Abstrakt
HIV-1-transkription regleras av CDK9/cyklin T1, som, till skillnad från ett typiskt cellcykelberoende Kinas, regleras genom att associera med 7SK litet nukleärt ribonukleärt proteinkomplex (snRNP). Medan proteinkomponenterna i detta komplex är väl studerade, är mekanismen för den komplexa bildningen fortfarande inte fullständigt förstådd. Föreningen av CDK9 / cyklin T1 med 7SK snRNP regleras delvis av en reversibel CDK9-fosforylering. Här presenterar vi en omfattande översyn av kinaserna och fosfataserna som är involverade i CDK9-fosforylering och diskuterar deras roll i reglering av HIV-1-replikation och potential för att riktas mot läkemedelsutveckling. Vi föreslår en ny väg för HIV-1 transkriptionsreglering via CDK9 Ser-90 fosforylering av CDK2 och CDK9 Ser-175 defosforylering av proteinfosfatas-1.
1. Introduktion
fullständig utrotning av HIV-1-infektion kräver nya metoder för att inducera integrerat HIV-1-provirus som inte påverkas av befintliga antiretrovirala läkemedel och som återhämtar sig efter avslutad antiretroviral behandling . HIV-1-latens kan vara ett resultat av flera faktorer såsom brist på HIV-1-transkriptionsaktivatorprotein (Tat) eller cellulära transkriptionsaktivatorer, transkriptionsinterferens med cellulära promotorer, ogynnsam integrationsställe, epigenetik och sannolikt andra faktorer . Således är bättre förståelse av mekanismerna för HIV-1-transkriptionsaktivering viktigt för utformningen av nya terapier som syftar till induktion såväl som hämning av HIV-1-transkription. Här granskar vi kinaserna och fosfataserna som är involverade i aktiveringen av CDK9/cyklin T1 och diskuterar hur dessa enzymer potentiellt kan användas för att hämma eller aktivera HIV-1 för utveckling av framtida terapeutiska ingrepp för behandling av HIV-1-infektioner.
2. Aktivering av HIV – 1-transkription av P-TEFb
HIV-1-transkription aktiveras av HIV-1 Tat-protein som binder till utbuktningen av tjär-RNA, en hårnålslingstruktur belägen vid 5′-änden av alla framväxande HIV-1-transkript och rekryterar CDK9/cyklin T1, en komponent av positiv transkriptionsförlängningsfaktor b (P-TEFb) till HIV-1-promotorn (granskas i detalj i ; se även illustration i Figur 1). Under transkriptionsinitieringen upprepades tfiih-associerad CDK7/cyklin h-fosforylater Ser-5 inom 1YSPTSPS7 heptapeptidsekvens 52 gånger i C-terminaldomänen (CTD) av RNAPII . Ser – 5-fosforylerad rnapii ackumuleras vid 20-40 nukleotider (nt) nedströms transkriptionsstartplatsen, delvis på grund av åtgärderna hos det negativa verkande förlängningsfaktorkomplexet, NELF och DRB-känslighetsinducerande komplexet, DSIF . Nyligen visade sig tfiih-associerad CDK7 fosforylera även CTD Ser-7-rester, vilket kan Primera ser-2-fosforylering med P-TEFb . Rekrytering av P-TEFb till HIV-1-promotorn belägen inom U3-R-U5-regionen i 5′ LTR underlättas av Tat som riktar sig mot CDK9/cyklin T1 till tjär-RNA där cyklin T1 binder till den g-rika slingan av tjär-RNA . Rekrytering av CDK9 / cyklin T1 främjar transkriptionsförlängning med RNA-polymeras II (RNAPII) som annars pausas efter syntesen av tjär-RNA . Frisättning av RNAPII från pausen av p-TEFb-komplexet åtföljs av mRNA-tak och förlust av NELF . P-TEFb utlöser förlängning av RNA-polymeras II (rnapii) transkription genom att fosforylera den negativa förlängningsfaktorn (NELF) och DRB-känslighetsinducerande komplexet (DSIF/Spt4/Spt5), vilket främjar frisättningen av NELF och även fosforylerande Ser-2-rester i RNAPII CTD (granskad i). Vid dissociationen av NELF blir DSIF en positiv förlängningsfaktor och ökade processiviteten RNAPII . Även om P-TEFb färdas med förlängningskomplexet krävs inte längre dess CTD-kinasaktivitet när komplexet frigörs från pausen .
Schematisk representation av HIV-1-transkriptionsregleringen genom CDK9-fosforylering och defosforylering. Figuren visar ett nätverk av TAT-interagerande värdcellsfaktorer som påverkar CDK9-fosforylering. Pilar indikerar fosforylering (violett), defosforylering (orange) och övergång av komplexa P-TEF-och transkriptionskomplex (svart). CDK2 fosforylater CDK9 Ser-90. Järnkelatorer minskar cellaktiviteten hos CDK2 / cyklin E och hämmar HIV-1-transkription (indikerad med röd linje). CDK7 fosforylerar CDK9 Thr-186. Defosforylering av Thr-186 med PPM1A eller PP1 underlättar dissociation av CDK9/cyklin T1 från stort P-TEFb-komplex och rekrytering av CDK9/cyklin T1 med Tat eller BRD4. BRD4 binder företrädesvis Ser-175-fosforylerad CDK9. Defosforylering av Ser-175 med PP1 aktiverar CDK9-kinasaktivitet och aktiverar HIV-1-transkription. Rekrytering av CDK9 / cyklin T1 med Tat till tjär-RNA leder till fosforylering av NELF som dissocierar och även fosforylering av dsif-och RNAPII CTD Ser-2-rester, vilket underlättas av CTD ser-7-fosforylering. CDK7 som en del av tfiih fosforylater CTD Ser-5 och eventuellt Ser-7 rester. CDK7 fosforylerar också CDK9 Thr-186 och upprätthåller CDK9 Thr-186 fosforylering under förlängningen av transkription.
på grund av vikten av P-TEFb måste reglering bibehållas för att säkerställa korrekt funktion. Fosforylering och defosforylering av specifika ställen på CDK9 måste ske under hela transkriptionsprocessen och måste kontrolleras tätt. Denna översyn fokuserar på reglering av CDK9 genom fosforyleringsändringar.
3. Sammansättning av P-TEFb och dess roll i HIV-1 Transkriptionsaktivering
P-TEFb är en heterodimer bestående av cyklinberoende Kinas 9 (CDK9) och en av C-typcyklinerna T1, T2a eller T2b, varav cyklin T1 är den vanligaste partnern . Cyklin K som ursprungligen ansågs vara en mindre cyklin av CDK9 erkänns nu vara en cyklinpartner för CDK12 och CDK13 . Endast cyklin T1-protein bildar effektivt ett komplex med HIV-1 Tat bundet till tjär-RNA . Detta beror på närvaron av en cysteinrest i cyklin T1 vid position 261 snarare än en asparagin som finns i cyklin T2A-och T2b-proteiner. Cyklin T1 med muterad Cys-261 binder till Tat men kan inte rekrytera Tat till tjär-RNA. Interaktion av Tat med tjär-RNA och cyklin T1 är beroende av zinkjoner som återigen kräver närvaron av Cys-261 .
det finns två funktionella isoformer av CDK9: en 42 kDa-form som huvudsakligen uttrycks i mjälte, tymus och testis och en 55 kDa-form som uttrycks i olika vävnader men vid signifikant lägre nivåer som är 42 Kd-isoformen . Alla cykliner associerar med båda isoformerna av CDK9 och uppvisar kinasaktivitet mot CTD i RNAPII . Ungefär hälften av P-TEFb är i ett inaktivt stort komplex bundet av 7SK snRNA och flera ytterligare proteiner inklusive hexametylenbisacetamid-inducerbart protein 1 (HEXIM1) , La-relaterat LARP7-protein och metylfosfatas som täcker enzymet MePCE . Den lägre molekylviktformen av P-TEFb består av CDK9 och cyklin T1 och är enzymatiskt aktiv . P-TEFb med hög molekylvikt är inaktiv på grund av HEXIM1 som introducerar sin hämmande PYNT-sekvens i det aktiva stället för CDK9 .
p-tefb-komplexet med hög molekylvikt fungerar som en källa till CDK9/cyklin T1 för rekrytering av HIV-1 Tat . I stressinducerade celler dissocierar CDK9/cyklin T1-komplexet från 7 SK RNA/HEXIM1-proteinet och binder sedan BRD4 och bildar ett transkriptionellt aktivt litet komplex som rekryteras till olika cellulära promotorer . Trots inaktiviteten hos stort P-TEFb-komplex in vitro är det stora komplexet, och inte det lilla komplexet, viktigt för aktiveringen av HIV-1-transkription som HIV-1. Tat konkurrerar med HEXIM1 för bindning till cyklin T1 som främjar dissociation av P-TEFb från det stora komplexet . HIV – 1 tat-protein visade sig också rekrytera stort P-TEFb-komplex till HIV-1-promotor där TAR RNA kunde förskjuta 7 SK RNA och aktivera P-TEFb .
Tat underlättar också bildandet av superförlängningskomplex (SEC) innehållande aktiv P-TEFb och ytterligare förlängningsfaktorer och transkriptionskoaktivatorer . Dessa faktorer inkluderar AFF4, enl, AF9 och förlängningsfaktor ELL2 . AFF4-proteinet framträder som det centrala ställningen som rekryterar andra faktorer genom direkta interaktioner. AFF4 binder cyklin T1, ELL2 och enl eller AF9 som fungerar som en bro som länkar detta komplex till P-TEFb . Genom överbryggande funktioner Tat och AFF4, p-TEFb och ELL2 kombineras för att bilda en bifunktionell töjning komplex som kraftigt aktiverar HIV-1 transkription . Utan Tat kan AFF4 förmedla ell2-P-TEFb-interaktionen, om än ineffektivt. Tat övervinner denna begränsning genom att föra mer ELL2 till P-TEFb och stabilisera ELL2 i en process som kräver aktiv P-TEFb .
4. CDK9 fosforylering
aktiviteten hos P-TEFb är beroende av fosforylering av flera serin-och treoninrester och vi kommer att diskutera detta nedan och som visas i CDK9/cyklin T1/Tat-modellen i Figur 2.
4.1. C-Terminal CDK9 fosforylering
ett kluster av CDK9S C-terminala rester (Ser-347, Ser-353 och Ser-357; Thr-350 och Thr-354) är autofosforylerad och denna fosforylering är viktig för bindningen av CDK9/cyklin T1 till tjär-RNA . Detta bevisades av oförmågan hos enzymatiskt aktiv C-terminalt trunkerad CDK9 att binda tjär-RNA . Rekombinant CDK9 / cyklin T1 som autofosforylerades in vitro defosforylerades effektivt med proteinfosforylering 2A (PP2A) men inte proteinfosfatas-1 (PP1) . Även behandling med PP2A förhindrade bindningen av CDK9/cyklin T1 till Tat och TAR RNA in vitro . Dessa observationer föreslog att PP2A kan rikta sig mot C-terminalen för CDK9 och potentiellt kontrollera interaktionen mellan P-TEFb och tjär-RNA. Autofosforylering av CDK9 associerad med preinitieringskomplexet in vitro hämmades av TFIIH . PP2A visade sig senare vara avgörande för basal HIV-1-transkription in vitro, eftersom PP2A-utarmning hämmade basal HIV-1-transkription och tillägget av PP2A till de utarmade extrakten återställde transkriptionen . PP2A-målet ansågs vara Thr-29 (se nedan), men detta bevisades inte med säkerhet och effekten reproducerades inte in vivo. I en tidig studie observerade vi en mild induktion av basal men inte Tat-inducerad HIV-1-transkription av PP2A-hämmande låga koncentrationer av okadainsyra . Vi observerade också induktion av basal och inte den Tat-aktiverade HIV-1-transkriptionen med överuttryck av LIS1-protein som vi fann att binda och hämma PP2A in vitro och interagera med HIV-1 Tat-protein . Sammantaget indikerar dessa studier att PP2A kan reglera basal HIV-1-transkription och även kontrollera interaktionen mellan P-TEFb och tjär-RNA genom defosforylering av C-terminalen för CDK9.
4.2. N-Terminal thr-29 fosforylering
fosforylering av CDK9: s Thr-29 visade sig induceras av HTLV-1 Skatteprotein . CDK9 / cyklin T1 rekryteras till kromatiniserad HIV-1 LTR och andra promotorer av BRD4 . Denna BRD4-rekrytering var kopplad till fosforylering av CDK9 Thr-29 och kravet på PP2A-defosforylering av John Bradys grupp . Qiang Zhous grupp rapporterade emellertid att CDK9 behövs fosforyleras på Ser-175 för att binda till BRD4 , vilket nyligen bekräftades av Jonathan Karns grupp (se detaljerad diskussion nedan). CDK9S Thr-29 är homolog med Thr-15 på CDK2, där fosforylering hämmar CDK2-aktivitet . Faktum är att fosforylering av Thr-29 visade sig hämma CDK9-aktivitet och HIV-1-transkription . Vi misslyckades emellertid med att detektera CDK9 thr-29 fosforylering i celler behandlade med okadainsyra som hämmade både PP2A och PP1 med användning av en kombination av Hunter 2D-tunnskiktselektrofores och högupplöst masspektrometri som endast visade fosforylering av C-terminal Ser/Thr-kluster och Ser-175 varav endast ser-175 fosforylering inducerades av okadainsyra . Således kan CDK9 thr-29-fosforylering inte kontrolleras av PP2A och måste valideras ytterligare för att klargöra dess roll under HIV-1-transkription.
4.3. CDK9S t-Loop thr-186 fosforylering
CDK9 t-slinga innehåller flera fosforyleringsställen, inklusive Ser-175 och Thr-186 (Figur 2). Fosforylering av den konserverade Thr-186 är nödvändig för den enzymatiska aktiviteten hos CDK9 . Även föreningen av CDK9 / cyklin T1 med 7SK RNA snRNP kräver CDK9S thr-186 fosforylering . I CDK: er utlöser fosforylering av T-slingan stora konformationsförändringar som öppnar ATP-bindningsfickan och ett substratbindningsställe som gör CDK: er fullt aktiva som ett Kinas .
nyligen visade kemisk-genetisk analys med selektiv kemisk hämning av CDK7 att den är ensam ansvarig för CDK9 thr-186 fosforylering och för P-TEFb-beroende CTD Ser-2 fosforylering och histon H2B ubiquitylation in vivo . Således fungerar CDK7/cyklin H som tidigare identifierades som CDK-aktiverande Kinas (CAK) för CDK som är involverade i cellcykeln såsom CDK1, 2 och 4 också som CAK för CDK som är involverade i reglering av transkription som inkluderar CDK8, 9, 12 och 13 (granskad i ). Global analys av kinaser som kan fosforylera CDK9 T-loop med användning av siRNA identifierade Ca(2+)/kalmodulinberoende Kinas 1D (CaMK1D) slå ner genom siRNA minskad thr-186 fosforylering . Följaktligen minskade liten molekylhämning av ca (2+) signalväg thr-186 fosforylering och inhiberade TAT-inducerad HIV-1-transkription men inte Skattemedierad HTLV-1-transkription . Eftersom Skattemedierad transkription drivs av P-TEFb, återstår det att undersökas ytterligare varför endast HIV-1-transkription påverkades.
CDK9 thr-186 fosforylering kan också styras av cellulära fosfataser. Våra studier under det senaste decenniet fokuserade på PP1 som vi ursprungligen observerade för att stimulera TAT-beroende HIV-1 transkription in vitro . När vi överuttryckte en av de viktigaste nukleära regleringsunderenheterna av PP1, NIPP1 (kärnhämmare av PP1), observerade vi PP1-specifik hämning av HIV-1-transkription och viral replikation . Vi märkte att Tat innehåller en sekvens som liknar ett konserverat PP1-bindande RVxF-motiv och visade att detta motiv förmedlar tat-bindning till PP1 in vitro och in vivo och att mutation av rester i PP1-bindningsmotivet (V36A och F38A) hindrade Tat från att inducera HIV-1-transkription . CDK9 som fosforylerades i odlade celler spikade med (32P)ortofosfat och behandlades med okadainsyra defofosforylerades effektivt in vitro av PP1 men inte PP2A i motsats till in vitro autofosforylerad CDK9 som defosforylerades av PP2A och inte av PP1 . Dessa resultat antydde att PP1 kan kontrollera CDK9-fosforylering under HIV-1-transkription. Faktum är att den alfa-katalytiska subenheten av PP1, PP1a, visade sig fungera kooperativt och sekventiellt med (Ca2+)-kalmodulin-proteinfosfatas 2b (PP2B) i UV-bestrålade eller hexametylenbisacetamid (HMBA)-behandlade celler i vilka P-TEFb frigörs från 7SK snRNP-komplex . Medan PP2B inducerar en konformationsförändring i 7SK snRNP, defosforylerar PP1A CDK9 Thr-186 och underlättar utsläpp av P-TEFb från 7SK snRNP . CDK9 förblev defosforylerad medan den var associerad med BRD4 och rekryterades till preinitieringskomplexet, där det kan återaktiveras av TFIIH-associerad CDK7. I enlighet med denna studie observerade vi ökad CDK9 Thr-186 fosforylering i cellerna som stabilt uttryckte en PP1-hämmande peptid, den centrala domänen för NIPP1, och observerade också ökad association av CDK9/cyklin T1 med 7SK RNA . Stabilt uttryck av cdNIPP1 störde interaktionen mellan Tat och PP1 och hämmade HIV-1-transkription , vilket tyder på att en balans måste upprätthållas mellan fosforylering och defosforylering av CDK9 Thr-186 och att skiftning av denna balans mot fosforyleringen är hämmande för HIV-1-transkription. Uttryck av cdNIPP1 på ett fysiologiskt relevant sätt som en del av HIV-1-genomet i stället för nef hämmade kraftigt HIV-1-replikation , vilket ytterligare antyder att PP1-riktade hämmare kan användas som potentiella anti-HIV-1-terapier. Medan PP1 är en kandidat för thr-186 defosforylering, fann vi också att det defosforylerar CDK9 Ser-175 (se nedan). Ett ytterligare CDK9 thr-186-fosfatas, magnesiumberoende proteinfosfatas 1a (tidigare 2C) (PPM1A) identifierades med användning av ett fosfatasuttrycksbibliotek och thr-186-fosfospecifika antikroppar . PPM1A-överuttryck minskade thr-186-fosforylering och siRNA-medierad utarmning ökade den, och P-TEFb och PPM1A coprecipitated också tillsammans vilket tyder på att CDK9 kan vara ett fysiologiskt substrat för PPM1A . En nyare studie visade att CDK9S thr-186-fosforylering minskas i vilande CD4(+) T-celler som inte är tillåtna för HIV-1-replikation och att denna minskning korrelerade med överflödet av PPM1A och begränsad rekrytering av CDK9 till det stora P-TEFb-komplexet . Detta fynd stöder vidare nödvändigheten av det stora komplexet för HIV-1-transkription och den kritiska rollen för PPM1A i HIV-1-undertryckandet i vilande T-celler. Eftersom ppm1a-uttryck inte ändrades vid aktivering av T-celler kan ännu okända regleringsfaktorer vara involverade i regleringen av ppm1a-aktiviteten.
4.4. CDK9S t-Loop Ser-175 fosforylering
När CDK9/cyklin T1 dissocierar från det stora P-TEFb-komplexet kan CDK9 fosforyleras på Ser-175. Medan thr-186 defosforylering helt inhiberade CDK9/cyklin T1-kinasaktivitet hittades ingen skillnad i kinasaktiviteterna hos CDK9 S175A och CDK9 S175D-mutanter av David Price och kollegor . Däremot visade Qiang Zhou och hans grupp att CDK9 s175a mutant var inaktiv, medan CDK9 S175D mutant var aktiv som Kinas . De visade också att ser-175 fosforylering främjar bindning av CDK9/cyklin T1 till Brd4 . Det föreslogs att fosforylering av Ser-175 kan orsaka en konformationsförändring i CDK9, vilket gör att BRD4 kan binda till cyklin T1 . I vår senaste studie fann vi att dynamisk hämning av PP1 ledde till exklusiv fosforylering av CDK9 Ser-175 som bestäms av en kombination av Hunter 2D-peptidkartläggning och LC-MS-analys in vivo . Hämning av PP1 ledde till hämning av CDK9-aktivitet och minskning av rnapii-fosforylering in vitro och in vivo . Vi fann att CDK9 s175a mutant var enzymatiskt aktiv och inducerad HIV-1 transkription . Intressant, medan CDK9 s175d mutant var mindre aktiv som Kinas, bildade den lättare litet P-TEFb-komplex, särskilt när PP1 hämmades. Således drog vi slutsatsen att PP1 aktiverar HIV-1-transkription genom defosforylering av CDK9 Ser-175-Rest. Vi märkte också att ser-175 fosforyleringsaktivitet var mycket rikligare än Thr-186-aktivitet i cellextrakt vilket tyder på att CDK9-aktivitet kan undertryckas naturligt genom överfosforylering av Ser-175. En ny studie av Jonathan Karns grupp visade att aktivering av T-celler genom t-cellreceptor (TCR) eller phorbol ester (PMA) som signalerar starkt inducerad fosforylering av CDK9 Ser-175 . Baserat på molekylär modellering föreslog de att fosforylerad Ser-175 bildar en vätebindning med Tat Lys-14 som förstärker bindningen av TAT till CDK9/cyklin T1 och främjar HIV-1 transkriptionsaktivering . Även i enlighet med de tidiga observationerna befanns CDK9 S175A-mutation avskaffa bindningen till BRD4 . Också, i enlighet med våra observationer, cdk9 s175a mutant befanns kraftigt inducera Tat-beroende latent HIV-1 reaktivering, som Jonathan Karn och hans medarbetare tillskrivs oförmågan hos denna mutant att binda BRD4 samtidigt som de kan binda till tat . De fann också att CDK9 fosforylerad vid Ser-175 är utesluten från 7SK RNP-komplexet , vilket är parallellt med vår tidigare observation att CDK9 s175d fosfomimetisk mutant hittades i litet P-TEFb-komplex . Således pekar den senaste studien på Ser-175 som ett viktigt mål för HIV-1-reaktivering och potentiell utveckling av småmolekylära terapier.
Vi utvecklade nyligen PP1-riktade små molekyler som modellerades för att passa rvxf-tillmötesgående hålighet på PP1 . Vi screenade praktiskt taget cirka 300 000 föreningar och screenade sedan fysiskt cirka 1000 föreningar och identifierade en träffförening, 1H4, som hämmade HIV-1-transkription och replikering vid icke-cytotoxiska koncentrationer . 1H4 förhindrade PP1-medierad defosforylering av en substratpeptid innehållande en rvxf-sekvens in vitro, störde föreningen av PP1 med Tat i odlade celler och förhindrade translokationen av PP1 till kärnan . Vi håller för närvarande på att förfina hitföreningen och även utveckla PP1-riktade föreningar för aktivering av latent provirus.
4,5. CDK9S ser-90-fosforylering
Vi och andra har tidigare visat att HIV-1-transkription aktiveras av Tat i G1-fasen, men inte i G2-fasen . Således antog vi att Tat kan engagera ett cellcykelreglerande Kinas, vilket vi visade vara CDK2/cyklin E . HIV-1 hämmas i CDK2-knockdown-cellerna och även i makrofager differentiering från inducerade pluripotenta stamceller med CDK2-knockdown , vilket ytterligare antyder att CDK2 är viktigt för HIV-1-transkription och replikering. Den funktionella länken mellan CDK2 och CDK9 hittades när vi analyserade hämning av HIV-1 av järnkelatorer. HIV – 1-transkription hämmades i T-celler behandlade med järnkelatorer 311 och ICL670 som också hämmade den cellulära aktiviteten hos CDK2 och CDK9 . Mer potenta di-2-pyridylketontiosemikarbazonbaserade tridentatjärnkelatorer hämmade HIV-1-transkription och virusreplikation vid mycket lägre koncentrationer än 311 eller ILC670 och inhiberade också CDK2-och CDK9-aktivitet . Medan mekanismen för CDK2-hämning ännu inte klargörs, kommer det sannolikt att inkludera induktion av p21 genom uppreglering av hypoxi-inducerad faktor 1 (HIF-1) eftersom järnutarmning avlägsnar järn från prolyl-hydroxylas och ökar HIF-1-och HIF-2-proteinnivåerna som efterliknar effekten av hypoxi . Vi analyserade CDK9 fosforylering av CDK2 in vitro och identifierade ett motiv (90SPYNR94) som representerade en konsensus CDK2 fosforyleringsställe och som effektivt fosforylerades . Fosforylering av CDK9 på Ser-90 detekterades med fosfospecifika antikroppar och den reducerades efter knockdown av CDK2. CDK9 s90a mutant association med det stora P-TEFb-komplexet reducerades och dess överuttryck hämmade HIV-1-transkription. Däremot visade CDK9 s90d-mutant oförändrad association med stora och små P-TEFb-komplex och inducerad TAT-beroende HIV-1-transkription. Den fosfomimetiska S90 visade emellertid en total minskning av CDK9-uttryck vilket tyder på att en fosforylering/defosforyleringsbalans måste upprätthållas för att bilda de stora och små P-TEFb-komplexen. Molekylär modellering visade att ser-90 av CDK9 var belägen på en flexibel slinga utsatt för lösningsmedel, vilket tyder på att den kan genomgå fosforylering (ses också på Figur 2). Således identifierade våra senaste studier en ny reglerande fosforyleringsplats på CDK9 som kan riktas mot aktivering eller hämning av HIV-1-transkription.
5. Slutsats
fosforylering och defosforylering av specifika ställen på CDK9 sker under hela transkriptionsprocessen och måste kontrolleras tätt. Modifieringar vid vissa treonin / serinrester bestämmer om CDK9 associerar med stort P-TEFb-komplex för att bli tillgängligt för rekrytering och om dissociationen av det stora komplexet effektivt kommer att inträffa. Fosforylering av Thr-186 i T-slingan av CDK9 och Ser-90 som ligger utanför t-slingan bestämmer om CDK9 förblir sekvestrerad i det inaktiva stora komplexet och även om kinaset är enzymatiskt aktivt när det är dissocierat från 7SK snRNP. Defosforylering vid någon av dessa platser leder till destabilisering av det stora komplexet och frisättning av CDK9/cyklin T1, vilket begränsar tat-rekrytering till HIV-1 LTR. Modifieringar i CDK9S C-terminal möjliggör cyklin T1: TJÄRBINDNING och defosforylering vid dessa ställen förhindrar bindning av toTAR-RNA. Däremot hämmar fosforylering vid thr-29 eller Ser-175-rester CDK9. Således verkar den framväxande bilden av CDK9-reglering genom fosforylering vara komplex och delvis parallell med vad som är känt för andra CDK. De nyligen identifierade CDK9-riktade kinaserna, CDK7, CDK2 och fosfataser, PP1 och PPM1A kommer sannolikt att dyka upp som nya mål för anti-HIV-1 och cancerterapi.
intressekonflikt
författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av detta dokument.
bekräftelser
detta projekt stöddes av District Of Columbia Developmental Center for AIDS Research (P30AI087714), RCMI-NIH 2g12rr003048 från Research Centers in Minority Institutions (Rcmi) Program (avdelningen för forskningsinfrastruktur, National Center for Research Resources, NIH), ryska Stiftelsen för grundforskning (nr 12-04-91444-NIZ) och ryska ministeriet för utbildning och vetenskap (nr. 2012-1. 5-12-000-1001-030). Författarna vill också tacka medlemmarna i Nekhai lab för förslag och be om ursäkt för dem vars arbete inte citerades på grund av brist på utrymme.
