resultat och diskussion

HANCs härstammar från huvud Epidermis och kräver lb-genfunktion. Tidigare studier (5, 11, 17, 19) har beskrivit rollen av lb-gener i cellödespecifikationsprocesser. I Drosophila har vinst och förlust av funktionsexperiment visat att lb-gener specificerar identiteten hos en delmängd av hjärt-och muskelceller och att denna funktion är resultatet av det mycket begränsade, härstamningsspecifika mesodermala uttrycket av lb. Dessutom exakt analys av lbe (Fig. 1) och LBL (data visas inte) uttrycksmönster vid början av hjärtfusion avslöjade ett triangulärt kluster av lb-positiva celler belägna precis framför hjärtat (Fig. 1 A, pilspets). För att producera en mer exakt beskrivning av positionen för dessa celler med avseende på hjärtassocierade lymfkörtlar och ringkörtlar, vi dubbelmärkta embryon för lb och specifika körtelmarkörer (Fig. 1 B och C). Lymfkörtelprekursorerna avslöjade med anti-Ormantikropp flankerar vardera sidan av hjärtspetsen (Fig. 1B) men överlappa inte med området märkt av lb. På samma sätt visar den dubbla färgningen av L (2) 1857 enhancer trap line, som specifikt uttrycker LacZ i den embryonala primordia av ringkörteln (15), att lb-positiva celler är belägna omedelbart framför ringkörteln (Fig. 1C).

för att bestämma ursprunget för hjärtassocierade lb-positiva celler följde vi lb-uttrycket i den främre delen av embryona från tidigt stadium och framåt. Vid de embryonala stadierna som föregår hjärtfusionen kunde vi inte upptäcka lb-uttryck associerat med den främre delen av två hjärt primordia. Detta resultat föreslog att de lb-positiva cellerna inte ursprungligen specificerades i hjärtområdet och kan representera celler av olika ursprung som blir associerade med hjärtcellerna i senare skeden. I slutet av steg 11, en grupp lb-positiva celler i dorsalhuvudets epidermis (Fig. 2A) kan detekteras. Dessa celler börjar invaginera något senare och bildar den ledande delen av vikta epidermis (Fig. 2B). Positionen och tidpunkten för denna invagination liknar en vikning av huvud epidermis, vilket ger upphov till den bakre delen av dorsalpåsen som kallas frontal sac (20). För att kontrollera om lb-Uttryckande celler motsvarar spetsen av frontal sac, använde vi escargot-LacZ linje N516 som uttrycker lacZ i dorsala påsbildande celler (20). Dubbla fläckar i steg 14 (Fig. 2B) och steg 16 (Fig. 2C) N516-embryon som använder anti-Lbe-och anti-Kazakiska-galaktosidasantikroppar visar tydligt att lb och esg samuttrycks i spetsen av invaginerande frontalsäck. En ryggvy av den embryonala huvudregionen (Fig. 2D) bekräftar att dessa celler visar samma triangulära arrangemang som de hjärtassocierade lb-positiva cellerna som tidigare visats (jämför fikon. 2D och 1).

sammantaget indikerar dessa data att de lb-Uttryckande cellerna som ligger omedelbart framför hjärtat härstammar från huvud epidermis och migrerar mot hjärtspetsen under frontal sac invagination. Denna observation väcker en ytterligare fråga angående lb-genernas roll i specifikationen för denna grupp av celler. Vi har tidigare visat att lb-gener spelar en viktig roll i specifikationen av en delmängd av hjärt-och muskelprekursorer (11, 19). Funktionell analys av musen lb ortholog lbx1-genen (21, 22) har också avslöjat dess implikation i kontrollen av specifikation och riktad migration av appendikulära muskelprekursorer. Dessutom indikerar de senaste uppgifterna att Lbx1 hos möss specificerar en subpopulation av hjärtneural crestceller som är nödvändiga för normal hjärtutveckling (23).för att testa om Drosophila lb krävs för specifikationen av hjärtassocierade celler har vi analyserat dorsalpåsbildning i embryon som är bristfälliga för båda lb-generna (se material och metoder). Med hjälp av esg RNA-sonden som markör visade vi att i lbdef-embryon är esg-uttrycket i den distala delen av frontalsäcken som bär de hjärtassocierade cellerna frånvarande (jämför Fig. 2 E och G med F och H). Dessutom, som visas av de dorsolaterala vyerna av Stadium 14 embryon (Fig. 2 G och H), avståndet mellan gulesäcken och de mest distala esg-positiva cellerna förstoras signifikant i lb-bristfälliga embryon. Detta resultat, som stöds av Nomarski optics observation som avslöjar att den bakre delen av frontalsäcken har förändrat morfologi (data visas inte), indikerade att HANCs inte specificeras eller inte migrerar ordentligt i lbdef-embryon. Eftersom den analyserade bristen också täcker intilliggande BAP-och C15-gener testade vi frontal sac-bildning i BAP-mutanta embryon och Arm-GAL4>UAS-RNAiC15-embryon. I både bap208-och rnaic15-embryon var den esg-färgade frontalsäcken av normal form (data visas inte), vilket utesluter påverkan av BAP-och C15-gener på differentiering eller migration av hjärtassocierade celler. Dessa data tyder starkt på att det onormala mönstret av distala esg-positiva frontala säckceller i lbdef-embryon är resultatet av förlusten av lb-funktion.

mesodermala och Nonmesodermala komponenter som är involverade i mönstret av Hjärtutflödesregionen. Våra immunfärgning experiment visade att de hjärtförankrande lb-positiva cellerna ligger mycket nära de lb-Uttryckande kardioblasterna (Fig. 1). Eftersom de mest främre kardioblasterna uttrycker tenn (5), vi dubbelmärkta embryon med anti-tenn och anti-Lbe-antikroppar för att visualisera respektive positioner i hjärtspetsen och den mest distala delen av frontalsäcken. Överraskande överlappar dessa två strukturer med cirka tre celllängder när de observeras från ryggsidan (Fig. 3A). Dessutom är den laterala konfokala vyn av den främre hjärtregionen (Fig. 3B) visar tydligt att spetsen på frontalsäcken, som består av icke-meso-dermala lb-Uttryckande celler, är direkt fäst vid hjärtat. Mer exakt observerade vi att den främre delen av aortan (delvis överlappande de hjärtassocierade lb-cellerna) böjer sig ventralt och bildar ett morfologiskt distinkt område som motsvarar hjärtutflödesregionen. Denna morfologi antyder att det kan finnas en ytterligare cellulär komponent som gynnar ventral böjning av hjärtat. Vi bestämde oss för att leta efter närvaron av en ventralt placerad muskel fäst vid aortas spets. Sidovy av embryot, dubbelfärgad för myosin tung kedja (Myo) och Lbe (Fig. 3C), visar tydligt att hjärtutflödet verkligen är fäst vid en huvudmuskel, som vi föreslår att kalla COM. Mer exakt analys av de konfokala sektionerna avslöjade att hjärt-primordiet faktiskt är kopplat av två nära liggande COMs som sträcker sig från matstrupen och fäster vid vardera sidan av hjärtutflödesregionen (öppna pilhuvud i Fig. 3D). Överraskande har dessa embryonala huvudmuskler inte beskrivits tidigare till vår kunskap. Bristen på publicerad dokumentation för COMs beror förmodligen på att morfologin och ursprunget för somatiska huvudmuskler i Drosophila-embryot inte har analyserats systematiskt. Med hjälp av den enda tillgängliga beskrivningen av vuxenhuvudmuskulatur gjord av Miller (24) kunde vi inte identifiera vuxna huvudmuskler som kan motsvara de embryonala COMs som presenteras här.

intressant visade Myo / Lbe dubbelfärgning också att de icke-meso-dermala Hancsna är fästa vid båda hjärtcellerna (Fig. 3E) och COMs (Fig. 3D). Eftersom HANCs uttrycker lb och associerar selektivt med det mest främre lb-positiva paret av hjärtceller (Fig. 3e och 4 D–F) spekulerar vi i att etablering av denna kontakt kan innebära homofila cellinteraktioner. Testning av celladhesionsmolekylerna involverade i intercellulär signalering mellan homotypiska celler (25, 26) hjälper till att definiera mekanismer som ligger till grund för upprättandet av anslutning mellan lb-Uttryckande HANCs och hjärtceller.

för att visualisera det rumsliga arrangemanget av spetsen av aorta, COMs och lb-Uttryckande HANCs använde vi datorassisterad 3D-analys och rekonstruktion av konfokala skanningar. Detta tillvägagångssätt bekräftade fullständigt våra observationer som avslöjade att förutom HANCs är hjärtutflödesregionen tätt fäst vid ett par COMs (Fig. 3F). Dessa muskler överlappar hjärtans spets från båda sidor och bidrar till dess ventrala böjning.

för att förstå hur kontakten mellan hjärta, COMs och HANCs etableras under utveckling övervakade vi dessa strukturer i tidigt och sent stadium 14 embryon (Fig. 3 G och H). Våra data indikerar att både de lb-positiva hjärtcellerna och lb-Uttryckande hancs lockar förlängande COMs.

kontakten mellan COMs och HANCs verkar något före COMS fastsättning på aortas spets och ses i början av steg 14 (Fig. 3G). Vid den tiden sträcker sig COMS fillopodia i riktning mot lb-positiva hjärtceller (Fig. 3G) och blir definitivt fäst vid dessa celler i sent stadium 14 vid början av hjärtfusion (Fig. 3H). Eftersom COMs kommer i kontakt med hjärtceller och HANCs innan HANCs blir knutna till hjärtat, spekulerar vi att COMs, förutom att böja spetsen av hjärtat, underlättar kontakten med HANCs. Etableringen av kontakt mellan somatiska muskler och deras epidermala bindningsställen (senceller) har studerats omfattande (27), vilket avslöjar nyckelrollen för zinkfingertranskriptionsfaktorremsan (28) och ett RNA-bindande protein How (29). Vi har använt båda dessa markörer för att testa om HANCs och hjärtceller till vilka COMs fäster visningsegenskaper hos senliknande celler. Dubbel märkning utförd på WT-embryon med anti-Lbe/Anti-Stripe och på hur-lacZ-embryon med anti-Lbe/Anti-LacZ-antikroppar avslöjade att HANCs och de kontaktande hjärtcellerna inte uttrycker sencellsmarkörer (data visas inte). Detta resultat indikerar att lb-positiva celler lockar COMs genom att använda en mekanism som skiljer sig från den som används av senceller. De mest intressanta kandidaterna för att styra COMs är den utsöndrade proteinslitsen som har multipelproteinbindningsmotiven och dess receptorer Robo och Robo2 (30). Slit och Robo framkom nyligen som pivotala komponenter som styr attraktion och repulsionsprocesser under morfogenes av somatiska muskler (31), vilket tyder på att de också kan vara inblandade i Com-attraktion.

de mest främre lb-Uttryckande hjärtcellerna spelar en Central roll i mönstret av Hjärtutflödesregionen. Observationen att både COMs och Hancs valde att fästa vid de mest främre lb-positiva hjärtcellerna fick oss att testa om avregleringen av lb-uttryck i hjärtat kan påverka mönstret i hjärtutflödesregionen. För att utföra detta test använde vi Gal4 / UAS-targeted expression system (16). Två olika GAL4-effektorlinjer, 24B-GAL4 och Tin-GAL4, användes (Fig. 4 A och C). 24B-GAL4-linjen möjliggör riktat uttryck i alla hjärt-och muskelceller (Fig. 4A) med en enhetlig och hög uttrycksnivå i de mest främre hjärtcellerna (pil i Fig. 4A). Tin-GAL4-linjen (vänligen tillhandahålls av R. Bodmer) inducerar uas transgenuttryck selektivt i fyra kardioblaster i varje hemisegment (dessa inkluderar de lb-positiva cellerna), men induktionsnivån i de mest främre hjärtcellerna är lägre (pil i Fig. 4C) än den för 24B-GAL4-linjen. För att utöka hjärt-lb-uttryck har båda GAL4-effektorlinjerna korsats med UAS-lbe-linjen. Det ektopiska lb-hjärtuttrycket som drivs av Tin-GAL4-linjen var svagare än det endogena lb-uttrycket i hjärtat, och inga uppenbara förstärkningsinducerade förändringar i mönstret i hjärtutflödesregionen har observerats (data visas inte). Däremot visade 24B-GAL4>uas-lbe-embryon markant expansion av lb-uttryck i hjärtat (Fig. 4G), vilket leder till onormal kontakt av COMs med spetsen av hjärtat. Mest exakt fann vi att COMs fäster direkt på de mest främre hjärtcellerna som bildar hjärtutflödet (asterisk i Fig. 4G) och inte till det andra paret av hjärtceller som i WT (Fig. 4D). Den förändrade anslutningen av COMs beror troligen på de ektopiska attraktiva signalerna som genereras av det förstorade hjärtuttrycket av lb. Som en konsekvens var den ventrala böjningen av den främre delen av hjärtat mer uttalad (jämför Fig. 4 D och G). Vi har också märkt en förändrad morfologi av COMs (open arrowhead i Fig. 4 D och G), vilket kan bero på det 24B-GAL4-drivna ektopiska muskeluttrycket av lb. Kontakten mellan hancs och hjärtceller påverkades inte av de experimentella feluttrycksförhållandena. För att testa om hjärt-lb-uttryck krävs för attraktion av COMs, utnyttjade vi det tidigare beskrivna negativa regulatoriska inflytandet av jämnt hoppat (eve) som specifikt kan undertrycka lb i hjärtceller (5). Återigen användes 24B-GAL4 och Tin-GAL4-effektorlinjerna för att driva eve-uttryck i hjärtat. Vi fann att båda dessa förare korsade med UAS-eve-linjen (Tin-GAL4 med lägre penetrans) leder till förtryck av lb-aktivitet i hjärtat (Fig. 4 H och I). Trots felspecifikationsfel bildas hjärt primordia normalt i uas-eve vinst av funktionsembryon (ref. 5 och Fig. 4B), så att vi kan övervaka COMs och HANCs i ett sammanhang där hjärtuttryck av lb är utarmat. Våra data visar att i sådana lb-utarmade embryon (se frånvaron av hjärt-lb-uttryck i Fig. 4 H och I) COMs fäster inte på hjärtans spets. Vi observerade att COMs sträckte sig framåt och fäst vid invaginerande HANCs (Fig. 4 H och I), som inte längre kan förankra hjärtspetsen ordentligt. Den huvudsakliga com-grenen som normalt fäster vid hjärtutflödesregionen (jämför Fig. 4 E och F med H och I) var frånvarande eller smält med HANC-fästa gren. Således tror vi att den onormala formen av COM och en fullständig förlust av dess kontakt med hjärtans spets orsakas av hjärt-lb-utarmning. Detta antagande stöds av det faktum att samma fenotyper observerades i embryon med ektopisk hjärt (Tin-GAL4-driven) och hjärt plus muskulär (24B-GAL4-driven) uttryck av Eva (jämför Fig. 4 H och I). Den förändrade kontakten och positioneringen av COMs uppträdde i sent stadium 14 embryon när myosin tung kedja ännu inte kan detekteras i kardioblaster (Fig. 4 E och H). Analysen av embryon i steg 15 avslöjade dessutom att förlusten av hjärt-lb-uttryck åtföljs av nedregleringen av 03-tubulin (jämför Fig. 4 F och I) i hjärtutflödesregionen, vilket indikerar att lb-uttryck i hjärtat har en viktig inverkan på slutlig hjärtmorfogenes. Dessa data kompletterar de senaste rapporterna som beskriver morfogenetiska roller hos en COUP-TF-receptorfamiljemedlem, Seven-up, uttryckt i det bakre paret av kardioblaster i varje segment och krävs för bildandet av ostia i buksegmenten A5–A7 (32, 33). I detta sammanhang ökar demonstrationen av lb: s roll i mönstret av hjärtutflödesregionen en möjlighet att i buksegment lb spelar en liknande roll för att upprätta kontakt mellan hjärtceller och hjärtförankringsmusklerna. Denna hypotes återstår att undersöka.

dessutom presenteras fenotyperna (Fig. 4) föreslå att lb-uttrycket experimentellt utarmat i hjärtat påverkar utsläpp eller mottagning av attraktiva signaler av hjärtceller och leder följaktligen till störningen av kontakten med COMs. Samma eller liknande muskeltilldragande kommer sannolikt att produceras eller tas emot av lb-positiva HANCs, vilket tyder på att lb reglerar uttryck av gener som är involverade i cell–cellkontakt. Intressant, i mus lb-homolog, visade sig lbx1-genen vara nödvändig för riktad migration av en delmängd av muskelprekursorer (21, 22), vilket indikerar att de konserverade cellrörelsemekanismerna kan existera som styrs av lb-gener.tillsammans, genom analys av embryon där hjärt-lb-uttryck utvidgades eller experimentellt utarmades, har vi visat att lb krävs för korrekt fastsättning av HANCs och COMs och följaktligen för korrekt mönstring av hjärtutflödesregionen. Detta resultat ger insikter i funktionell betydelse av anterior-posterior diversifiering av hjärtprekursorer inom varje segment av Drosophila-hjärtat.

kan HANCs representera en Drosophila prototyp av neurala Crestceller? Vertebrathjärtmorfogenes involverar två olika celltyper, mesodermal hjärta primordia och en subpopulation av neurala vapenceller som migrerar från huvudregionen. I den här artikeln har vi visat att i Drosophila bidrar en grupp icke-mesodermala celler som härrör från huvud epidermis (som vi har namngett HANCs) till den slutliga morfogenesen i hjärtat. Liksom i ryggradsneural crest-celler genomgår hanc: erna riktade rörelser, kommer i kontakt med hjärtceller och deltar i mönstringen av hjärtutflödesregionen. Vi har visat att homeobox-generna lb som är kända för att vara involverade i diversifiering av hjärtprekursorer (5, 11) uttrycks i HANCs och krävs för deras specifikation. På samma sätt har orthologen av lb, lbx1-genen, nyligen visat sig vara nödvändig för specifikationen av en delmängd av hjärtneural crest-celler i mus (23), vilket indikerar att lb/Lbx1-gener spelar en bevarad roll i specifikationen av icke-meso-dermala komponenter i hjärtat. I denna uppfattning kan HANCs verkligen jämföras med ryggradsdjur neurala crest celler. Men våra data indikerar också att HANCs visar minst två funktioner som endast är specifika för Drosophila: (i) de rör sig som en del av vikta Huvud ectoderm och inte som delaminerade neurala crestceller; och (ii) de bildar ett funktionellt komplex med COMs, som inte har några homologa strukturer hos ryggradsdjur. Således krävs ytterligare analyser för att belysa den exakta rollen för HANCs och deras potentiella neurala vapencellliknande funktioner.