det senaste decenniet har sett anmärkningsvärda framsteg inom både proteomik och genomik. Förutom grundläggande tekniska framsteg som har lett till en ökad volym av högkvalitativa data, har denna ”-omics”- revolution också börjat ge några intressanta insikter i mångfalden av processer som reglerar tumörgenes i många olika typer av mänskliga cancerformer. De stora färdplanerna för gen-och proteinuttryck som produceras med dessa metoder kan ofta användas för att klassificera cancer eller förutsäga svar på vissa typer av behandlingar. De misslyckas emellertid ofta med att fastställa specifika regulatorer som kan fungera som lovande mål för nästa generation av cancer mot cancer, till stor del för att många av de stora ”drogbara” klasserna av proteiner är enzymer som är tätt reglerade både på transkriptionsnivå och översättning och på nivån av enzymaktivitet. Således misslyckas många nu vanliga ”-Omiska” metoder att ge information om den dynamiska regleringen av ett givet enzym eller en familj av enzymer under de många stadierna av cancerutveckling. I detta nummer av PNAS, Shields et al. (1) använd en relativt ny metod som kallas ”aktivitetsbaserad proteomik” för att identifiera ett protein med serinhydrolasaktivitet som är en väsentlig regulator för tumörcelltillväxt. Genom att använda detta funktionella tillvägagångssätt kunde författarna identifiera ett specifikt enzymmål som kan tjäna som ett värdefullt mål för utvecklingen av cancer mot cancer.
fältet för aktivitetsbaserad proteomik eller kemisk proteomik har uppstått som ett alternativ till standardproteomiska metoder, som främst ger information om det totala överflödet av proteiner (för recensioner, se refs. 2–4). Det aktivitetsbaserade proteomiska tillvägagångssättet använder sig av små molekylprober som binder till enzymer på ett aktivitetsberoende sätt, vilket möjliggör både kvantifiering av dynamiken i enzymreglering och direkt isolering och identifiering av målen av intresse (Fig. 1). Med utvecklingen av många nya klasser av sonder (2) såväl som nya klasser av affinitet och fluorescerande taggar (5) har aktivitetsbaserad proteinprofilering (ABPP) funnit ökad användning vid identifiering av nyckelregulatorer för mänskliga sjukdomar. I synnerhet visar ett antal nya eleganta exempel värdet av ABPP vid identifiering av intressanta regulatorer av cancerprogression (4, 6-8).
aktivitetsbaserad proteomik eller aktivitetsbaserad proteinprofilering (ABPP). I detta exempel märks tumörvävnadsprover med en aktivitetsbaserad sond (ABP) som innehåller en reaktiv fluorfosfonatgrupp. Efter märkning av målenzymer (i detta fall serinhydrolaser) separeras märkta proteiner med SDS/PAGE, och relativa aktivitetsnivåer bestäms av intensiteten av sondmärkning. Potentiellt intressanta mål identifieras som att ha ökat eller minskat aktivitetsnivåer i tumörprover. Märkta mål isoleras genom affinitetsrening via sondtaggen och identifieras med masspektrometri.
i studien av Shields et al. (1) i detta nummer använde författarna en bredspektrum serin hydrolassond för att profilera humana bukspottkörtelcancer vävnader. Dessa ansträngningar ledde till identifieringen av ett protein som kallas retinoblastom-bindande protein 9 (RBBP9) som hade förhöjd hydrolasaktivitet i 40% av de analyserade tumörvävnaderna. Intressant nog hade detta protein tidigare identifierats som ett retinoblastom (Rb)-bindande protein och hade ingen känd enzymaktivitet (9). Tidigare studier av funktionen av detta protein antydde att dess överuttryck ger resistens mot effekterna av TGF Kazaki vid undertryckande av celltillväxt. Dessa effekter på TGF-signalering ansågs emellertid vara det direkta resultatet av bindning av RBBP9 till Rb, vilket ledde till frisättning av eukaryot translation initiation factor 1 (EIF-1) transkriptionsfaktor. I sin nuvarande studie, Shields et al. visa att RBBP9 har serinhydrolasaktivitet och, ännu viktigare, att denna enzymaktivitet krävs för de transformerande effekterna av detta protein i cancerceller. Förlust av hydrolasaktivitet genom mutation av serin med aktiv plats (identifierad genom homologi med andra serinhydrolaser) eller RNAi-medierad nedslagning av proteinet leder till en ökning av Smad 2/3 fosforylering, en minskning av uttrycket av adhesionsmolekyler såsom E-cadherin och en efterföljande minskning av tumörtillväxten. Vidare finner författarna att rbpp9-aktivitetsnivåerna är förhöjda i ett antal andra humana cancerformer, vilket tyder på att hämning av denna hydrolasaktivitet kan ha breda tumörundertryckande effekter, vilket gör det till ett potentiellt värdefullt mål för utveckling av cancer mot cancer.
på flera nivåer, studien av Shields et al. demonstrerar kraften i ABPP-metoden. Först möjliggjorde detta tillvägagångssätt identifieringen av en enzymaktivitet i ett protein som visat sig fungera vid reglering av celltillväxtsignalering. Genom att använda ABPP-metoden var det möjligt att övervaka dynamiken i reglering av denna enzymaktivitet utan att behöva identifiera ett nativt substrat och upprätta en in vitro-analys. För det andra var expressionsnivåer av RBBP9 ekvivalenta i både normala och cancervävnader, vilket tyder på att enzymaktivitet driver det funktionella bidraget från detta protein till tumörcelltillväxt. Således skulle ingen av de nuvarande genomiska eller proteomiska metoderna kunna identifiera detta mål som en nyckelregulator för sjukdom.
naturligtvis kvarstår många frågor om den exakta mekanistiska rollen för RBBP9. Viktigast, vad är de inhemska substraten för detta enzym? Hydrolyserar enzymet faktiskt dess substrat? Vad är konsekvensen av substrathydrolys? Hur leder substratbehandling till reglering av Smad2 / 3-signalering? Det blir intressant att se om RBBP9 lätt kan hämmas av små molekyler så att det kan valideras som ett potentiellt livskraftigt läkemedelsmål med hjälp av mer avancerade musmodeller av mänsklig cancer. Svaren på dessa frågor kommer säkert att vara kommande tack vare tillgången på aktivitetsbaserade sonder.
