beredning av proteinkomponenter för rekonstituering

komponenter i översättningsapparaten för E. coli, inklusive översättningsfaktorer och aar, bereddes som tidigare beskrivna46. Beredning av rnasep-komponenter, M1 RNA och C5-protein framställdes också enligt tidigare beskrivning29. Vi modifierade protokollet för C5-proteinet genom att fälla ut det med 80% mättat ammoniumsulfat och lösa upp det genom dialysering mot buffert A (50 mM natriumacetat pH 6,5, 5 mM EDTA, 0,25 M NaCl och 7 mM 2-merkaptoetanol). Den resulterande fällningen utvanns genom centrifugering och löstes genom dialysering mot buffert B innefattande 50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM NH4Cl, 6 m urea och 10 mM ditiotreitol (DTT). Upplösta proteiner applicerades på en 5 mL HiTrap SP HP-kolonn (#17115101, GE Healthcare, USA), tvättades med buffert B innehållande 7 mM 2-merkaptoetanol som ersättning för 10 mM DTT och eluerades med en linjär gradient från 100 mM till 2 M NH4Cl i buffert B. fraktioner innehållande C5-protein analyserades med SDS-PAGE, återvanns, dialyserades mot buffert D (50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 0.8 m NH4Cl, 10 mM mgcl2, 2 m urea, 7 mm 2-MERKAPTOETANOL), dialyserades sedan ytterligare mot buffert d utan urea. Resulterande lösningar koncentrerades med användning av en Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) och dialyserades mot buffert D utan urea innehållande 50% glycerol. Det renade C5-proteinet lagrades vid -30 C. vi noterar att vi kan dela alla plasmider på begäran.

beredning av modifieringsenzymer för iVTtRNAs

Modifieringsenzymer för iVTtRNAs framställdes enligt följande. E. coli-gener av TsaB, TsaC, TsaD, tsae, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE och GidA förstärktes från E. coli A19 genom med användning av lämpliga primers (kompletterande Data 5). Förstärkta gener för TsaC, TsaD, TsaE, GlyA, MnmC, MnmE och GidA klonades till pET15b (#69661, Merck Millipore, USA) som små ubiquitinliknande modifieringsproteiner (SUMO) proteinfusionsproteiner där His-tag, SUMO protein och modifieringsenzymer tandemly arrangerade. Gener för tsab och TrmD klonades till pET15b som His-tag fusion protein. Alla gener klonades med Gibson-monteringsteknik (#e2611, New England Biolabs, USA). Resulterande plasmider transformerades till en E. coli BL21(DE3) stam och odlades i 1 L LB medium till en OD660 av 0,6–1,0 vid 37 kcal C. Överuttryck inducerades genom tillsats av IPTG till en slutlig koncentration av 1 mM för TsaB, TsaC, TsaD, TsaE och TrmD, eller 0,1 mM för GlyA, MnmC, MnmE och GidA. Efter 3 timmar av odling vid 37 c c skördades celler. Tsab, TsaC, TsaE, TrmD och MnmE-överuttryckta celler resuspenderades i 40 mL Lysbuffert (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2 och 7 mM 2-merkaptoetanol) och stördes av ultraljudsbehandling. Resulterande lysat centrifugerades och supernatanten utvanns och blandades med 5 mL komplett His-tag Reningsharts (#05893801001, Roche, Schweiz) för 1 h med rotator. Hartset tvättades med 100 mL Lysbuffert och sedan eluerades proteinet med 25 mL Elueringsbuffert (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, 400 mM imidazol och 7 mM 2-merkaptoetanol). Tsab och TrmD koncentrerades av Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) och dialyserades sedan mot Lagerbuffert (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6 500 mM KCl, 10 mM MgCl2, 7 mM 2-merkaptoetanol och 30% glycerol). De frystes snabbt med flytande kväve och lagrades vid -80 C. För tsac, TsaE och MnmE tillsattes Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, USA) till de återvunna fraktionerna till en slutlig koncentration av 23 CG/ml för att avlägsna det His-märkta SUMOPROTEINET. Fraktionerna dialyserades mot Klyvningsbuffert (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl och 7 mM 2-merkaptoetanol) över natten medan Klyvningsbufferten innehöll 500 mM KCl för mnme-beredning. De dialyserade proverna blandades igen med 5 mL komplett His-tag-Reningsharts med rotator. Därefter uppsamlades genomströmningsfraktionerna som innehåller modifieringsenzymer. Återvunna prover koncentrerades av Amicon Ultra 3 kDa för TsaE eller Amicon Ultra 10 kDa (#UFC901024, Merck Millipore, USA) för Tsac och MnmE. De dialyserades mot Lagerbuffert, flashfrystes med flytande kväve och lagrades vid -80 kcal C. För GlyA-beredning innehöll all buffert 10% Glycerol och de andra procedurerna var samma som mnme-beredning. TsaD befanns vara olöslig efter ultraljudsbehandling. Därför pelleterades proteinet genom centrifugering vid 20,400 xnumx xnumx till 4 xnumx xnumx till 4 xnumx till 4 xnumx till 4 xnumx till xnumx till xnumx till xnumx till xnumx till xnumx till xnumx till xnumx till xnumx till xnumx till xnumx till xnumx till xnumx till xnumx till xnumx. Suspensionen pelleterades igen genom centrifugering vid 20,400 xnumx xnumx kg för 45 min. Pelleten löstes med Lysbuffert kompletterad med 6 M urea. Det andra förfarandet var samma som mnme-beredning förutom att alla buffertar innehöll 2 m urea. För mnmc-beredning var alla steg tills borttagning av hans-märkta SUMOPROTEIN samma som GlyA-beredning. Eftersom mnmc icke-specifikt bunden till His-tag-reningshartset valdes reningen med anjonbyteskromatografi. Lösningen efter Ulp1-behandling dialyserades mot IEX-buffert (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 och 7 mM 2-merkaptoetanol) och sedan applicerades de på en 5 mL HiTrap Q HP-kolumn (#17115401, GE Healthcare, USA). Kolonnen tvättades med 25 mL IEX-buffert och sedan eluerades MnmC med en linergradient från 100 mM till 1 M KCl i IEX-buffert. Fraktioner innehållande MnmC koncentrerades av Amicon Ultra 30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, USA), dialyserades mot Lagerbuffert, flashfryst med flytande kväve och lagrades vid -80 kcal C. Vi noterar att vi kan dela alla plasmider på förfrågningar.

beredning av iVTtRNA

gener för varje iVTtRNA (kompletterande Data 1) klonades in i pgemex-1-vektorn (#P2211, Promega, USA) mellan xbai-och BamHI-restriktionsställen. Med hjälp av de resulterande plasmiderna som mallar förstärktes DNA-mallar för in vitro-transkription med användning av en T7-promotorprimer som framåtprimer och lämpliga omvända primrar för varje iVTtRNA (kompletterande Data 1). Varje omvänd primer innehöll en 2 ’- metoximodifiering vid den andra nukleotiden från 5’-terminalen för att förhindra malloberoende tillsats av en extra nukleotid28. Produkterna renades genom fenol/kloroform / isoamylalkohol (25:24:1) extraktion, följt av etanolutfällning och utfällningar löstes i vatten. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). RNAs p-komponenter sammansatta av C5-protein och M1 RNA tillsattes därefter till reaktionsblandningar vid 150 nM för avlägsnande av de 27 extra nukleotiderna, och reaktionerna inkuberades i 1 h vid 37 kcal C. transkriberade iVTtRNAs bearbetades sedan med sur fenol extraktion följt av kloroform/isoamylalkohol (10:1) extraktion, sedan rening genom anjonbyteskromatografi. Prover innehållande iVTtRNAs laddades på 10 mL HiTrap Q HP-kolumner (#17115401, GE Healthcare, USA) och tvättades med Q-buffert (20 mM HEPES-KOH pH 7.6 och 200 mM KCl). iVTtRNAs eluerades med en linjär gradient från 200 mM till 1 M KCl I Q-buffert. Fraktioner innehållande mål iVTtRNAs, bestäms av urea-PAGE, utvanns genom isopropanol utfällning, och utfällda iVTtRNAs löstes i vatten och lagras vid -80 CCB tills användning. Vi noterar att vi kan dela alla plasmider på förfrågningar.

modifiering av iVTtRNA

t6a37 modifiering utfördes i reaktionsblandningen innehållande 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mM pyridoxal-5′-fosfat, 1 mM Ser, 1 mM Gly, 36.4 µM SAM, 0.1 enhet/µL rekombinant RNase-hämmare (#2313 En, TaKaRa, Japan), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM MnmE, 2.5 µM MnmC, 6 A260-enhet/mL tRNAGluUUC eller tRNAGluCUC. Efter inkubation vid 37 kg C för 2 h för modifiering av t6a37 och m1g37 eller 4 h för modifiering av mnm5U34 bearbetades tRNA med sur fenol extraktion följt av kloroform/isoamylalkohol (10:1) extraktion och utvanns genom utfällning av isopropanol. Utfällda tRNA löstes i vatten och lagrades vid -80 C. För mnm5u34-modifiering utfördes reaktionen igen med återvunna tRNA. De bearbetades med sur fenol extraktion följt av kloroform / isoamylalkohol (10: 1) extraktion, avsaltad av Mikrospin G-25-kolumner (#27532501, GE Healthcare, USA) och återhämtades genom isopropanolutfällning. Utfällda tRNA löstes upp i vatten och lagrades vid -80 kcal C. För att kvantifiera modifieringseffektiviteten användes 57,1 kcal thr istället för 1 mM Thr och blandningen utan TsaD användes som kontroll för t6a37-modifiering. 36.4 oc S-adenosyl-metionin användes och blandningen utan TrmD användes som kontroll för M1G-modifiering och utan GidA användes som kontroll för mnm5u34-modifiering. Efter inkubation vid 37 C, alikvoter (10 CCL) drogs tillbaka och upptäcktes på Whatman 25 mm GF/C filterskivor (#1822-025, GE Healthcare, USA). Filterskivor tvättades två gånger med 10% TCA, sedan etanol, följt av mätning av radioaktivitet med en flytande scintillationsräknare. För kvantifiering av mnm5u-modifiering renades tRNA som ovan och sedan upptäcktes 0.02 a260-enheten på filterskivorna istället.

Aminoacylering

Aminoacyleringsexperiment utfördes enligt en tidigare rapport47. Reaktionsblandningar (10 occl) innehöll 100 mm HEPES-KOH pH 7,6, 15 mM MgCl2, 40 mM KCl, 1 mM DTT, 4 mM ATP, 1 enhet/occl rekombinant rnashämmare (#2313 A, TaKaRa, Japan), 50 nM eller 1,5 occlm aar motsvarande varje aminosyra, 20 occlm-aminosyra eller 68 occlm Asn för asparaginaminoacylering och 2 a260 enhet/mL tRNA. För mätning av metylering användes i stället en blandning av 0,6 met och 3,4 met kall L-metionin. Cys erhölls genom att reducera-cystin med 50 mM DTT vid 37 kcal C för 15 min. För mätning av cysteinylering var dtt-koncentrationen 5 mm. när inhemska tRNA-blandningar användes tillsattes 40 a260 enhet/mL tRNA-blandningar (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) istället. Efter inkubation vid 37 C i 30 minuter togs alikvoter (8 C) tillbaka och upptäcktes på Whatman 25 mm GF/C filterskivor (#1822-025, GE Healthcare, USA). Filterskivor tvättades två gånger med 10% TCA, sedan med etanol, följt av mätning av radioaktivitet med en flytande scintillationsräknare.

Oktapeptidsyntes med det rena systemet

DNA-mallar som kodar för oktapeptider förstärktes PCR-med lämpliga primrar (kompletterande Data 2) med pURE1-vektorn (#PUREV001, BioComber, Japan) innehållande en T7-promotorsekvens och ribosombindningsstället (Shine-Dalgarno-sekvens) som mall. Förstärkta DNA-mallar renades med användning av ett QIAquick PCR-reningssats (#28104, QIAGEN, Tyskland). Oktapeptidsyntesreaktioner innehöll 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM kaliumglutamat, 13 mM magnesiumacetat, 2 mM spermidin, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM UTP, 1 mM CTP, 20 mM kreatinfosfat, 10 oc/mL 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolsyra, 0,2 oc ribosom, 4 nM DNA-mall, proteinhaltiga rena systemkomponenter inklusive översättningsfaktorer och enzymer, aminosyror och tRNA. Koncentrationerna av proteinhaltiga rena systemkomponenter var som beskrivs i ett tidigare protokoll46. Vi noterar att alla 20 aaRSs inkluderades i detta experiment, oavsett DNA-mallar och testkodoner. Sammansättningen och koncentrationen av aminosyror, som beror på testkodonerna, listas i tilläggsdata 2. Sammansättningen av iVTtRNAs beror på mallen och reaktioner utfördes med användning av basala iVTtRNAs (kompletterande Data 2) i närvaro eller frånvaro av test iVTtRNAs (kompletterande Data 2). Koncentrationen av varje iVTtRNA fixerades till 6 kcal. m. När inhemska tRNA-blandningar användes tillsattes 56 a260 enhet/mL tRNA-blandningar (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) istället. Reaktioner utfördes för 60 min vid 37 CCB och alikvoter drogs tillbaka, spotted på Whatman 3 MM filterpapper (#1822-025, GE Healthcare, USA), kokt i 10% TCA vid 90 CCB för 30 min till deacylate aminoacyl-rna. Radioaktiviteten i den 10% TCA-olösliga fraktionen mättes med en flytande scintillationsräknare.

proteinsyntes med det rena systemet

proteinsyntesexperiment utfördes med ett PUREfrex 2.0-kit (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japan) utan tRNA-blandningar i lösning I (Buffertblandning). Vi har dessutom lagt till 0.2 oc-met, 4 nM PCR-amplifierad DNA-mall för DHFR – eller sfGFP-uttryck (kompletterande Data 3) och en specificerad mängd iVTtRNA-blandning eller nativ tRNA-blandning. Reaktionerna utfördes vid 30 eller 37 C i 12 timmar, och syntetiserade proteiner analyserades.

analys av syntetiserade proteiner

syntetiserad DHFR och sfGFP innehållande radioaktiv Met analyserades med 15% SDS-PAGE, och gelbilden visualiserades med användning av en bas-5000 bio-imaging analyzer (GE Healthcare, USA). Tidskursanalys av sfGFP-uttryck utfördes genom att mäta sfGFP-fluorescens var 3: e minut med hjälp av ett StepOne qRT-PCR-system (#4376373, Applied Biosystems, USA). Fluorescensbilder av syntetiserad sfGFP i reaktionsblandningar erhölls med användning av ett LAS – 4000-instrument (GE Healthcare, USA). Aktiviteten av syntetiserad DHFR mättes som beskrivits tidigare44. Reaktionsblandningar (2 mL) innehöll 50 mM MES-KOH pH 7,0, 25 mM TRIS-HCl pH 7,0, 25 mM etanolamin, 100 mM NaCl, 10 mM 2-merkaptoetanol, 0.1 mm EDTA, 100 kg dihydrofolsyra och en 10 kg alikvot av den rena reaktionsblandningen, och de inkuberades vid 37 kg i 15 minuter. Därefter tillsattes 20 mm NADPH till en slutlig koncentration av 200 oc, och minskningen av absorbansen vid 340 nm mättes under en period av 10 min med en v-550 spektrofotometer (Jasco, Japan). En enhet av DHFR definierades som den mängd enzym som krävs för att bearbeta 1 kg dihydrofolsyra i 1 min vid 37 kg C.

LC-MS-analys av syntetiserade proteiner

DHFR med FLAGGSEKVENS vid dess terminal (kompletterande Data 3) syntetiserades med en PUREfrex 2.0 kit (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japan) utan tRNA-blandningar i lösning I (Buffertblandning). Vi lade dessutom till 4 nM PCR-amplifierad DNA-mall för DHFR taggad med FLAGGSEKVENS vid dess C-terminal (kompletterande Data 3) och en specificerad mängd iVTtRNA-blandning eller nativ tRNA-blandning. Reaktionerna utfördes vid 30 C i 12 h. syntetiserad DHFR renades med Anti-flagga m2 magnetiska pärlor (#M8823, Sigma-Aldrich, USA). Alikvoter (55 occl) av reaktionsblandningarna blandades med 245 occl av FLAGGTVÄTTBUFFERTEN (50 mm Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM NaCl, 20 mM Mg(OAc)2), och ytterligare blandas med 30 occl pärlor för 1 h. pärlorna tvättades med 210 occl av flaggan tvätt buffert följt av tvättning med bufferten utan Mg(OAc)2 två gånger (210 occl och 180 occl). Därefter eluerades DHFR med 50 occl av FLAGGTVÄTTBUFFERTEN utan Mg (OAc) 2 men kompletterades med 100 occg/mL 3xflag-peptid (#F4799, Sigma-aldrich, USA) efter försiktigt blandning i 1 h. beredning av prover för LC-MS-analys utfördes enligt ett fasöverföringsytaktivt medel (PTS) – hjälpt protokoll48. 4 occyll av en tät PTS-buffert (100 mM natriumdeoxikolat, 100 mM natrium N-lauroylsarkosinat och 500 mM NH4HCO3) tillsattes till 40 occyl av de eluerade proverna. De reducerades med 10 mM TCEP vid 37 kg C under 30 min, alkylerades med 20 mM iodoacetamid vid 37 kg C under 30 min och släcktes med 20 mm Cys. Varje reaktionslösning delades upp i två delar. En digererades med 10 ng / ubicl Lys-C (#90051, Thermo Fisher Scientific, USA) och 10 ng/ubicl trypsin (#90057, Thermo Fisher Scientific, USA) vid 37 kcal C över natten. Den andra digererades med 10 ng / oc asp-n (#90053, Thermo Fisher Scientific, USA) vid 37 oc C över natten. Efter digestion tillsattes 10% trifluorättiksyra (TFA) till en slutlig koncentration av 1%, och reaktionslösningarna centrifugerades vid 15 000 kg i 5 minuter för att fälla ut tvättmedlen. Supernatanter avsaltades med hjälp av självberedda stegtips49 och torkades med SpeedVac. LC-MS-analys utfördes med användning av en Orbitrap – masspektrometer (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, USA) utrustad med en nanospray-jonkälla (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, USA) och ett nano-LC-system (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, USA). De torkade peptidblandningarna löstes i en lösning innehållande 5% acetonitril och 0,1% TFA, och varje prov applicerades på nano-LC-systemet. Peptider koncentrerades med användning av en fälla kolonn (#164535, 0.075 20 mm, 3 occolm, Acclaim PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, USA) och separeras sedan med en nano kapillärkolonn (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 oc, C18, Nikkyo Technos, Japan) med användning av två mobila faser A (0,1% myrsyra) och B (acetonitril och 0,1% myrsyra) med en gradient (5% B för 5 min, 5-45% B i 45 min, 45-90% B i 1 min och 90% B i 4 min) vid en flödeshastighet av 500 nL/min. Eluering elektrosprayades direkt (2,2 kV) till MS (positivt läge, skanningsområde 200-1500 m/z, 60 000 FWHM-Upplösning)50.