Abstrakt
spänningsstyrd l-typ Cav1.2 kalciumkanaler kopplar membrandepolarisering till övergående ökning av cytoplasmatisk fri Ca2+ koncentration som initierar ett antal väsentliga cellulära funktioner inklusive hjärt-och vaskulär muskelkontraktion, genuttryck, neuronal plasticitet och exocytos. Inaktivering eller spontan avslutning av kalciumströmmen genom Cav1.2 är ett kritiskt steg i regleringen av dessa processer. Den patofysiologiska betydelsen av denna process manifesteras i högt blodtryck, hjärtsvikt, arytmi och ett antal andra sjukdomar där acceleration av kalciumströmförfallet bör ge en fördelfunktion. Den centrala frågan om detta dokument är inaktiveringen av Cav1.2-kalciumkanalen medierad av flera determinanter.
1. Inledning
den spänningsstyrda inåt Ca2 + – strömmen () är en vanlig mekanism för övergående ökning av den cytoplasmatiska fria Ca2+ – koncentrationen som utlöses av celldepolarisering. Denna form av Ca2+ – signalering aktiverar väsentliga cellulära processer inklusive hjärtkontraktion , reglering av glatt muskelton , genuttryck, synaptisk plasticitet och exocytos . Fullständig och snabb avslutning av Ca2 + tillströmning förmedlas av en invecklad mekanism för spontan kalciumkanalinaktivering, vilket är avgörande för att förhindra Ca2+ överbelastning av cellen under åtgärdspotentialer och återställande av den vilande sub-kazakm cytoplasmatisk fri Ca2+ koncentration . Detta dokument kommer att fokusera på molekylär basis och flera determinanter för Cav1.2 kalciumkanalinaktivering.
2. Cav1.2: utmaningar och lösningar
2.1. Molekylär komplexitet
Kalciumkanalen Cav1 .2 är ett oligomeriskt komplex bestående av underenheterna a1C, 6cc2 och 2cc. Jonkanalporen bildas av A1C-peptiden (Figur 1) som kodas av CACNA1C-genen. Underenheterna för extra användning av denna typ av kanal är nödvändiga för kanalens funktionella uttryck och plasmamembran (PM). De finns i flera genomiska isoformer genererade av fyra CACNB-gener (CACNB1–4) och tre cacna2d–gener (CACNA2D1-3). Alla tre underenheterna är föremål för alternativ skarvning. Att lägga till komplexiteten hos den molekylära organisationen Cav1 .2 tenderar att oligomerisera. Sammantaget genererar genomisk variation, alternativ skarvning och hetero-oligomerisering en uppsjö av Cav1.2 skarvvarianter som uttrycks i celler på art-, vävnads-och utvecklingsberoende sätt, medan förändringen av deras fina balans kan ha betydande patofysiologiska konsekvenser .
transmembrantopologi för subenheten i 1C i Brasilien. För att illustrera platserna för molekylär mångfald segmenteras polypeptidsekvensen schematiskt enligt CACNA1C genomisk karta och motsvarande invarianta (svarta) och alternativa (blå) exoner skisseras av svarta staplar och numreras (1-50). Fyra regioner av homologi (I-IV), som var och en består av 6 transmembransegment (numrerade), tros vikas runt den centrala porerna. en konstitutiv plats för bindning av ett konstitutivt område för bindning av ett konstitutivt område för bindning av ett sådant område visas i grönt. LA-och IQ-motiv (röd) utgör kalmodulinbindande domän (CBD).
2.2. Utmaningar i valet av värdcellen
naturligt förekommande mångfald av Cav1.2 komplicerar tolkningen av data som erhållits från inhemska celler, än mindre enkanaldata. Detta ligger till grund för betydelsen av Cav1.2-forskning i rekombinanta uttryckssystem där kanalens molekylära sammansättning och strukturen hos dess beståndsdelar är fördefinierade. Detta experimentella tillvägagångssätt stötte emellertid på det stora problemet med valet av en lämplig värdcell.
de flesta studierna av kalciumkanaler utfördes med användning av HEK293-celler. Dessa celler ger hög expressionseffektivitet av rekombinanta Ca2 + – kanaler men innehåller tyvärr endogena kalciumkanaler som uppvisar Ca2 + – strömmar upp till 3 pA/pF . Således tillåter hek293-celler en adekvat studie av rekombinanta Ca2+ – kanaler Endast när amplituden hos strömmen är tillräckligt stor för att ignorera bidraget från de endogena kanalerna. Korrekt bedömning av de funktionella determinanterna för Ca2 + – kanaler kräver emellertid användning av värdceller som är helt fria från endogena Ca2+ – kanalsubenheter. COS1-eller COS7-celler passar detta krav bra eftersom de inte genererar någon märkbar kalciumström, innehåller inte endogena Ca2+ – kanalsubenheter eller deras prekursorer och visar ingen induktion av endogena Cav1.2-subenheter som svar på uttrycket av de rekombinanta . Kinetikparametrar och spänningsberoende av aktivering och inaktivering av Cav1.2-kanalströmmarna uppmätta i COS1-celler överensstämmer med data som erhållits i andra uttryckssystem . En viktig fördel med cos-celler är deras relativt långsamma delningshastighet som möjliggör bättre kontroll över effektiviteten av uttryck och montering av Cav1.2-kanalsubenheterna av olika storlek.
2.3. Problem med fluorescerande märkning och mätning
Fusion av GFP-liknande fluorophores till N-och / eller C-termini av den rekombinanta a1C eller till N-terminus av Macau ändrar inte markant de elektrofysiologiska egenskaperna hos de uttryckta kanalerna, möjliggör applicering av fluorescerande och FRET (fluorescerande resonansenergiöverföring) mikroskopi till studien av subcellulär distribution och montering av Cav1.2 såväl som invecklade aspekter av molekylär arkitektur och dynamik hos kanalen. Kanalen behåller stora elektrofysiologiska egenskaper oförändrade när A1C C-terminalsekvensen kodad av distala exoner 46-50 (Figur 1, rester 1833-2138 i a1C,77) ersätts med ECFP. A1C smält av sin N-eller / och C-termini till EYFP är emellertid mycket känslig för fotoblekning som irreversibelt inaktiverar den. Känd som fluorophore-assisted light inactivation (FALI), begränsar denna intressanta egenskap användbarheten av acceptorfotobleaching för mätningarna av FRET i Cav1.2 på grund av osäkerhet i kanalens funktionella tillstånd . Den ratiometriska analysen av korrigerad FRET mellan fluorophorerna, smält till svansarna i A1C-och/eller Kubi-underenheterna, återspeglar emellertid de reversibla tillståndsberoende strukturella omarrangemangen av kanalen som induceras av förändringarna av transmembranspänning under patchklämma .
2.4. Rekombinant Cav1. 2: Vad behöver det för funktionellt uttryck och hur verkar det?
typiska egenskaper hos en” vildtyp ” rekombinant Cav1.2 illustreras i Figur 2(a) med ett exempel på den allestädes närvarande mänskliga A1C,77 isoformen (GenBank nr. z34815). När den EYFP-märkta a1C uttrycktes i COS1-celler ensamma fördelades det fluorescerande märkta kanalproteinet diffust över cytoplasman och genererade inte mätbar kalciumström (Figur 2(a), panel a). Den kvantitativa analysen av fördelningen av A1C mellan PM och cytoplasman (Figur 2(B)) bekräftade bristen på signifikant PM-inriktning av a1C oberoende av närvaron av exportorientering2 (staplarna a och b). Uttryck av CAV-Baksidesbakgrund (Cav-Baksidesbakgrund) i frånvaro av 2-baksidesbakgrund (A1c), men kanalen förblev tyst(Figur 2 a, panel c) såvida inte 2-baksidesbakgrund (panel d) uttrycktes. Alltså, β och α2δ-underenheten är tillräckligt för den funktionella kanal; under dessa experimentella förhållanden, β-subenheter stimulera PM inriktning av kanalen komplexa och, i närvaro av α2δ, underlätta spänning slussning av Cav1.2-kanal.
roll för Cav1.2 hjälpunderenheter. (A) Epifluorescerande bilder av de Uttryckande COS1-cellerna som visar distribution av EYFPN-1C i 1C erhållen med YFP-filtret (skalningsstänger, 4 OC) och spår av den maximala kalciumströmmen som registrerats som svar på 600 ms-steg till +30 mV från hållpotentialen mV (vänster). (B) Relativ fördelning av EYFPN-α 1C i plasma membranet (PM) över cytoplasman i frånvaro (en) eller förekomst av α 2δ (b), β 2d (c), eller α 2δ + β 2d (d). Förhållandet mellan fluorescensintensitet i PM över området under PM var i genomsnitt efter Bakgrunds subtraktion i varje cell. Förhållandet mindre än 1.0 indikerar brist på signifikant PM-inriktning med 2C. * .
formen och utseendet på toppkalciumströmmen som visas i Figur 2(a) (panel d) är ganska typiskt för den 2-modulerade cav1.2 . Dess huvudfunktioner inkluderar den relativt långsamma sönderfallshastigheten och en stor del av den ihållande återstående änden av den depolariserande pulsen . Det är uppenbart att under långvariga åtgärdspotentialer kan sådana egenskaper leda till patogen kalciumöverbelastning av cellen om den inte balanseras av robusta kompensationsmekanismer. Det var den ultimata rollen som Cav1.2 för att definiera varaktigheten av åtgärdspotentialen i hjärtceller som utlöste forskning och utveckling av kalciumkanalblockerare, en klass av läkemedel som nu har en miljard dollar marknad. Det är denna roll av Cav1.2 som stimulerar det nuvarande intresset för identifiering av molekylära determinanter för Cav1.2-inaktivering i hopp om att hitta mer specifika och effektivare läkemedel.
2,5. Sist men inte minst en komplikation: Cav1.2 Clustering
en enda ventrikulär myocyt innehåller ~300 000 Cav1.2-kanaler, men endast ~3% av kanalerna är öppna vid topp . I motsats till den populära tron är Cav1.2-kanaler inte jämnt fördelade över plasmamembranet. I nativa neuronala och hjärtmuskelceller bildar de stora kluster. Avbildning med en enda molekyl av de funktionella rekombinanta EYFPN-a1C/2A/2A2 2 kanaler uttryckt i hek293 celler avslöjade kluster bestående av ~40 kanaler som var rörliga i plasmamembranet . Både fluorescenskorrelationsspektroskopi och fluorescensåterhämtning efter fotoblekningsexperiment gav en lateral diffusionskonstant av 2/s. den funktionella betydelsen av Cav1.2-klustermobilitet är inte klar. Man tror att i hjärtmuskelceller kan sådan rörlighet begränsas genom interaktioner med andra proteiner, till exempel ryanodinreceptorer . Storleken på Cav1 .2-kluster och deras specifika densitet i plasmamembranet beror på vilken typ av uttryckt underenhet i 2x. Avståndet mellan termini av grannen a1C-subenheter varierar från 67 Å med neuronala/hjärt ß1b 79 Å med vaskulär β3. Den högsta tätheten av Cav1.2-kluster i plasmamembranet och den minsta klusterstorleken observerades med närvaro av 2B. Insikt i molekylära mekanismer som definierar arkitekturen och egenskaperna hos Cav1.2-kluster är viktigt för bättre förståelse av patofysiologi av kopplingen mellan Cav1.2-aktiviteten och de inducerade svaren i Ca2+ – signaltransduktion.
3. Spännings-och Ca2+ – beroende inaktivering av Cav1.2-Kalciumkanalen
i fallet med Cav1.2-kalciumkanaler kontrollerar två olika mekanismer Ca2+ ströminaktivering. En mekanism drivs av Ca2 + – joner på plasmamembranets cytoplasmatiska sida, medan den andra beror på transmembranspänning. Experimentellt eliminerar ersättning av Ca2 + för Ba2 + som laddningsbärare Ca2 + – beroende inaktivering (CDI) så att de Ba2+-ledande kalciumkanalerna inaktiveras på ett spänningsberoende sätt genom snabba (FI) och långsamma (SI) mekanismer . Dessa tre mekanismer för inaktivering, FI, SI och CDI, och deras huvudsakliga determinanter illustreras i Figur 3.
3.1. Ca2 + – beroende inaktivering och Kalmodulinbindande domän för a1C
det finns flera olika determinanter för CDI, men det var inte förrän 1997 att Ca2+-avkänningsstället för CDI hade minskat ner till en sträcka av den 80-aminosyra C-terminala sekvensen av a1C kodad av exoner 40-42 (Figur 2) markerad med rött block i Figur 3(a) (panel a). En naturligt förekommande skarvvariation i denna region i a1C, 86(Figur 3 (B)) inhiberade fullständigt CDI eftersom det framgår av bristen på retardation av strömmen med Ba2+ som laddningsbärare (panel c, svart spår) jämfört med (rött spår). En annan karakteristisk egenskap hos den inhiberade CDI var brist på den aktuella storleken beroende av på spänning (Figur 3(B), panel d, öppna symboler) som stannar i kontrast till U-form beroende av tidskonstanten för snabb inaktivering () på membranpotential i vildtyp Cav1.2 (Se figur 3(a), panel d). Två distinkta sekvenser, L och K,identifierades inom denna 80-aminosyrasträcka vars a1C , 86-liknande mutationer i vildtypen a1C överensstämmer med samma karakteristiska särdrag, vilket tyder på förekomsten av två intilliggande CDI-sensorer. En av dem beskrevs i k-regionen som calmodulin – (CaM -) bindande IQ-motiv och senare länken till IQ-motivet till CDI som det funktionella Ca2+ – CaM-bindningsstället bekräftades i tre oberoende studier med användning av CaM-mutanter som saknar affinitet till Ca2+. På motsvarande sätt kopplades LA-motivet till CDI som apo-CaM-bindningsplats utrustad av kanalens vilotillstånd. En enda Kammolekyl bunden till denna Ca2+-beroende Kambindande domän (CBD) av A1C är den stora Ca2+-sensorn i kanalen .
Skarvvariation av a1C i CBD-regionen av a1C, 86 hämmar inte bara fullständigt CDI utan tar också bort SI(Figur 3 (B), panel c) och berövar kanalen av differentialkänslighet för modulering av subenhet(Figur 3 (B), panel e) trots det faktum att Xiaomi förblir associerad med a1C,86(Figur 3 (B), panel b). Detta tyder på att alla tre egenskaperna hos kanalen—CDI, SI, och bisexuell-subenhetsmodulering—är kopplade ihop .
3.2. Långsam inaktivering
ett antal bevis har presenterats att aminosyror begränsade till den distala delen av S6-segment i a1C spelar en viktig roll i SI . Systematisk studie av denna region skisserade ”årlig determinant för långsam inaktivering” (ADSI) som en struktur bestående av fyra högt konserverade aminosyror av fyra transmembransegment S6, som utgör den cytoplasmatiska änden av poren(Figur 3 (a), panel a). Deras samtidiga mutation (S405I i IS6, A752T i IIS6, V1165T i IIIS6 och i1475t i IVS6) genererar A1C, IS-IV-kanalen. Analys av den nuvarande kinetiken hos A1C, IS-IV-kanalen visade enorm acceleration av den snabbt inaktiverande komponenten (10 ms i 10 ms) som innefattar cirka 50% av den totala (eller ) amplituden. Långsam spänningsberoende inaktivering av a1C, IS-IV hämmas fullständigt och kanalen förblir ledande under depolarisationens varaktighet. Byte av Ca2 + för Ba2 + som laddningsbäraren (panel c) förändrade inte signifikant detta inaktiveringsmönster, medan analysen av spänningsberoende av för den inaktiverande komponenten av genom a1C,is-IV-kanalen (panel d) bekräftade brist på CDI. Ersättandet av 1a till 2A (panel e) för att ersätta 2A (panel e) förändrade inte inaktiveringen av A1C,IS-IV-kanalströmmen, vilket tyder på brist på differentiell modulering av subenheten,medan samimmunutfällningsanalysen (panel b) gav direkta bevis för associering mellan a1C, IS-IV och 2a.
sammantaget tyder resultaten som presenteras i Figur 3 på att det finns ett korssamtal mellan ADSI, CBD och sackaros, som stöds av direkta interaktioner mellan dem och/eller specifik konformationell vikning av beståndsdelarna i polypeptidbunten som ligger bakom poren. I själva verket demonstrerades både växelverkan mellan Macau och CBD och betydelsen av funktionell konformation direkt i levande celler som uttryckte rekombinant Cav1.2.
3.3. Roll av A1c C-tail Folding
kvantitativ spänningsberoende FRET-mikroskopi kombinerad med patchklämma i den levande cellen visade att A1C-subenheten C-terminal svans är föremål för reversibla spänningsgrindade konformationella omarrangemang . Förankringen av A1C C-svansen till plasmamembranets inre broschyr via pleckstrin homology (PH)-domänen smält till C-änden av a1C (a1C -) avskaffade denna konformationella omläggning och hämmade både SI och CDI(Figur 4 (A)) på ett sätt som mycket liknar det som observerats med A1C,IS-IV(Figur 3 (C)). Denna modifiering som begränsar rörligheten för A1C-karboxylterminalen hade stor implikation på Ca2 + – signaltransduktion. CREB-beroende transkriptionsaktivering associerad med aktiviteten hos Cav1.2 undertrycktes fullständigt trots robust genererad av den ”C-förankrade” kanalen som svar på depolarisering. Frisättning av a1C C-tail genom aktivering av PIP2 hydrolys vid aktivering av fosfolipas C återställer fullständigt alla dessa bristfälliga funktioner, inklusive SI, CDI, och den effektiva kopplingen av till CREB-beroende transkription . Således är det specifik funktionell vikning av a1C C-terminal svans som är avgörande för inaktivering. Det är avgörande för signaltransduktion eftersom den är utformad för att bur den genomträngande Ca2+ i Kam fäst vid CBD och för att effektivt flytta denna bur Ca2+ till nedströms signalmål associerade med CREB-beroende transkription eller hjärtmuskelkontraktion . Framför allt sker denna funktion i tät samordning med extracellulära stimuli som aktiverar kanalen. När det gäller signaltransduktion är SI ett lås på insidan av kanalen som frigörs av den genomträngande Ca2+ för att påskynda dess stängning och initiera rörelsen hos C-terminalsvansen .
3.4. A1C N-Terminusens Roll
alla funktioner som nämns ovan beror också på integriteten hos a1C N-terminalen. Inaktiveringsegenskaperna hos den rekombinanta kanalen A1C/megapixel2/megapixel2 förändras inte kraftigt genom strukturella förändringar av den proximala delen av A1C N-svansen, till exempel genom fusion av ett fluorescerande protein, genom PH-domän eller genom alternativ skarvning av exoner 1/1a som genererar den långa isoformen av a1C . Den allra första funktionella analysen av effekten av partiell deletion av A1C N-terminalen visade att den är involverad i inaktivering medan sackaros förhindrar inhibering av kanalen av n-svansen. Med hjälp av FRET-mikroskopi i kombination med patchklämma fann vi att inaktivering orsakar stark ömsesidig omorientering av a1C-och askorbi1a NH2-termini, men deras avstånd gentemot-Kazaki-vis plasmamembranet förändras inte märkbart . Denna relativa brist på rörlighet ges av Macau på ett sätt som underlättar kanalens svar på spänningsgrind. Experiment på frikoppling av A1C-subenheten N-terminal svans från regleringen av kanalen utfördes i frånvaro av XXL. Förankring av A1C N-tail i plasmamembranets inre broschyr via bifogad PH-domän skapade förhållanden när PHN-a1C och 2CB var tillräckliga för att generera en robust inåtström (Figur 4(B)). Denna kanal berövas emellertid CDI och eventuell spänningsberoende inaktivering. Faktum är att varken Ba2 + eller Ca2 + ström har visat märkbart förfall (se överlappade spår). Frisättning av a1C N-tail vid PIP2-hydrolys genom aktivering av fosfolipas C inhiberade fullständigt den kanal som är bristfällig . Liknande egenskaper, förutom en mycket långsammare aktivering av strömmen, observerades vid radering av hela (men 4 aminosyror) N-terminal svans av a1C (Figur 4(C)). Med endera typen av koppling av a1C N-terminalsvansen-antingen genom en radering eller genom PM—förankring,-verkar en fördröjning i aktiveringen av helcellsströmmen vara associerad med förlängning av den första latensen. Singelkanalinspelningar avslöjade att radering av N-svansen i huvudsak stabiliserade det öppna tillståndet för USPL-A1C/uspl2 uspl-kanalen, som visade längre öppningar under långvarig depolarisering .
således förmedlas CDI av CBD-determinanter för a1C C – svansen, av ADSI i den cytoplasmiska porregionen och genom vikningen av a1C C-och N-termini. Calmodulin integrerar dessa determinanter, vilket ger en Ca2 + – beroende omkopplare som avslutar långsam inaktivering, frigör a1C C-svans och skyttlar tillhörande Ca2+/kalmodulin som fungerar som en aktiverande stimulans av Ca2+ – signaltransduktion .
3,5. Uttryck och Inaktivering av Cav1.2 i Avsaknad av β och α2δ
Är β och α2δ-underenheten är väsentliga för den funktionella uttryck för Cav1.2-kanal? Analys av effekter av exogena CaM (CaMex) om uttryck och egenskaper Cav1.2 i avsaknad av antingen β eller α2δ tydligt visat att varken beta eller α2δ är viktigt. Överuttryck av CaMex modifierar endast något spänningsgrinden för A1C/aug / 2D / ug / 2 kanal genom att förskjuta spänningsberoendet för aktivering och inaktivering mot mer negativa potentialer, underlätta (men inte accelerera) inaktivering och öka densiteten på ungefär 2 gånger . CDI behålls, vilket framgår av effekten av ersättning av Ca2+ för Ba2+ som laddningsbärare som signifikant ökade tidsförloppet för inaktivering av strömmen (Figur 5(A)). Ny förståelse för de olika rollerna av β och α2δ kommer med konstaterandet att CaMex gör uttryck och aktivitet av hba1c kanal i avsaknad av β (Figur 5(B)) eller α2δ (Figur 5(C)), men inte båda dessa extra subenheter. Även om CaMex är strukturellt relaterade till β och α2δ, stöder handel, CDI, och kanal slussning. Kvantitativ analys visade att CaMex inte stimulerade omfördelning av a1C i PM över cytoplasman, men signifikant förbättrad plasmamembraninriktning av A1C/2CU-kanaler. Å andra sidan förstärkte CaMex inte den relativa fördelningen av kanalerna A1C/aug/2D och A1C/2D / 2D / 2D i plasmamembranet över cytoplasman. Beroende på den hjälpsubenhet som finns, är CaMex-stödd kanalaktivitet för a1C/2D och A1C/2D under kontroll av olika mekanismer. Trots detta uppvisar de CaMex-underlättade, enkel-hjälp-subenhetskanalerna ganska liknande egenskaper inklusive signifikant långsammare inaktiveringskinetik av kalciumströmmen och en stark förskjutning av spänningsberoendet av aktivering och inaktivering mot mer negativa potentialer. I likhet med de konventionella kanalerna A1C/2DC/2dcc2, behåller dessa kanaler CDI och hög känslighet för kalciumkanalblockerare av dihydropyridin . Emellertid visar endast kanalen A1C/Macau / CaMex underlättande av kalciumströmmen genom stark depolarisationsprepuls (data visas inte).
eftersom CaM associerad med CBD är involverad i CDI är det uppenbart att effekten av CaMex medieras av olika CaM-bindningsställen. En av de potentiella kandidaterna på en sådan plats är närvarande i den distala delen av a1C N-terminalsvansen . Det återstår att se om denna webbplats verkligen spelar en integrerande roll i det regulatoriska buntet av flera molekylära determinanter som stöder Cav1.2-inaktivering. En annan möjlighet begränsar Camexs roll till aktiveringen av silent Cav1.2 inom de stora klustren, där begränsad lokal tillgänglighet av CaM kan vara orsaken till den låga fraktionsaktiviteten som beskrivs i avsnitt 2.5. Oavsett vilka mekanismer som är förknippade med reglering av Cav1.2 av CaM är, verkar de ha liten praktisk implikation för användning i medicin just nu eftersom CaM är en allestädes närvarande och multifunktionell peptid som reglerar många andra cellulära funktioner, medan dess närvaro i Cav1.2 är avgörande för CDI.
4. -subenhetsmodulering av Cav1.2
anmärkningsvärd molekylär variabilitet hos subenheter i enlighet med de förändrade inaktiveringsegenskaperna hos den differentiellt modulerade Cav1.2, som exemplifieras i Figur 3(a) (panel e) presenterar en ny möjlighet för utveckling av innovativa metoder för behandling av sjukdomar associerade med Ca2+ misskötsel. Flera nya observationer ger en grund för en sådan optimistisk syn. För det första uppvisar underenheter i enlighet med denna förordning en tendens att bilda homo – och hetero-oligomerer som direkt demonstrerades av en mängd olika biokemiska tekniker i både nativa celler och i rekombinant expressionssystem. Medan en förstoring av homooligomerisering av homooligomerisering signifikant ökar densiteten hos, kan heterooligomerisering av skarvvarianter av 2-2 med andra subenheter av underenheter i 2-2 ändra spänningsberoende och inaktiveringskinetik för Cav1 .2. Den oligomerisering av oligomerisering förmedlas av flera molekylära determinanter och behöver således flera ingrepp som ska hanteras, till exempel i fall av patogen överuttryck av ozon2. Det verkar emellertid vara mer genomförbart att rikta in sig på själva 2: an; molekylär determinant för 2: ans specifika långsamma och ofullständiga inaktivering (se Figur 2 a, panel d) identifierades som den 40-aminosyra C-terminala determinanten (2: ans) som finns i alla 7 kända naturligt förekommande varianter av 2: ans skarv. Frånkoppling av dess Ca2 + -och CaM-oberoende interaktion med CBD(Figur 3 (a), panel a) återvinner inaktiveringsegenskaperna som är karakteristiska för 2B/3B2-modulerad Cav1.2 uppvisar snabb och fullständig inaktivering av , som det visades i borttagningsexperiment. Enligt min åsikt är en sådan selektiv frikoppling av 2ced från bindning till dess receptor i CBD en ny attraktiv strategi för att hantera Ca2+ överbelastning eftersom andra underenheter i 2CN inte ska påverkas. Dessutom kommer ett korssamtal mellan Cav1.2 och närmaste mål Ca2+/CaM-beroende proteinkinas II att bevaras.
5. Slutsatser
detta dokument har visat att vi vet hur man påskynda inaktivering av Cav1.2 till mindre än 10 ms (Figur 3(C)), att beröva den från inaktivering helt (figurerna 4(B) och 4(C)), eller för att eliminera beroendet av dess uttryck från exporten eller exporten2, utan betydande konsekvenser för inaktivering. Vi skisserade de ultimata rollerna för A1C termini och CaM för inaktivering, och ändå har ingen av dessa studier fört oss närmare det ultimata målet att hantera kalciummisshandel i samband med Cav1.2 förutom gamla och tyvärr inte alltför selektiva kalciumkanalblockerare. Det enda nya genomförbara målet är patogen 2-modulering av cav1.2, där effektor-receptorinteraktion etableras.
När det gäller molekylärbiologi är Cav1.2 säkert bland de mest komplicerade regleringssystemen som är kända. Anmärkningsvärd molekylär mångfald av var och en av Cav1.2-beståndsdelar ger upphov till flera genetiska/skarvvarianter av kanalen som är föremål för segregering i stora och olika kluster och till kontinuerlig funktionell förändring genom homo – och hetero-oligomerisering av bisexuell och andra signalkomponenter, för att inte tala om art, vävnad och utvecklingsvariation. Vi är förvånade över redundansen av egenskaperna hos flera Cav1 .2-isoformer och är ännu mer förvånade när några av dem, som bara visar ”konventionella” elektrofysiologiska egenskaper, visar sig vara associerade med en sjukdom. När vi letar efter en förklaring bör vår insikt inte intuitivt fokuseras bara på egenskaperna hos kalciumströmmen-spänningsberoende, amplitud och varaktighet. Slutresponsen , såsom rumslig och tidsmässig organisation av CREB-signaleringshändelser associerade med specifik Cav1.2-isoform, och dess konkurrens med andra (t.ex.cAMP-beroende) signalmekanismer eller andra Cav1.2-isoformer närvarande, kan ge nya tankar och öppna nya gränser för undersökning av rollerna för enskilda Cav1. 2-skarvvarianter i normala och sjuka celler och vävnader.
Abbreviations
| ADSI: | Annual determinant of slow inactivation |
| CaM: | Calmodulin |
| CBD: | Calmodulin-binding domain |
| CDI: | Ca-dependent inactivation |
| ECFP: | Enhanced cyan fluorescent protein |
| EYFP: | Enhanced yellow fluorescent protein |
| FALI: | Fluorophore-assisted light inactivation |
| FI: | Fast inactivation |
| FRET: | Fluorescent resonance energy transfer |
| GFP: | Green fluorescent protein |
| SI: | Slow voltage-dependent inactivation. |
