Abstract
det ökande trycket i det moderna sociala livet intensifierar effekterna av stress på utvecklingen av hjärt-kärlsjukdomar, som inkluderar djup venös trombos (DVT). Renal sympatisk denervering har tillämpats som en av de kliniska metoderna för behandling av läkemedelsresistent hypertoni. Dessutom har det nära sambandet mellan oxidativ stress och hjärt-kärlsjukdomar dokumenterats väl. Denna studie är utformad för att undersöka mekanismen genom vilken det renala sympatiska nervsystemet och oxidativ stress påverkar blodkoagulationssystemet vid utvecklingen av DVT. Kronisk fotchockmodell hos råttor applicerades för att efterlikna ett tillstånd av fysiologisk stress som liknar människor. Våra resultat visade att kronisk fotchockprocedur kan främja DVT som kan vara genom aktivering av trombocytaggregation. Förvärringen av DVT och aktivering av blodplättar lindrades genom renal sympatisk denervering eller antioxidant (Tempol) behandling. Samtidigt kan denerveringsbehandlingen också minska nivåerna av cirkulerande oxidationsfaktorer hos råttor. Dessa resultat visar att både det renala sympatiska nervsystemet och oxidativ stress bidrar till utvecklingen av DVT som svar på kronisk stress, vilket kan ge ny strategi för behandling av kliniska DVT-patienter.
1. Inledning
djup venös trombos (DVT) är en vanlig kardiovaskulär sjukdom associerad följder, lungemboli, som är den tredje vanligaste dödsorsaken från hjärt-kärlsjukdomar efter hjärtinfarkt och stroke. Ett långsamt blodflöde, skador på venväggen och ett hyperkoagulerbart tillstånd är de tre huvudsakliga riskfaktorerna för DVT-utveckling. Följaktligen är antikoagulantia och trombolytika de två huvudbehandlingarna för kliniska DVT-patienter. Triaden av riskfaktorer som predisponerar för trombbildning, postulerad av Virchow, innefattar förändringar i förhållandet mellan blodkomponenter, kärlväggens integritet och blodflödeshastigheten. Blodkoagulationssystemet spelar en nyckelroll för att skydda däggdjur mot dödlig blödning. I alla former av trombos är koagulering och inflammation de två huvudvägarna som verkar tillsammans för att samordna kroppens svar på skada .
under de senaste decennierna har psykologiska faktorer, såsom stress och depression, erkänts som viktiga faktorer som påverkar människors hälsa . Långa perioder av ångest kommer att inducera utvecklingen av hjärt-kärlsjukdomar. Dessutom, genom att inträffa samtidigt, kommer depression och ångest att förvärra utvecklingen av hjärt-kärlsjukdom ytterligare. Dessutom har stress och andra psykologiska faktorer visat sig vara nära relaterade till förekomsten av stroke och hjärtinfarkt . Många studier har också visat att stress kan orsaka långvarig strukturell skada på vävnader och organ . Den kroniska elektriska fotchockproceduren har karakteriserats som en modell av okontrollerbar och oförutsägbar psykologisk stress , vilket har visat sig kunna inducera ökning av systoliskt blodtryck . Det finns dock fortfarande ingen rapport relaterad till effekterna av kronisk chock på utvecklingen av DVT.
rollen av sympatisk njurnerv i utvecklingen av hypertoni har visats i både experimentella och kliniska observationer . Det finns två typer av sympatisk njurnerv: renala afferenta nerver och renal efferent nerv. De afferenta sympatiska fibrerna härstammar från njurarna, och genom att modulera centralt sympatiskt utflöde modifierar de direkt neurogen hypertoni. Samtidigt ökar den efferenta nerven natrium-och vattenretention, stimulerar reninfrisättning och förändrar njurblodflödet . På detta sätt kan både kortsiktigt och långsiktigt blodtryck påverkas av renal sympatisk nerv . Kliniska studier har rapporterat de positiva effekterna av renal sympatisk denervering hos patienter med eldfast hypertoni . Förutom den sänkande effekten av denervering på blodtrycket har ytterligare fördelar också rapporterats vid hjärt-kärlsjukdomar, diabetes, njursvikt , hjärthypertrofi, hjärtsvikt och arytmier . Hypertoni, en viktig riskfaktor för många sjukdomar, kan öka endoteldysfunktion och främja trombos och är också nära relaterad till förekomsten av hjärtkärlsjukdomar . Därför kan renal sympatisk denervering ge ny strategi för förebyggande och behandling av hjärt-kärlsjukdomar under högt stresstillstånd.
nyligen visar experiment att oxidativ stress kan vara ansvarig för förändringen i endotelfunktionen . De ökade reaktiva syrearterna som produceras av vaskulärt endotel och cirkulerande blodkroppar kommer att försämra vasomotoriska och endotelbarriärfunktioner och förbättra trombbildningen . Oxidativ stress befanns också vara en determinant för trombocytaktivering , vilket var riskfaktorn för aterotrombos. Huruvida kronisk stress kan påverka koagulationssystemet genom att öka oxidativ stress är dock fortfarande okänt.
För närvarande kopplar inga rapporter direkt psykisk stress med koagulationssystemet och hjärtkärlsjukdomar. Med tanke på att aktiveringen av koagulationssystemet har ett viktigt inflytande på både fysiologisk hemostas och patologisk trombos , tillämpade vi fotchockstressmodell hos råttor för att undersöka om kronisk kan påverka utvecklingen av DVT och de möjliga mekanismerna som är involverade.
2. Material och metoder
2.1. Djurberedning
tio veckor gamla manliga Sprague-Dawley-råttor, erhållna från Shanghai Laboratory Animal Center, användes i denna studie. Djur upprätthölls i en temperaturkontrollerad miljö på 25 kg C med en 12 : 12-timmars ljus: mörk cykel. Råttor utsatta för stressprotokollet placerades individuellt i en fotstötspänningslåda, där de fick en 4-timmars session med elektrisk fotstöt genom ett elektrifierat gallergolv som levererade en 5-sekunders lång 0,15 mA-chock var 30: e sekund. Råttans renala sympatiska nerv avbröts kirurgiskt medan djur var under en 10% klorhydratinducerad anestesi. Efter en veckas återhämtningsperiod startades fotchockprotokollet. Tempol (10 mg/kg/dag) administrerades genom intraperitoneal injektion efter starten av stressprotokollet . Venös trombos inducerades under bedövade förhållanden med 10% klorhydrat som tidigare beskrivits av Leung . I korthet öppnades buken, och den sämre vena cava (IVC), efter att ha separerats noggrant från de omgivande vävnaderna, ligerades tätt strax under den vänstra njurvenen med en bomullstråd. Sedan stängdes buken med ett dubbelt lager av suturer, stängde bukhinnan med muskler först och sedan huden separat. Efter tolv timmar bedövades djuren igen, buken öppnades igen och plasma och trombus samlades in för vidare analys . Denna studie utfördes i enlighet med den europeiska konventionen om skydd av ryggradsdjur som används för experimentella och andra vetenskapliga ändamål (Europarådet nummer 123, Strasbourg, 1985). Alla kirurgiska ingrepp godkändes av Soochow University och utfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av djur som fastställts av Soochow University.
2.2. Mätningar av Kortikosteronnivåer i Plasma
kortikosteronnivåer i Plasma mättes med användning av ett kommersiellt tillgängligt ELISA-kit (TSZ Elisa, USA).
2.3. Trombviktmätningar
från den återöppnade bukhålan avlägsnades det ligerade segmentet av vena cava och öppnades i längdriktningen för att avlägsna den bildade trombusen, som sköljdes och vägdes på filterpapper.
2.4. Analys av Blodkoagulationsparametrarna
protrombintid (PT), aktiverad partiell tromboplastintid (APPT) och trombintid (TT) mättes med hjälp av en automatiserad blodkoagulationsanalysator (Sysmex Corporation CA-50, Japan). Från den återöppnade bukhålan uppsamlades blod (4,5 mL) från den sämre vena cava med användning av en engångsspruta innehållande 0,5 mL av en 3,8% natriumcitratlösning och överfördes till autoklaverade centrifugrör. Hälften av blodet centrifugerades vid 3000 rpm i 10 min och serumet uppsamlades. En 0,1 mL serumaliquot kombinerades till 0.1 mL PT-reagens. Efter förvärmning i 20 min mättes PT med användning av en automatiserad blodkoagulationsanalysator, som nämnts ovan. APPT och TT mättes med samma metod som PT.
trombocytaggregation mättes med användning av en trombocytaggregeringsanalysator (Chrono-Log 560 Ca, Tyskland). Efter att kaviteten öppnades igen uppsamlades 4,5 mL blod från den nedre vena cava med användning av en engångsspruta innehållande 0,5 mL natriumcitrat (3,8%) och överfördes sedan till centrifugrör. Den andra halvan av blodet centrifugerades vid 1000 rpm i 10 min för att erhålla den blodplättrika plasman. Blodet kvar i röret centrifugerades vid 3000 rpm i 10 minuter för att förbereda den blodplättfattiga plasman. Därefter stimulerades koagulering av plasmaproverna med användning av kollagenprotein och adenosindifosfatdinatrium (ADP) (1 mM, 10 mL) som trombocytaggonister.
2,5. Bestämning av plasmakoncentration av noradrenalin (NA)
plasmanivåer av noradrenalin (NA) mättes med användning av ett kommersiellt tillgängligt ELISA-kit (TSZ Elisa, USA).
2.6. Mätning av Lipidperoxidationsnivåer och Plasma superoxiddismutas (SOD) och glutationperoxidas (GSH-Px) aktivitet
Plasma SOD och GSH-Px aktivitet och lipidperoxidationsnivåer (tiobarbitursyra reaktiva ämnen, tbar) mättes med kommersiellt tillgängliga enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) Kit (TSZ Elisa, USA).
2.7. Statistiska analyser
Alla data presenterades som medelvärdet för sem för den genomsnittliga användningen av denna. Den statistiska signifikansen av jämförelserna mellan mer än två grupper testades med hjälp av en tvåvägs ANOVA följt av Newman-Keuls-testet eller med hjälp av ett oparat två-tailed Student-test. värden < 0,05 ansågs statistiskt signifikanta.
3. Resultat
3.1. Effekt av chock, denervering och Tempolbehandling på Plasmakortikosteronkoncentrationerna
plasmakortikosteronnivåerna (stressmarkören) ökade markant i fotchockgruppen jämfört med kontrollgruppen (, Figur 1) och undertrycktes markant i både denervation plus-chock och Tempol Plus-chockgrupperna jämfört med fotchocken ensam grupp (, Figur 1). Detta resultat indikerade att kronisk fotchock signifikant ökade plasmakortikosteron när kroppen var under stress, och både denervering och Tempolbehandling kunde lindra stresstillståndet.
3.2. Effekt av chock, denervering och Tempolbehandling på vikten av IVC-Ligeringsinducerad trombi
trombi samlades 12 timmar efter IVC-ligering och vägdes. I fotchockgruppen ökade trombusvikten signifikant jämfört med kontrollgruppens (, Figur 2). Trombbilden för denervation plus-chock-och Tempol plus-chockgrupperna förblev emellertid oförändrad jämfört med kontrollgruppens trombi men minskade signifikant jämfört med fotchockgruppen trombi (, Figur 2). Dessa resultat tyder på att kronisk chock kan underlätta bildandet av DVT, medan både denervering och Tempolbehandling kan hämma stressinducerad ökning av DVT-bildning.
(a)
(b)
(a)
(b)
3.3. Effekt av chock, denervering och Tempolbehandling på Blodkoagulationsparametrar
efter blodinsamling från IVC mättes blodparametrar (PT, APPT, TT och trombocytaggregation). Det var en signifikant skillnad i PT -, TT-och trombocytaggregationsparametrarna mellan kontroll-och fotchockgrupperna. PT i fotchockgruppen var lägre än kontrollgruppens; TT-och trombocytaggregationsparametrarna var emellertid högre i fotchockgruppen jämfört med kontrollgruppen. Parallellt observerades en signifikant minskning i TT-och trombocytaggregationsparametrarna för denervation plus chock och Tempol plus chockgrupper jämfört med fotchockgruppen (, Tabell 1 och figur 3). Dessa resultat avslöjar att kronisk chock kan förbättra koagulationssystemet genom aktivering av trombocytaggregation.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PT, prothrombin time; APPT, activated partial thromboplastin time; TT, trombintid; kontra kontrollgrupp; kontra chockgrupp. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.4. Effekt av chock, denervering och Tempolbehandling på plasmakoncentrationerna av noradrenalin (NA)
Fotchock ökade signifikant plasmakoncentrationerna av noradrenalin (NA) jämfört med kontrollgruppen (, Figur 4). Plasma – na-nivåerna i denervation plus-chock och Tempol plus-chockgruppen undertrycktes signifikant jämfört med fotchockgruppen (, Figur 4). Dessa resultat bekräftar framgången med det kirurgiska ingreppet i njuren.
3.5. Effekt av chock, denervering och Tempolbehandling på Plasma SOD-och GSH-Px-aktivitet och på tbar-nivåer
plasma SOD-aktiviteten i stressgruppen reducerades markant jämfört med kontrollgruppen (, Figur 5(A)). Plasma-SOD-aktiviteten i denervation plus-chock-och Tempol plus-chockgrupperna var markant förhöjd jämfört med fotchockgruppen (, Figur 5(A)).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
plasma GSH-Px-aktiviteten i fotchockgruppen var också markant högre än kontrollgruppens (, Figur 5(B)). Plasma-GSH-Px-aktiviteten i denervation plus-chock-och Tempol plus-chockgrupperna var markant förhöjd jämfört med fotchockgruppen (, Figur 5(B)).
fotstöt ledde till en markant ökning av nivåerna av plasma tiobarbitursyra reaktiva ämnen (tbar) jämfört med kontrollgrupp (, Figur 5(C)). Plasma-tbar-nivåerna i denervation plus-chock-och Tempol plus-chockgrupperna undertrycktes markant jämfört med fotchockgruppen (, Figur 5(c)).
4. Diskussion
i denna studie identifierade vi att DVT-bildning underlättas under stressförhållanden och att förändringar i blodkoagulationssystemet induceras av stress. Ackumulerande data har visat att kronisk psykologisk stress aktiverade två system: den ena är hypotalamus-hypofys-binjurebark (HPA)-system som huvudsakligen medierades genom frisättning av katekolamin, kortisol, vasopressin, endorfiner och aldosteron ; den andra är genom aktivering av sympatisk-adrenal medullar system . Som visas i data ökade kortikosteronnivåerna i kronisk chockgrupp signifikant, vilket indikerar att HPA aktiverades. Vad är det sympatiska nervsystemets roll som svar på stress? Eftersom det har visats att aktivering av njursympatiskt system är mycket relaterat till utvecklingen av hypertoni, och njurdenervering är en ny behandling i klinisk för eldfasta hypertonipatienter , måste njursympatiskt system spela en viktig roll i hjärt-kärlsjukdomar. Dessutom visar de senaste observationerna att högt stresstillstånd är mycket relaterat till hjärt-kärlsjukdomar, särskilt hjärt-och hjärninfarkt; därför spekulerar vi om kronisk stress kommer att aktivera koagulationssystemet genom aktivering av renalt sympatiskt nervsystem. I den aktuella studien fann vi först att kronisk stress kan aggregera DVT-bildningen, vilket tyder på att stress kommer att öka risken för hjärt-kärlsjukdomar. Dessutom mätte vi parametrar som definierade aktiviteten i blodkoagulationssystemet, inklusive PT, APPT, TT och trombocytaggregation. Våra data visade att det fanns en signifikant förändring i trombocytaggregation inducerad av både ADP och kollagen vilket tyder på att den försvårande effekten av stress på DVT-bildning medierades genom aktivering av blodplättar. Våra resultat avslöjar först mekanismen som kopplar samman det höga stresstillståndet och hjärt-och kärlsjukdomar. Även om våra nuvarande data tydligt visade rollen av renalt sympatiskt nervsystem i kronisk chockinducerad utveckling av DVT, är det svårt att identifiera om afferent eller efferent nerv spelar en viktig roll på grund av begränsningen av kirurgiskt ingrepp. Vi spekulerar i att båda är inblandade i; Anledningen är att afferent nerv kan påverka neurogen kontroll av blodtryck som kan bidra till utvecklingen av DVT; och efferent nerv kan reglera renal utsöndring av noradrenalin vilket också kan bidra till utvecklingen av DVT.
närvaron av skadat endotel och aktiverade koagulationsfaktorer eller blodplättar underlättar utvecklingen och progressionen av DVT . Trombocytaggregation (dvs när blodplättar klibbar varandra) som uppträder vid ställen för vaskulär skada har länge erkänts som kritisk för trombosutveckling . I den aktuella studien fokuserade vi främst på trombocytfunktion i DVT. Fenomenen trombocytadhesion, frisättning eller aggregering är också kända som trombocytaktivering . Aktiverade blodplättar spelar en viktig roll i trombosprocessen. Våra data visar att trombocytaggregation ökade efter stressbehandling, tillsammans med förbättringen av DVT-bildning. Trombocytantalet användes för att normalisera måttet på trombocytaktivitet; emellertid utfördes ingen statistik över antalet blodplättar i varje grupp.
våra analyser av plasma GSH-Px-och SOD-aktiviteten, liksom plasma-tbar-nivån, visade att kroppen befinner sig i ett tillstånd av oxidativ stress inducerad av kronisk fotchockbehandling, vilket hämmades av renal denervering. Flera rapporter har visat att nad (P)h – oxidasaktivitet kan ökas direkt av receptorerna enligt 1-2 och 2 genom katekolaminerna (CA) som frigörs av den renala sympatiska nerven. Dessutom visade sig receptorantagonister av typ 1 minska den vaskulära oxidativa stressen orsakad av nad (P)h-oxidasaktivering . Därför kan vi säga att den renala sympatiska innervationen direkt ökar oxidativa stressnivåer. Det har rapporterats att trombocytaggregation, en ytterligare riskfaktor för trombus, är associerad med oxidativ stress . Oxidativ stress kan direkt öka trombocytaggregationen genom syrefria radikaler belägna på trombocytytan . Fasta bevis har visat att oxidativ stress direkt kan aktivera blodplättar på olika sätt. Eftersom produkten av oxidativ stress O2-kan reagera med blodplättar eller endotel, har NO härledd från ONOO-, som är av särskild betydelse för vaskulär trombos, också sådana effekter. Flera studier har visat att O2 – kan minska tröskeln för trombocytaktivering till trombin, kollagen eller ADP och O2− kan till och med kunna inducera spontan aggregering . Den aktiverade blodplätten kan till och med producera ROS; rollen för denna endogena ROS liknar exogen ROS vid trombocytaktivering. Generellt finns flera scenarier som leder till stressinducerad trombocytaggregation. I den första aktiveras den renala sympatiska nerven av stress, vilket leder till en ökad oxidativ stress i hela kroppen som sedan följs av en ökning av trombocytaggregation. I det andra scenariot utlöser stress direkt kroppens oxidativa stressproduktion, vilket direkt ökar trombocytaggregationen. Renal sympatisk nervdenervering kan påverka trombocytaktiveringen direkt, men vars mekanism återstår att undersökas.
våra data visade att kronisk stressbehandling inte har någon signifikant effekt på antingen APPT eller PT, vilket tyder på att den stress-underlättade DVT kanske inte är associerad med det yttre eller inneboende koagulationssystemet. Icke desto mindre kan kronisk stressbehandling markant öka TT, vilket indikerar att omvandlingstiden för fibrinogen till fibrin förlängdes på grund av en hyperfibrinolys. Därför spekulerar vi i att fibrinolytisk hyperfibrinolys berodde på en förbättrad blodkoagulering under tillstånd av kronisk stress. Samtidigt kan renal denervering och antioxidantbehandling minska trombocytaggregationen, vilket i sin tur undertryckte blodkoagulering. Baserat på våra data kunde vi observera att TT tenderade mot en normal takt under dessa två förhållanden jämfört med chockgruppen.
det bör noteras att vi i vår nuvarande observation fann att Tempolbehandling kan minska kronisk stressinducerad ökning av kortikosteronnivåer, vilket tyder på involvering av oxidativ stress i Hpa-aktiveringsinducerad hormonfrisättning, vilket indikerar att antioxidantbehandling kan ge några fördelaktiga effekter vid hap-aktiveringsinducerad organskada. Vi hittade emellertid ingen skillnad mellan denervering och antioxidantbehandlingar i några parametrar, vilket indikerar att sympatisk nerv och oxidativ stress oberoende kan bidra till utvecklingen av DVT inducerad av kronisk chock.
Sammanfattningsvis kan kronisk stress öka trombocytaggregationen direkt via aktiveringen av den renala sympatiska nerven och ökningen av oxidativ stress. Sedan underlättas DVT av ökningen av trombocytaggregation. Ett antal studier har visat att åderförkalkning och andra hjärt-kärlsjukdomar är nära förknippade med oxidativ stress och att patienter ofta har låga antioxidantnivåer i blodet och förbättrade nivåer av oxidativa stressmarkörer . Så med tanke på hjärtkärlsjukdomar och DVT kan vi förebygga och behandla dessa sjukdomar genom att rikta in terapin på hormonella och antioxidantnivåer. Utöver detta är det ett nytt sätt att behandla genom renal sympatisk nerv.
intressekonflikt
författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
författarnas bidrag
Guo-Xing Zhang tänkte på och utformade experimenten. Tao Dong, Yu-Wen Cheng, Pei-Wen Sun och Chen-Jie Zhu utförde experimenten. Fei Yang hjälpte till med trombocytaggregation. Guo-Xing Zhang bidrog med reagenser / material och analyserade data. Guo-Xing Zhang, Tao Dong och Yu-Wen Cheng skrev tidningen.
bekräftelser
författarna är tacksamma för Professor Li Zhu och andra medlemmar i Zhu-laboratoriet för experimentell rådgivning och hjälp. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (81270316, 814170563) och forskningsprogrammet för Soochow University (Q413400111).
