fallstudie: upptäcka hämmare av spänningsstyrda natriumkanaler

som ett sätt att illustrera frågorna relaterade till jonkanaldrogupptäckt som beskrivs ovan kommer resten av denna artikel att beskriva en fallstudie med fokus på identifiering av spänningsstyrda natriumkanalhämmare för att behandla kronisk neuropatisk smärta. Behandling av smärta är en allvarlig medicinsk fråga och det finns en stor insats inom läkemedelsindustrin för att utveckla nya terapier för detta tillstånd. I synnerhet är behandlingen av neuropatisk smärta, definierad som” kronisk smärta som är resultatet av en primär lesion eller dysfunktion i det perifera nervsystemet ” av International Association for the Study of Pain (IASP), fortfarande ett stort ouppfyllt medicinskt behov.

det är uppenbart att spänningsstyrda natriumkanaler (Nav1) spelar en nyckelroll i uppkomsten och utbredningen av sensoriska nervverkningspotentialer som är nödvändiga för smärtsignalering. Lokala tillämpningar av nonsubtype-selektiva natriumkanalblockerare, såsom novokain, ger fullständig smärtlindring genom ledningsblock. Detta tillvägagångssätt för smärtlindring är dock begränsat till mycket få tillämpningar, såsom tandprocedurer, eftersom natriumkanaler också är avgörande för ledning i hjärtat, CNS, skelettmuskulaturen och icke-smittsamma sensoriska neuroner. Nav1 super-familjen består av 10 medlemmar (Yu och Catterall, 2004). Sju av dessa subtyper, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8 och Nav1.9, finns i det perifera nervsystemet (PNS). Av dessa uttrycks Nav1.7, Nav1.8 och Nav1.9 huvudsakligen i nociceptiva neuroner och Nav1.3 är övervägande embryonalt, men är uppreglerat hos vuxna PNS efter skada. Detta begränsade uttrycksmönster gör dessa subtyper attraktiva mål för utveckling av nya smärtstillande medel. Men deras relativa bidrag till smärtsignalering, och specifikt till neuropatisk smärtsignalering, är oklart och kan variera med olika etiologier och sensoriska kvaliteter av smärta.

i frånvaro av molekylär selektivitet för en Nav1–subtyp är det möjligt att specifikt rikta Nav1-kanaler i ett givet konformationstillstånd samtidigt som natriumkanalberoende impulsledning bevaras. Denna typ av tillståndsberoende hämning är grunden för det terapeutiska fönstret som ses med natriumkanalblockerande antikonvulsiva medel och antiarytmika, såsom lamotrigin och lidokain. Dessa läkemedel har högre affinitet för kanaler i öppna och / eller inaktiverade tillstånd än för vilande, stängda kanaler. Denna inhiberingsmekanism gynnar bindning vid snabb bränning eller delvis depolariserad vävnad. Neuropatisk smärta bör vara känslig för denna hämmande mekanism, eftersom det tros uppstå från skadeinducerade områden av depolariseringar, en hypotes som stöds av den kliniska effekten av lidokain administrerat systemiskt vid subanestetiska doser. Dessutom kan icke-subtype-selektivt, tillståndsberoende block ge den största effekten, eftersom individuell knockout av Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8 eller Nav1.9 gav inte övertygande bevis för en dominerande roll för någon av dessa kanaler i neuropatisk smärtsignalering.

baserat på denna motivering fattades ett beslut att initialt driva icke-subtypsselektiva, tillståndsberoende Nav1-hämmare, samtidigt som molekylär selektivitet övervakas genom att testa föreningar av intresse på Nav1.7, Nav1.5 (den primära hjärtnatriumkanalen) och Nav1.8 parallellt.

en membranpotentialbaserad analys användes för att screena 200 000 föreningar av 200 000 xnumx xnumx på Nav1.8 stabilt uttryckt i en rekombinant cellinje. Denna HTS-analys baserades på fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) mellan två medlemmar av ett membranpotentialkänsligt färgämnespar utvecklat av Aurora Biosciences (Priest et al., 2004). Nav1. 8-kanaler förinkuberades med testförening och den kemiska agonisten deltametrin i frånvaro av extracellulärt natrium. Efterföljande tillsats av natrium resulterade i membrandepolarisering och Nav1-block kvantifierades som interferens med den cellulära depolariseringsprocessen.

Även om startskärmen på Nav1.8 gav en mängd träffar, endast en enda förening ansågs vara en livskraftig ledning för läkemedelskemiinsatser. Innan man begick resurser till denna ledning undersöktes föreningen, en disubstituerad succinimid benämnd BPBTS (N-{ metyl }-N’-(2,2′-bithien-5-yl metyl)succinimid) i detalj med manuell helcellsspänningsklämma. BPBTS befanns hämma alla Nav1-subtyper med liknande styrka, och hämning var beroende av membranpotential och stimuleringsfrekvens. Denna hämmande mekanism överensstämde med föreningens högre affinitet för kanaler i öppet och inaktiverat tillstånd jämfört med kanaler i vilotillstånd. Dessutom var BPBTS två storleksordningar mer potenta än de kliniskt använda antikonvulsiva och antiarytmiska Nav1-blockerarna, vilket inhiberade det inaktiverade tillståndet Nav1.8, Nav1.7, Nav1.5 och Nav1.2, Med Ki-värden på 0,09, 0,15, 0,08 och 0,14 occurm och vilotillståndet Med Kr-värden på 1,5, 1,3, 0,3 respektive 1,2 occurm (Priest et al., 2004).

som sådan var BPBTS en attraktiv ledning för medicinsk kemi; dess huvudsakliga skulder är en dålig farmakokinetisk profil. Under loppet av profilerande analoger av BPBT, såväl som publicerade Nav1–hämmare, med användning av membranpotentialbaserad fluorescerande screeninganalys, strukturbaserade avvikelser mellan potenser bestämda i fluorescerande analys och genom elektrofysiologi noterades för några föreningar. Dessa avvikelser spårades till en interaktion mellan dessa föreningar och agonisten veratridin som användes för att öppna Nav1.7-kanaler. Därefter modifierades den fluorescerande analysen så att Nav1-kanaler preinkuberades med testförening i fysiologiska extracellulära natriumkoncentrationer och Nav1-beroende depolarisering initierades genom agonisttillsats (Fig. 1). Kanalhämmande förmågor uppmätta i denna modifierade analys korrelerade mycket bra med den inaktiverade tillståndshämningen bestämd av elektrofysiologi över många strukturella klasser av Nav1-hämmare (Felix et al., 2004; Liu et al., 2006).

även om analoger av BPBT inte överträffade den initiala ledningen i styrka lyckades läkemedelskemi förbättra den farmakokinetiska profilen och så småningom generera trans-N-{metyl }-N-metyl-n’-cyklopentan-1,2-dikarboxamid (CDA54) med 44% oral biotillgänglighet, en timmes halveringstid och en clearance på 14 ml/min/kg, som profilerades i stor utsträckning in vivo (Brochu et al., 2006). I två råttmodeller av neuropatisk smärta minskade CDA54 (10 mg/kg, givet Oralt) signifikant nervskadeinducerad beteendeöverkänslighet med 44-67%. Samma dos / plasmakoncentration av CDA54 påverkade inte akut nociception (råttvärmeplattaanalys), motorisk koordination (råttrotorodanalys) eller hjärtledning (elektrofysiologiska parametrar uppmätta i kardiovaskulär hund). Dessa egenskaper står i kontrast till de nuvarande natriumkanalblockerare som används i kliniken, vilket orsakar nedsatt motorisk koordination hos råttor och CNS-biverkningar hos människa vid alla effektiva doser. Intressant, vid oral dosering var förhållandet mellan hjärnan och plasma för CDA54 0,03. Däremot ackumuleras kliniskt använda Nav1-blockerare i CNS, med ett förhållande mellan hjärnan och plasma större än 10 för mexiletin. Dessa data erhållna med CDA54 föreslog starkt att hämning av PNS-natriumkanaler enbart är effektiv i djurmodeller av neuropatisk smärta, och att begränsande CNS-exponeringar av Nav1-hämmare är ett livskraftigt tillvägagångssätt för att utveckla Nav1-hämmare med ett förbättrat terapeutiskt index.

en uhts-kampanj, med användning av membranpotentialbaserad analys som beskrivs för att screena för hämmare av Nav1.7, upptäckte de nya 1–benzazepin-2-en-kanalhämmarna (Hoyt et al., 2007; Williams et al., 2007). Denna klass av hämmare visade ett definierat struktur-aktivitetsförhållande och, när de utvärderades in vivo, medlemmar av denna serie var Oralt effektiva i gnagare neuropatisk smärta och epilepsi modeller. Viktigt är att vissa medlemmar i denna klass visade molekylär selektivitet för Nav1.7-kanaler (Williams et al., 2007). Till exempel, förening 2 av Fig. 2 var mycket tillståndsberoende och 10-faldigt selektiv för 1,7 xnumx xnumx för 1,8 xnumx och 1,5 xnumx xnumx xnumx för nav. Den mest potenta, om än inte subtypselektiva, medlemmen i denna klass av Nav1.7-hämmare (förening 1, BNZA; Fig. 2) tredubblades. BNZA binder med hög affinitet (Kd på 1,6 nM) till rekombinanta Nav1.7-kanaler. Detta är den första demonstrationen av ligandbindning med hög affinitet till Nav1.7 och ger ett värdefullt screeningsverktyg för att söka efter Nav1.7-selektiva föreningar. Data som erhållits med 1-benzazepin-2-one strukturella serien tyder på att Nav1.7-selektiva analoger kan identifieras och med lämpliga farmakokinetiska och läkemedelsmetabolismsegenskaper kan sådana föreningar utvecklas som smärtstillande medel, vilket potentiellt visar förbättrad tolerans jämfört med befintliga läkemedel som används för att behandla neuropatisk smärta. Stöd för möjligheten att utveckla subtypselektiva natriumkanalhämmare som nya analgetika kommer från den senaste rapporten om ett Nav1.8-selektivt medel med hög affinitet, som gavs intraperitonealt var effektivt i ett brett spektrum av gnagarsmärtsmodeller (Jarvis et al., 2007).

ett potentiellt alternativt tillvägagångssätt för att söka efter subtypselektiva natriumkanalhämmare skulle vara att screena för föreningar som riktar sig mot kanalgrindmekanismer. Flera peptider har tidigare visat sig modifiera gating av natriumkanaler, men få små molekyler, särskilt hämmare, har beskrivits för att fungera på detta sätt. Ett sådant medel är ProTx-II, en 30-aminosyrapeptid renad från tarantula gift; denna peptid blockerar natriumkanaler och visar selektivitet för Nav1.7 (Smith et al., 2007). ProTx-II binder till natriumkanalernas vilotillstånd och förskjuter spänningsberoendet av kanalaktivering till mer depolariserade potentialer. Starka depolariseringar övervinner kanalhämning, vilket är ett kännetecken för denna typ av grindmodifieringspeptid. En möjlig strategi för att identifiera små molekylmimetika av en gating modifieringspeptid är att radiomärka ProTx-II i biologiskt aktiv form och att utveckla en bindningsanalys med Nav1.7-kanaler som heterologt uttrycks i en cellinje. Screening för små molekyler som modulerar ProTx-II-bindning kan avslöja nya klasser av kanalhämmare som partitionerar in i membranet och stör rörelsen hos grindpaddeln och därigenom förhindrar kanalöppning. En extra fördel med denna typ av UHTS är att höga koncentrationer av testföreningar kan användas, en situation som utesluts i färgbaserad screening på grund av fluorescensinterferens som vanligtvis uppstår med höga koncentrationer av många små organiska molekyler. Med tanke på att vissa grindmodifieringspeptider binder till regioner som är unika för specifika kanaler inom en superfamilj, kan subtypselektiva hämmare identifieras med hjälp av en sådan strategi.