Abstrakt
en direkt och mycket specifik kemiluminescerande enzymbunden immunosorbentanalys (CL-ELISA) metod för övervakning av kloramfenikol (CAP) i kosmetika har utvecklats. Anti-kloramfenikolantikroppen (mAb) som antogs i detta arbete för direkt immunanalys kan binda till CAP specifikt, med försumbar korsreaktivitet (CR) (mindre än 0,01%) med de flesta CAP-analoger, inklusive strukturellt relaterad tiamfenikol (TAP) och Florfenikol (FF). Detektionsgränsen (LOD), mätt med IC10, var 0,0021 ng mL−1. Detekteringsområdet (IC20-IC80) varierade från 0,00979 till 0,12026 ng mL−1. I spikade kosmetikprover varierade medelåtervinningarna från 82,7% till 99,6%, med intradag-och interdagvariation mindre än 9,8 respektive 8,2%. Dessutom, med hjälp av HRP-märkt anti-CAP mAb, kunde metoden bearbetas i snabb direkt immunoreaktionsläge. Denna CL-ELISA-metod kan tillämpas för specifik, snabb, semikvantitativ och kvantitativ detektion av CAP i kosmetika, vilket underlättar den exakta kvalitetskontrollen av CAP-kontaminering.
1. Inledning
kloramfenikol (CAP) är en medlem av amfenikol familj av antibakteriella medel, och de framställdes av venezuelanska streptokocker (struktur som visas i Figur 1) . Kloramfenikol utförs vanligtvis som ett bredspektrum antibiotikum med effektiv antimikrobiell aktivitet. Det kan vanligtvis vara mot en spridd mängd Gram-positiva och gramnegativa bakterier, inklusive de anaeroba organismerna . På grund av den höga aktiviteten används kloramfenikol i stor utsträckning inom boskap, vattenbruk och kosmetikindustrin för förebyggande och behandling av bakteriell infektion. I de senaste publikationerna rapporterades kloramfenikol användas för behandling av epifollikulit, akne och annat hudtillstånd. Kloramfenikol antogs också allmänt i kosmetika som ett antiseptiskt medel för att hämma tillväxten av mikroorganismer .
kemiska strukturer för CAP, TAP och FF.
nya undersökningar visade dock att amphenicol-antibiotika uppvisade potentiella negativa effekter på människors hälsa . Därför är tillämpningarna av kloramfenikol förbjudna i många länder, inklusive EU-medlemmar, USA och Kina . Även om det finns officiella regler för dessa antibiotika, läggs kloramfenikol fortfarande olagligt till kosmetika på grund av dess låga kostnad och utmärkta antibakteriella effekt. För att säkerställa kosmetikkens säkerhet och hålla människors hälsa är det framväxande att utveckla känsliga, pålitliga och tillgängliga metoder för kloramfenikoldetektering vid spårningsnivåer i kosmetikprover.
det rapporterades många analysmetoder för CAP och relaterad antibiotikadetektering, såsom högpresterande vätskekromatografi (HPLC) , gaskromatografi (GC) och vätskekromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) . Dessa metoder kräver emellertid huvudsakligen dyra instrument, komplicerade förbehandlingsförfaranden och välutbildade staber, och de var inte lämpliga för snabb screening av stort antal prover. Immunanalyser huvudsakligen baserade på antikropp-antigenspecifikt erkännande antogs för hög genomströmning och snabb screening av målanalyter. Kemiluminescerande substrat med högkänslighetskaraktär kan användas i en direkt kemiluminescerande enzymbunden immunosorbentanalys (CL-ELISA) plattform. Jämfört med konventionella kolorimetriska protokoll kunde känsligheten hos immunanalyser förbättras med minst 2~3 gånger med kemiluminescerande som substrat.
tidigare litteratur om immunanalysdetektering av CAP kan inte skilja CAP från dess analoger av amphenicol-familjen (Figur 1), inklusive tiamfenikol (TAP) och Florfenikol (FF), på grund av de höga breda specifika antikropparna . I dessa undersökningar är det svårt att avgöra om kontaminering CAP, dess analoger, eller summan av dem när ett positivt resultat. I denna forskning använde vi en högspecifik Anti-CAP monoklonal antikropp (mAb) som kan binda till CAP-specificitet och försumbara CR-värden för de flesta testade analoger. På grundval av denna mycket mAb utvecklades en mycket specifik och direkt CL-ELISA-metod för bestämning av spårmängder av CAP i kosmetika. Detta utvecklade protokoll behöver inte komplex indirekt konjugeringsreaktion med HRP-märkt sekundär antikropp. Med kemiluminescerande substrat kunde känsligheten förbättras signifikant (schematiskt diagram som visas i Figur 2). Med användning av HRP-märkt anti-CAP mAb utfördes analysen i snabb direkt immunoreaktionsläge utan komplexa immunoreaktionsprocedurer. Denna CL-ELISA-metod kan tillämpas för specifik, snabb, semikvantitativ och kvantitativ detektion av CAP i kosmetika, och detta arbete kommer att bidra till kvalitetskontroll och reglering av CAP.
schematisk av CL-ELISA-metoden.
2. Material och metoder
2.1. Kemikalier och reagenser
kloramfenikol (CAP), ciprofloxacin (CIP), Florfenikol, (FF), penicillin (PEN), raktopamin (RAC), salbutamol (SAL), sulfadiazin (SUL) och tiamfenikol (TAP) standarder köptes från Sigma Aldrich (99% renhet, St.Louis, MO, USA). CAP-konjugerat antigen och HRP-märkt CAP-antikropp erhölls från ZeYang Co. (Peking, Kina). SuperSignal chemiluminescence substratlösning köptes från Thermo Fisher (USA). Milli-Q syntessystem erhölls från Millipore (Bedford, MA, USA) för vattenrening. Andra reagenser (analytisk kvalitet) köptes från Beijing Reagent Corp. (Peking, Kina).
2.2. Utrustning och instrumentering
Costar vit ogenomskinlig 96-brunns polystyren microtiter plattor (Costar Inc., Milpitas, CA, USA) användes i detta arbete. SpectraMax M5 mikroplattläsare erhölls från molekylära enheter (CA, USA). MIKRO 22R centrifug erhölls från Hettich Laborapparate (Tuttlingen, Tyskland).
2.3. Buffertar och lösningar
för denna utvecklade CL-ELISA-analys bereddes olika buffertar och lösningar för immunanalys.
Fosfatbuffertsaltlösning (PBS, 0,01 m, pH 7,4): 8,0 g NaCl, 2,9 g Na2HPO4, 0,2 g KH2PO4 och 0,2 g KCl löstes i 1 L avjoniserat vatten.
blockerande Buffert (pH 7,4): 0,5% kasein i 0,01 M PBS.
Beläggningsbuffert (pH 9,6): 1,59 g Na2CO3 och 2,93 g NaHCO3 löstes i 1 L avjoniserat vatten.
Enzymutspädningsbuffert (pH 7,4): 5% fetalt bovint serum i 0,01 m PBS.
tvättbuffert (PBST): 0,01% Tween-20 i 0,01 M PBS.
2.4. Konkurrerande Kemiluminescerande ELISA (CL-ELISA)-förfarande
Costar vita ogenomskinliga 96-brunns polystyrenmikrotiterplattor antogs för immunanalysreaktion. 100 oc Kap-konjugerat antigen löstes i beläggningsbuffert vid en slutlig koncentration vid 0,00042 ng mL – 1 som tillsattes och inkuberades vid 4 oc k i 20 h för beläggning. Efter tvättning med tvättbuffert i tre gånger tillsattes blockeringsbuffert (150 oc per brunn) till varje brunn och inkuberades för att uppta överskott av aktiva platser vid 37 oc C i 1,5 h. de belagda plattorna lagrades vid 4 oc C före användning.
För CAP-analys förbehandlades de belagda mikrotiterplattorna vid rumstemperatur i 30 minuter. Därefter tillsattes 30 occl av bearbetade prover eller CAP-standard och 70 occl av HRP-märkt anti−CAP-antikropp (2,46 ng mL-1) utspädd med enzymutspädningsbuffert till varje brunn i tur och ordning. Plattorna inkuberades vid 37 C i 30 minuter för direkt konkurrensreaktion. Efter tvättning av plattan med tvättbuffert i fem gånger tillsattes supersignal-kemiluminescenssubstratlösning (100 oc/brunn) och kemiluminescensintensiteten hos varje brunn mättes med en SpectraMax M5-mikroplattläsare.
2,5. Standardkurva
tio olika koncentrationsnivåer testades för utvärdering av kalibreringskurvor. Den högsta koncentrationen var vid 1000 ng mL−1, och följande koncentrationer späddes seriellt med en tredjedel av den föregående. Varje koncentration kördes i tre gånger enligt CL-ELISA-protokollet.
B / B0 definieras för kemiluminescensförhållandet för resultaten. Här står B för kemiluminescensintensiteten för olika CAP-standardkoncentrationer, och B0 står för kemiluminescensintensitet utan CAP-standard i varje test.
standardkurvor utvärderades genom att plotta B/B0 vid olika CAP-standardkoncentration och anpassa data till följande fyra-parameter logistisk ekvation med ursprung (version 7.5, OriginLab, Northampton, MA, USA):i denna ekvation står A för den övre asymptoten (kemiluminescensförhållande B / B0 utan CAP-standard). B är kurvens lutning vid böjningspunkten. C, som representerar 50% av den maximala absorbansen, är x-värdet vid böjningspunkten. Och D är den nedre asymptoten (bakgrundssignal).
2.6. Provberedning för CL-ELISA-analys
Kosmetikprover (2,00 g 0,02 g 0,0 g) vägdes exakt och överfördes till centrifugrör av polypropen i 50 mL. Därefter tillsattes 20 mL PBS och vortexed för 30 s, och sedan ultra-ultraljudsbehandling för 3 min för extraktion av locket. Varje prov centrifugerades vid 12000 g för 10 min vid 4 CCG, och supernatanten uppsamlades och filtrerades genom ett 0,22 CCG membran. Trettio mikroliter alikvoter av supernatanten för varje prov tillsattes till en belagd 96-brunnsplatta för analys enligt den utvecklade CL-ELISA-proceduren.
2.7. Noggrannhet och Precision
negativa primer lotion cosmetics-prover bekräftades tidigare av UPLC-MS / MS-analyser. Därefter spikades varje prov med CAP-standard vid tre olika koncentrationer av 5, 20 och 100 ng L−1. Analysen bearbetades enligt det utvecklade CL-ELISA-protokollet med fem replikat vardera (n = 5). Koncentrationerna av prover beräknades enligt kalibreringskurvan och noggrannheten och precisionen utvärderades på grundval av återvinningar av alla prover.
3. Resultat och diskussion
3.1. Analysspecificitet
metodens specificitet bedömdes genom att utvärdera omfattningen av korsreaktivitet (CR) med strukturellt besläktade föreningar av CIP, FF, PEN, RAC, SAL, SUL och TAP. CR-värdena utvärderades med följande ekvation:I denna ekvation är IC50 den halva maximala hämmande koncentrationen av ett ämne. Specificitetsresultaten för anti-CAP mAb visades i Tabell 1. Från resultaten erhölls försumbara CR-värden (mindre än 0.01%) för alla analoger som undersöktes i denna forskning inklusive den mest strukturrelaterade kranen och FF. Man kan dra slutsatsen att denna utvecklade CL-ELISA-analys kunde tillämpas för specifik CAP-detektion.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. Optimering av Cl-ELISA-proceduren
antigen-antikroppsförhållandet i ett konkurrenskraftigt reaktionssystem påverkar immunoreaktionen signifikant. I detta CL-ELISA-protokoll utvärderades och optimerades antigen-antikroppsförhållandet. Antigen till antikroppsförhållanden av 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, och 30: 70 undersöktes. Resultaten optimerades enligt IC50 och RLUmax (maximala relativa ljusenheter) och visade i Tabell 2. IC50-värdet ökade signifikant med ökande antikroppsförhållande. När förhållandet mellan antigen och antikropp var 70:30 erhölls det mest känsliga resultatet med det lägsta IC50-värdet. Dessutom ledde en hög andel antikropp till ett högt RLUmax-värde. För de testade antigen-antikroppsförhållandena var emellertid alla RLU-värden lämpliga för detektering av CAP. På grund av den höga känsligheten hos kemiluminescerande substrat var det ingen uppenbar skillnad i RLUmax-värde. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.
|
|||||||||||||||||||||||||||
3.3. Känslighet
IC50, LOD (mätt med IC10) och detekteringsområdet (IC20−IC80) erhölls från sigmoidal kalibreringskurva för att utvärdera känsligheten för det föreslagna CL-ELISA-protokollet (Figur 3). I denna forskning var LOD 0,0021 ng mL−1 medan IC50-värdet var 0,016 ng mL-1 för CAP. Detekteringsområdet för denna metod var 0,00979−0,12026 ng mL-1. Jämfört med etablerade immunanalyser uppvisade denna metod högre känslighet och lägre LOD för CAP .
standardkurva för CAP genererad från CL-ELISA under optimerade förhållanden.
3.4. Noggrannhet och Precision
för noggrannhets-och precisionsutredning beräknades återvinningar av CAP i befästa prover först. Och noggrannheten och precisionen utvärderades med fem replikat vardera på tre valideringsdagar. Vid tre befästa nivåer av 5, 20 och 100 ng L−1 varierade medelåtervinningarna för CAP i spiked primer lotion cosmetics-prover från 82,7% till 99,6%. Intradag och interdag variation var mindre än 9,8% respektive 8,2% (resultaten visades i tabell 3).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Slutsatser
i denna forskning utvecklades en ny och mycket känslig CL-ELISA-metod för CAP-detektion i kosmetika. MAb som användes i analysen uppvisade hög specificitet för att täcka med försumbara CR-värden till dess analoger, särskilt för de flesta strukturrelaterade TAP och FF. På grundval av denna mycket mAb skulle den föreslagna CL-ELISA-metoden kunna tillämpas för detektering av CAP specifikt i stället för blandningar av CAP och andra analoger. Detta är den första rapporten från en CL-ELISA för bestämning av lock i kosmetika. Metoden LOD var 0,0021 ng mL−1, IC50 var 0,016 ng mL−1 och detekteringsområdet var 0,00979−0,12026 ng mL-1. I spikade kosmetikprover varierade medelåtervinningarna från 82,7% till 99,6%, med intradag-och interdagvariationen mindre än 9,8% respektive 8,2%. Analysen erbjuder fördelarna med hög specificitet, enkelhet, snabba analystider och kostnadseffektivitet. Med avseende på dess känslighet och specificitet är den utvecklade CL-ELISA-metoden överlägsen de flesta rapporterade immunanalyser för CAP-detektion. Man kan dra slutsatsen att denna utvecklade CL-ELISA-metod kan tillämpas för specifik, snabb, semikvantitativ och kvantitativ detektion av CAP i kosmetika.
datatillgänglighet
de data som används för att stödja resultaten av denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på begäran.
intressekonflikter
författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter angående publiceringen av detta dokument.
bekräftelser
Vi vill tacka LetPub (www.letpub.com) för att ge språklig hjälp under utarbetandet av detta manuskript. Detta arbete stöddes av National R&d nyckelprogram för Kina (nr 2017yfe0110800), National Natural Science Foundation of China (nr 31871718) och EU Horizon 2020 forskning och innovation action (nr 727864-EU-Kina-Safe).
