissa CD62Llow-antigenspecifika T-celler är också detekterbara i LNs av WT-möss, som korrelerar med frekvenserna hos IFN-tuberkulosproducerande celler (Fig. 5a). Denna population är i grunden frånvarande i LNS av CD40L–/– möss; hela CD8+/ CD62Llow delmängd reduceras i CD40L – / – möss, vilket tyder på en allmän defekt i genereringen av denna T-cell delmängd. Sammanfattningsvis visar våra data att frånvaron av CD40L-beroende CD4 + T-cellhjälp under primingperioden resulterar i kvantitativa skillnader i antigenspecifika CD8+ T-cellsubpopulationer, med kraftigt minskat antal celler som uppvisar en effektor minne fenotyp (CD127high/CD62Llow). Dessa kvantitativa skillnader i celler med omedelbar tidig effektorfunktion överförs till minnesfasen och påverkar kvaliteten på skyddande immunitet.