CRBN försämras effektivt av VHL-CRBN heterodimeriserande PROTACs

PROTAC-teknik använder E3-ligaser för att förstöra målproteiner. Vi undrade således om ett E3-ligas i sig kan ubiquitineras och brytas ned av ett annat E3-ligas om två olika E3-ligaser placeras i närheten. VHL-nedbrytare kan eventuellt vara erytropoietinersättningar genom aktivering av HIF1a. För att utforma detta kopplade vi pomalidomid, en CRBN-målinriktad molekyl, till VHL032, en VHL E3 ligasligand (Fig. 1A). Länkaren kopplade aminogruppen av pomalidomid och den terminala acetyl-gruppen av VH032; eftersom dessa är lösningsmedelsexponerade regioner, skulle en koppling mellan dem sannolikt inte störa deras bindning till varje E3-ligas. För syntes av VHL-CRBN heterodimeriserande PROTACs (Fig. 1b och kompletterande Fig. S1A), 4-fluorotalidomid (1) och VHL-ligand (5) framställdes som tidigare rapporterat33. 4-Fluorotalidomid (1) behandlades med fyra aminbinkare (2) som bär en tert-butylestergrupp i närvaro av N,N-diisopropyletylamin (DIPEA) i dimetylsulfoxid (DMSO) för att bilda en mellanprodukt (3). Efter deprotektion av tert-butylgruppen i 3 genom behandling med trifluorättiksyra (TFA) i diklormetan (DCM) kopplades syran (4) med VHL-liganden (5 eller 7) i närvaro av 1–1h-1,2,3-triazolopyridinium 3-oxid hexafluorfosfat (HATU) och DIPEA för att ge PROTACS (6), TD-158, TD-165, TD-343 och TD-487 (8).

efter behandling med dessa föreningar undersökte vi nivåerna av VHL och CRBN genom Western blot-analys. Behandling med TD-158, TD-165 eller TD-343 orsakade en koncentrationsberoende minskning av nivån av CRBN-proteiner (Fig. 1C, övre panelen). Nivåerna av både VHL-långform och VHL-kortform ökade emellertid, förmodligen på grund av stabilisering genom kemisk-proteininteraktion (Fig. 1C, övre mitten och nedre mitten paneler)34. I fallet med behandling med 10 occurm TD-158 återställdes CRBN-nivåerna; denna ”krok”-effekt är en typisk egenskap som uppträder i samband med högdos PROTAC-inducerad proteinnedbrytning9,35,36,37. Emellertid misslyckades TD-487, en stereoisomer av TD-165, att inducera CRBN-nedbrytning (Fig. 1C). TD – 343 hade relativt svag aktivitet, vilket antyder att införlivandet av syre i länkaren hämmar PROTAC-aktivitet. En kvantitativ analys av omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) indikerade att minskningen av CRBN-nivå inducerad av VHL-CRBN heterodimeriserande PROTACs inte berodde på förändringar i mRNA (kompletterande Fig. S1B). Värdena för 50% nedbrytningskoncentration (DC50) och maximal nedbrytning (Dmax) mättes för alla syntetiserade föreningar. De beräknade DC50-och Dmax-värdena för TD-158 var 44,5 nM och 97.1% respektive motsvarande värden för TD-165 var 20,4 nM och 99,6% (Fig. 1D och kompletterande Fig. S1D). Den kortare länkinnehållande nedbrytaren TD-156 (DC50 = 100,6 nM, Dmax = 96,9%) visade svagare aktivitet jämfört med TD-165 (kompletterande Fig. S1C). TD – 343 (DC50 = 367,8 nM, Dmax = 85,1%), med syre införlivat i länkaren, ledde till ineffektiv nedbrytning av CRBN. För att testa effekten av kopplingen till talidomid undersökte vi nedbrytning av CRBN genom VHL-CRBN heterodimeriserande PROTACs med en annan koppling. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, Dmax = 82%), med en glykolbindning och TD-033 (DC50 = 2546,1 nM), med en amidbindning, uppvisade minskad CRBN-nedbrytning, medan TD-759 (DC50 = 28,8 nM), med en glycinbindning, visade en styrka liknande den för TD-165. För att avgöra om relativa proteinnivåer kan bidra till denna förspända proteinnedbrytning behandlade vi celler som överuttrycker VHL, CRBN eller båda med TD-158 och analyserade CRBN-och VHL-nivåer. I samtliga fall reducerades CRBN-nivåerna medan VHL-nivåerna förblev likartade eller ökade (Fig. 1E). I tidsförloppsexperiment försämrades TD-158 CRBN med mer än 80% inom 3 h och försämrades fullständigt efter 12 h (Fig. 1F). TD-158-inducerad CRBN-nedbrytning observerades också i olika humana cellinjer (kompletterande Fig. S2A-D).

nedbrytning av CRBN genom VHL-CRBN heterodimeriserande PROTACs är beroende av CRL2VHL

för att verifiera att CRBN-nedbrytning med TD-158 var beroende av UPS eller Cullin-RING ubiquitinligaser (CRL) testade vi bortezomib, en proteasomhämmare och MLN4924, en neddyleringshämmare. Samtidig behandling med TD-158 och bortezomib eller MLN4924 förhindrade CRBN-nedbrytning (Fig. 2a och kompletterande Fig. S3A). Som förväntat ökade Poly-ubiquitinkedjebildningen markant i närvaro av TD-158 (Fig. 2B). Dessutom dämpade knockdown av VHL med litet störande RNA (siRNA) TD-158–inducerad CRBN-nedbrytning i HEK293T-celler (Fig. 2C). Däremot återställde uttrycket av VHL i 786-o-celler, en VHL-bristfällig njurkarcinomcellinje, TD-158-inducerad CRBN-nedbrytning (Fig. 2D). I linje med dessa resultat förhindrade siRNA-medierad knockdown av Cullin2, ett ställningsprotein av CRL2VHL-komplexet, TD–158-inducerad CRBN-nedbrytning (Fig. 2E). Sammantaget indikerar dessa resultat att CRBN-nedbrytning av VHL-CRBN heterodimeriserande PROTACs är beroende av CRL2VHL-komplexet.

effektiv nedbrytning av PROTACs kräver bildning av ett ternärt komplex med målproteinet och E3-ligasen9,38. För att testa detta utförde vi samimmunutfällningsexperiment. Vi fann att exogent uttryckt Flaggmärkt CRBN co-immunoprecipitated endogen VHL i närvaro av TD-158, men inte i dess frånvaro (Fig. 2F). GST-neddragningsexperiment med användning av renade proteiner visade att CRBN direkt interagerade med VHL-Elongin B/C-komplexet i närvaro av TD-158 (Fig. 2G). Dessutom inhiberade tillsatsen av överskott av pomalidomid eller VHL-ligand TD–158-inducerad CRBN-nedbrytning (kompletterande Fig. S3B, C). Exogent uttryckt CRBN Y384 / W386A (AA), en pomalidomidbindande defekt mutant16, försämrades inte av TD-158 (kompletterande Fig. S3D). Således tyder dessa data på att bildandet av ett ternärt komplex bland CRBN, VHL och TD-158 är en förutsättning för CRBN-nedbrytning.

en global proteomisk analys avslöjar att TD-158 inducerar nedbrytning av CRBN

för att undersöka nedbrytningen av CRBN på ett opartiskt sätt utförde vi en kvantitativ proteomisk analys. För att minimera de sekundära effekterna av CRBN-nedbrytning behandlade vi Jurkat-celler, som uttryckte CRBN-och IMiD-neo-substrat, med TD-158 eller DMSO (vehicle control) för 12 h. proteinerna från varje prov smältes och de digererade peptiderna märktes för isobarisk märkning kopplad till vätskekromatografi-tandemmasspektrometri. Denna analys identifierade 7 148 proteiner innehållande mer än tre icke-överflödiga, unika peptider (kompletterande tabell S1). Endast tre proteiner-CRBN, CNIH1 och LMBRD2—uppfyllde kriterierna för ett P-värde = 0,05 och mer än en 1,5-faldig förändring. Bland dem var CRBN det enda proteinet som förändrades mer än 2 gånger (Fig. 3A). Nivåerna av andra komponenter i CRL4CRBN-komplex (CUL4A, CUL4B, DDB1 och RBX1) och CRL2VHL-komplex (elongin C, elongin B , CUL2 och RBX1) förblev emellertid oförändrade (Fig. 3B, C). Intressant nog ändrades inte nivåerna av tidigare rapporterade neo-substrat av Imider, inklusive IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 och ZNF653 vid TD-158-behandling (Fig. 3B) 39,40,41. Dessa resultat bekräftades genom immunoblotting i Jurkat och olika multipelt myelomcellinjer (Fig. 3D och kompletterande Fig. S2A-D).

CRBN-nedbrytning genom VHL-CRBN heterodimeriserande PROTACs rekapitulerar en CRBN-brist

ett endogent substrat av CRL4CRBN är glutaminsyntetasglul, vilket är ett nyckelenzym i biogenesen av glutamin. Acetyltransferas CBP / p300 acetylerar två N-terminala lysinrester av limträ under betingelser med höga nivåer av glutamin, och det resulterande acetylerade limet fångas och ubiquitineras av CRL4CRBN och avlägsnas därefter av proteasomer22. För att undersöka effekten av TD-158 på LIMNIVÅER svältade vi Hep3B-celler av glutamin i 48 timmar och levererade sedan glutamin i närvaro eller frånvaro av TD-158. TD-158 inducerade CRBN-nedbrytning oavsett glutaminstatus, och nivåerna av limträ minskade långsammare över tiden i närvaro av TD-158 än i dess frånvaro (Fig. 4A, B). Dessutom in vivo ubiquitination analyser visade att ubiquitination av limträ minskade i närvaro av TD-158 (Fig. 4C). Vi undersökte också om TD-165-behandling ger cellulär resistens mot IMiD. Två IMiD-känsliga cellinjer, WSU-DLCL2 och RPMI8226, förbehandlades med TD-165 eller DMSO i 24 timmar och behandlades sedan med pomalidomid, TD-165 eller båda för 3 d. förbehandling med TD-165 minskade de antiproliferativa effekterna av pomalidomid i båda cellinjerna (Fig. 4D, E). Sammantaget indikerar dessa data att CRBN-nedbrytning genom VHL-CRBN heterodimeriserande PROTACs rekapitulerar en CRBN-brist.

för att undersöka in vivo-effekterna av VHL-CRBN heterodimeriserande PROTACs försökte vi bestämma om TD-165 kan inducera CRBN-nedbrytning i djurmodeller. Även om aminosyrarester i mus CRBN (mCRBN) som är viktiga för teratogenicitet inte bevaras, försämrades mCRBN tydligt, om än i något mindre utsträckning, av TD-165 i musembryonala fibroblaster (kompletterande Fig. S4A). Vi administrerade sedan TD-165 intraperitonealt till möss för att bestämma om TD-165 inducerar CRBN-nedbrytning in vivo. CRBN-nivåerna ändrades emellertid inte i mjälten, perifera blodmononukleära celler (Pbmc) eller lever (kompletterande Fig. S4B). Med tanke på att farmakokinetiken för TD-165 är rimlig (kompletterande tabell S2), kan denna frånvaro av effekt bero på den höga plasmaproteinbindningen (99,9%) av TD-165 (kompletterande tabell S3).

N-terminalt stympad CRBN försämras inte av VHL-CRBN heterodimeriserande PROTACs

för att bestämma vilken domän av CRBN som är viktig för TD-165–medierad CRBN–nedbrytning, genererade vi en serie CRBN-deletionsmutanter (D1-D4), som avbildas i Fig. 5a. celler som uttrycker CRBN i full längd eller enskilda deletionsmutanter behandlades med antingen DMSO eller TD-165, och celllysaterna undersöktes för nedbrytning efter TD-165-behandling. Överraskande, ingen av de fyra CRBN-deletionsmutanterna försämrades av TD-165, medan CRBN i full längd försämrades effektivt (Fig. 5B). I synnerhet var VHL-nivåerna något förhöjda förmodligen på grund av stabiliseringen av kemisk proteininteraktion i närvaro av TD-165, men inte förändrad genom uttryck av stympade CRBN-mutanter i närvaro av TD-165 (Fig. 5B). En möjlig förklaring till detta skulle vara oförmågan hos deletionsmutanter att bilda ett ternärt komplex. D1-mutanten bildade emellertid ett ternärt komplex med TD-165 och VHL (Fig. 5c) och ubiquitination av D1 ökade i närvaro av TD-165 (Fig. 5D). Vi antog sedan att amino-terminala lysinrester av CRBN krävs för ubiquitination. För att testa den här tanken ersatte vi alla tre lysinrester i n-änden av CRBN (a.a. 1-80) med arginin, individuellt och i kombination, och undersökte sedan celllysater för CRBN-nedbrytning. TD – 158 försämrade effektivt alla mutanter i samma utsträckning som vildtyp CRBN (Fig. 5E), vilket indikerar att de tre lysinresterna vid n-änden av CRBN inte krävs för nedbrytning inducerad av VHL-CRBN heterodimeriserande PROTACs.

den oordnade regionen av det riktade proteinet krävs för effektiv protac-inducerad nedbrytning

Vi försökte därefter bestämma strukturella skillnader mellan CRBN i full längd och CRBN-deletionsmutanten D1. N-terminalen för CRBN (a.a. 1-80) förutspåddes innehålla en utfälld eller inneboende störd region, baserat på en iupred2a-analys (kompletterande Fig. S5A). Denna oordnade region (a. a. 1-48) var verkligen oskiljbar i CRL4CRBN-kristallstrukturen på grund av dess flexibilitet (PDB-post; 6BN7). Det har visats att den inneboende störda regionen är en av huvudkomponenterna i proteasomal degron och den fungerar som initiator för proteasomal proteolys25. Alternativt, när det gäller globulära proteiner utan en störd region, kan P97/valosininnehållande protein (p97/VCP)-komplexet utveckla den sekundära strukturen, vilket underlättar proteinerna proteasomal nedbrytning. För att undersöka förhållandet mellan protac-inducerad proteinnedbrytning och P97/VCP-komplexet testade vi effekten av N2, N4-dibensylkinazolin-2,4-diamin (DBeQ), en P97 / VCP–hämmare, på TD-165-inducerad CRBN-nedbrytning. Dessa experiment visade att CRBN-nedbrytningen inte påverkades av dbeq-behandling (Fig. 6A). Nivåerna av DNA-skadeinducerbart transkript 3 (DDIT-3; CHOP) och lipiderad LC-3II, som användes som positiva kontroller, höjdes vid DBeQ-behandling. Knockdown av p97 genom siRNA-eller DBeQ-behandling försämrade ERAD-och autofagvägar, vilket ledde till uppreglering av CHOP, en väletablerad UPR-markör och ackumulering av LC-3II, en representativ autofagmarkör, respektive (Fig. 6A) 42. Därför, för att undersöka om den oordnade regionen av CRBN underlättar PROTAC-inducerad proteasomal nedbrytning, bifogade vi den oordnade regionen (AA 1-80) av CRBN till D2, D3 och D4 mutanter och undersökte de chimära proteinerna för nedbrytning. Alla chimära proteiner, särskilt D4-chimären, försämrades av TD-165 på ett koncentrationsberoende sätt (Fig. 6B). Införandet av en CRBN – oordnad region till antingen N-eller C-änden av VHL inducerade emellertid inte nedbrytning av fusionsproteinet (Fig. 6C), vilket indikerar att bindning av den oordnade regionen inte är tillräcklig för alla riktade proteiner. För att utvidga denna ide till nedbrytning inducerad av andra PROTACs testade vi ARCC4, en tidigare rapporterad androgenreceptor (AR) PROTAC43, eftersom AR också har en utfälld region vid N-terminalen (a.a. 1-330), som bestäms med hjälp av iupred2a analysverktyget (kompletterande Fig. S5B). Vid ARCC4-behandling försämrades AR utan den N-terminala störda regionen (ACCORD330) mindre effektivt än ar i full längd. Intriguingly ökade infästningen av CRBN-störda regionen (a.a. 1-80) till AR ACTUBERN330 nedbrytningseffektiviteten (Fig. 6D och kompletterande Fig. S5C). I enlighet med detta främjade fastsättning av AR-störda regionen (a.a. 1-170) till CRBN D1-mutant också proteolys av TD-165 (Fig. 6e och kompletterande Fig. S5D).

för att ytterligare förstärka dessa resultat valde vi PROTACs med hög potens (DC50 < 1 occarbm) baserat på en litteratursökning och analyserade dem sedan för en inneboende oordnad region med hjälp av iupred2a-verktyget. Intressant nog befanns två tredjedelar av de utvalda PROTAC-riktade proteinerna ha en oordnad region med mer än 40 aminosyror, antingen vid en av deras termini eller internt (Tabell 1)44, även om aminosyrasekvensbaserad förutsägelse av oordnade eller ostrukturerade regioner inte tar andra faktorer, såsom protein-proteininteraktion eller post-translationella modifieringar, i övervägande44,45,46. I enlighet med detta har VHL-Homo-PROTAC visat sig inducera nedbrytning av VHL-långformen, som har en störd region vid sin N-terminal, men inte VHL-kortform47. Således stöder detta vår uppfattning att den oordnade regionen av riktade proteiner krävs för effektiv nedbrytning av PROTACs.