Abstrakt
cervicit är en vanlig sexuellt överförbar sjukdom. Under de senaste åren resulterar missbruk av antibiotika vid behandling av cervicit i uppkomsten av antibiotikaresistenta bakterier; alternativa strategier behövs för att utvecklas. I denna forskning undersökte vi effekterna av Feilin Vaginal Gel (FVG), en kinesisk örtformel, vid behandling av cervicit. Två cervicitmodeller optimerades med BALB / c-mus; en in vitro-modell etablerades i HeLa-celler. I Chlamydia trachomatis-inducerad cervicitmodell kunde den höga nivån av bakteriebelastningar, inflammation i vävnad och cytokinerna i serum observeras. Med administrering av FVG kan bakteriebelastningarna i livmoderhalsslem och livmoderhalsvävnad hämmas signifikant i dosberoende sätt. Den patologiska skadan av livmoderhalsen och vagina, liksom nivåerna av IL-2, IL-17 och MCP-1 i serum, kan mildras av FVG. FVG minskade antalet inklusioner inducerade av C. trachomatis i HeLa-celler. Dessutom kan den histologiska skadan i Escherichia coli och Staphylococcus aureus-inducerad cervicitmodell minskas med FVG. Dessa resultat tyder på att FVG kan behandla cervicit genom hämning av patogener och reglering av värdimmunsvar. FVG kan bidra som ett alternativt medel för behandling av cervicit.
1. Introduktion
cervicit är en vanlig sexuellt överförbar sjukdom med ett inflammatoriskt tillstånd i livmoderhalsen . Infektionen av livmoderhalsen börjar från nedre könsorganet (vagina) och utvecklas sedan till bäckeninflammatorisk sjukdom med stigande infektion i övre könsorganet (livmodern och äggledarna) och bukhålan . Cervicit inträffade ofta som en asymptomatisk infektion. Onormal cervikal eller vaginal mucopurulent urladdning och cervikal ektopi kan vara tecken och symtom på cervicit hos vissa patienter . Allvarlig cervicit kan dock leda till ytterligare infertilitet och ektopisk graviditet. Cervicit anses vara associerad med överföring av HIV-infektion och utveckling av livmoderhalscancer .
cervicit kan induceras av olika patogener såsom Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhea, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas, Herpes simplexvirus, cytomegalovirus och adenovirus . C. trachomatis-infektion rapporteras vara den vanligaste orsaken till cervicit. Mer än 10% av kvinnorna med cervicit diagnostiseras vara smittade av C. trachomatis och antalet av dessa infektioner fortsätter att öka under de senaste decennierna . C. trachomatis är gramnegativ obligatorisk intracellulär bakterie. Två former av C. trachomatis finns i dess utvecklingscykel. Fastsättning av elementära kroppar (EBs) till värdceller förmedlar invasionen av C. trachomatis. Inuti värdcellerna bildar C. trachomatis de retikulära kropparna (RBs) och sedan replikerar RBs i den cytoplasmiska vakuolen och bildar slutligen inkluderingen .
klamydia kan kvarstå länge i livmoderhalsen utan symptom. Infektionen kan gå över spontant utan behandling eller kan orsaka cervicit. Clearance av C. trachomatis kräver svar på Th1-immunitet . Svaren på adaptiv immunitet kan emellertid ha en dubbelkantad natur och medföra vävnadsskada. Hanteringen av C. trachomatis-infektion baseras på behandlingen av patienterna och deras sexpartners med makrolider. Missbruk av antibiotika och falskt positiv diagnos kan bidra till uppkomsten av antibiotikaresistenta organismer. De antibiotikaresistenta bakterierna å andra sidan leder till behandlingssvikt . Efter behandling med antibiotikumet kommer 10% -20% av patienterna att drabbas av reinfektion inom ett år, vilket kan bero på frånvaron av skyddande immunitet mot klamydia . Med tanke på dessa villkor behövs alternativa strategier för att utvecklas.
traditionell kinesisk medicin (TCM) har en lång historia vid behandling av gynekologiska sjukdomar . Feilin Vaginal Gel (FVG) är utvecklad från en kliniskt använd kinesisk medicin formel som används för att behandla mucopurulent cervicit. FVG består av följande växtbaserade läkemedel: Det finns en mängd olika typer av sjukdomar. Enligt teorin om TCM: FVG kan användas för att behandla ackumulering av fukt och giftiga material inducerad onormal vaginal urladdning, såsom riklig, fetid och gulaktig leukorrhea, klåda och smärta runt de yttre könsorganen . Extraktionen, beredningen och kvalitetskontrollen av FVG hade studerats. Koncentrationerna av gentiopikrosid och paeoniflorin i FVG analyserades för att vara cirka 5, 90 mg/g respektive 8, 96 mg/g .
i den aktuella studien testade vi hypotesen att FVG kunde behandla cervicit effektivt. Muscervicitmodeller fastställdes för att utvärdera behandlingen av FVG. I C. trachomatis-infekterad musmodell utvärderades bakteriebelastningarna, den patologiska skadan och nivåerna av MCP-1, IL-2 och IL-17 i serum. Inklusionerna i HeLa-celler inducerade av C. trachomatis räknades upp in vitro. Dessutom, efter att ha smittats av blandningen av Escherichia coli och Staphylococcus aureus, utvärderades behandlingen av FVG genom den histologiska undersökningen av livmoderhalsen.
2. Material och metoder
2.1. Beredning av FVG
de sex växtbaserade läkemedlen extraherades tre gånger med kokande vatten och utfälldes med alkohol till 70% (v/v) etanol. Supernatanten koncentrerades med rotationsindunstaren till en relativ densitet av 1,30-1,35 (50 CCB) för att få Feilinutvinningen (FE, 5,62 g/g). Gelbasen var blandningen av karbopol 941 och xantangummi. Extraktionen blandades med gelbasen för att få FVG. Läkemedelsbelastningen av FVG var 2,5 g/g, 1,25 g/G och 0,625 g/g.
2,2. Bakteriestammar och Värd Cell
Chlamydia trachomatis musen pneumonit stam Nigg II (ATCC® VR-123™), Escherichia coli (ATCC® 25922™) och Staphylococcus aureus (ATCC® 25923™) har erhållits från American Type Culture Collection. E. coli och S. aureus odlades i näringsbuljong. Mänsklig livmoderhalsepitelcellinje HeLa (ATCC 2CBCL-2cbcb) köptes från Kultursamling av kinesiska akademin för medicinska vetenskaper och odlades i rpmi 1640-medium innehållande 10% FBS vid 37 cbcb i närvaro av 5% CO2. C. trachomatis n förökades i HeLa-celler. Före infektion stördes infekterade HeLa-celler (105 celler/mL) och centrifugerades. Supernatanten samlades in för att få renade elementära kroppar (EBs), som kan användas för att infektera möss och HeLa-celler direkt.
2.3. Djurinfektioner och behandling
120 kvinnliga BALB / c-möss (18-20 g) köptes från Charles River Laboratories China (Peking, Kina). Djur hölls i en bsl2 barriärdjur anläggning. Alla djurförsök som beskrivs här var med tillstånd av Institute of China Academy of Chinese Medical Sciences, Chinese Materia Medica, Ethic Committee. Referensnumret för etikgodkännande är 20162019.
livmoderhalsvävnaden hos BALB / c-möss skadades med Vinklad nål under anestesi. Möss inokulerades sedan med 50 oc C. trachomatis N eller blandningen av E. coli och S. aureus (109 CFU/mL). Mössen smittades en gång om dagen och upprepades i tre dagar. 24 timmar efter den sista infektionen gavs FVG i musvagina med pipett (volymen FVG kontrollerades noggrant) i dosen 2, 2 g/kg, 1, 1 g/kg och 0, 55 g/kg i 12 dagar. Policresulen suppositorier (PS), som en positiv kontroll, blandades med gelbas och gavs i en dos av 16, 5 mg/kg i 12 dagar. Kontrollgruppen och modellgruppen fick en lika stor volym gelbas. På, och behandlingsdagen uppsamlades livmoderhalsslemet med vattpinnen. På dag 15 bedövades möss, blodprover togs från aorta ventralis och serumet separerades. Möss dödades sedan av cervikal dislokation under anestesi och livmoderhalsen och vagina avlägsnades. Schemat för den experimentella tiden visades i Figur 1.
2.4. ELISA-analys av C. trachomatis N, IL-2, IL-17 och MCP-1
Svabbarna med livmoderhalsslem dispergerades med en lika stor volym PBS, nivån av C. trachomatis N i PBS analyserades med enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Meilian, Shanghai, Kina) enligt tillverkarens instruktion (tillsätt 50 µL av provet och 50 µL av detection antibody till varje brunn och inkubera vid 37°C i 1 timme, tvätta brunnarna, tillsätt 100 µL av HRP konjugatet till varje brunn och inkubera vid 37°C i 0,5 timme, tvätta brunnarna, tillsätt 50 µL av kromatogent substrat till varje brunn, och inkubera vid 37°C i 0,5 timme. tillsätt 50 µL stopplösning till varje brunn; avläs absorbansen för varje brunn vid 450 nm). Nivåerna av IL-2, IL-17 och MCP-1in serum bestämdes av ELISA kit (Meilian, Shanghai, Kina) enligt tillverkarens instruktioner som beskrivits ovan.
2,5. RT-PCR-analys av C. trachomatis n
totalt RNA extraherades från livmoderhalsen med användning av TRIzol (Invitrogen, Kalifornien, USA); uttrycket av målgener analyserades med användning av ett steg SYBR Prime Script RT-PCR Kit II (TaKaRa, Peking, Kina) med Piko Real 96 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Primrarna användes enligt följande: 16S rRNA framåt primer, 5 ’- ACC CGT TGG ATT TGA GCG TA-3’; 16S rRNA omvänd primer, 5 ’- GTT GAG CCC CGA GAT TTG AC-3’; GAPDH framåt primer, 5 ’-GCT GAG TAT GTC GTG GAG T-3′; GAPDH omvänd primer, 5′-GTT CAC ACC CAT CAC AAA C-3’. Det relativa uttrycket av C. trachomatis n-gen och musgen beräknades enligt metoden.
2.6. Histologisk undersökning
musens vävnader fixerades med 10% formaldehyd, inbäddades sedan i paraffin och skars i skivor för hematoxylin och eosinfärgning. Sektionerna utvärderades visuellt av DMLB (Leica Camera AG, Wetzlar, Tyskland); två sektioner bereddes från varje prov. Följande kriterier tillämpades för att betygsätta de patologiska förändringarna.
”-” Cervix och vagina epitel visar ingen hyperplasi och ingen inflammation och vävnader är normala.
”+” Cervix och vagina epitel har mild hyperplasi; bindväv har mild segmentinflammation.
”++” Cervix och vagina epitel har hyperplasi; bindväv infiltrerades av inflammatoriska celler.
”+++” Cervix och vagina epitel har signifikant hyperplasi och var infiltration av inflammatoriska celler; bindvävnad var omgiven av diffus inflammation och vaskulär trängsel.
2.7. Värdcellinfektion och Inklusionsfläck
HeLa-celler såddes i 6-brunnsplatta med densiteten av 2 msk 105 celler/brunn och odlades i 48 h. därefter inkuberades cellerna med C. trachomatis n EBS innehöll medium. Plattan centrifugerades vid 32 C i 1h och odlades kontinuerligt vid 37 C i närvaro av 5% CO2 i 2h. mediet av infekterade celler ersattes med FE (500, 250 och 125 C/mL) innehöll medium och inkuberades under ytterligare 48 h. Därefter tvättades cellerna med PBS, fixerades med metanol och färgades med Giemsa. Inneslutningarna i HeLa-celler fångades av Ix71 (Olympus, Tokyo, Japan) och räknades upp.
2.8. Statistisk analys
statistiska analyser utfördes med användning av GraphPad Prism V. 6 (GraphPad Software, Kalifornien, USA). Alla data distribuerades normalt (Kolmogorov-Smirnov-test). Inklusionsnummer och histologiska poäng analyserades med Mann-Whitney U-testet; andra analyserades med det oparade t-testet. Ett värde på p < 0,05 ansågs vara signifikant.
3. Resultat
3.1. FVG hämmar nivån av C. trachomatis N i livmoderhalsslem
EBs av C. trachomatis gror och bildar RBs efter att ha invaderat värdcellerna. RBs börjar multiplicera efter 7-21 dagar. Enzymimmunanalys är en vanligt använd icke-odlingsmetod för att diagnostisera klamydialinfektion . Vi analyserade nivån av C. trachomatis N i livmoderhalsslem för att utvärdera svårighetsgraden av mössinfektion.
i det tidiga skedet av C. trachomatis n-infektion observerades ingen signifikant förändring av bakteriebelastningen. 10 dagar efter den första infektionen, ökningen av C. trachomatis N hos möss kunde testas. På dagen var nivån på bakteriebelastningen signifikant högre än kontrollgruppen (Figur 2(a)). Med den successiva behandlingen av FVG (2, 2, 1, 1, 0, 55 g/kg) kan nivån av C. trachomatis N hos möss livmoderhalsslem starkt hämmas i dosberoende sätt(figurerna 2(c) och 2 (d)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. FVG hämmar belastningen av C. trachomatis N i livmoderhalsen
vid diagnos av chlamydialinfektion är nukleinsyraförstärkningstekniken inklusive polymeraskedjereaktion (PCR) mer känslig och specifik än enzymimmunanalysen . Därför testade vi vidare belastningen av C. trachomatis N i möss livmoderhalsen med RT-PCR-metoden. På dag 15 var uttrycket av 16s rRNA av C. trachomatis N hos möss signifikant högre än kontrollgruppen (Figur 3). Behandling av FVG (2, 2, 1, 1 g/kg) i 12 dagar kan starkt hämma belastningen av C. trachomatis N i livmoderhalsen (Figur 3).
3.3. FVG minskar C. trachomatis N-inducerad cervicit och vaginit
infektionen av C. trachomatis hos möss är en lämplig modell för att studera könsinfektioner. Infektionen misslyckas med att inducera allvarlig genital patologi i övre tarmkanalen . Patologin för livmoderhalsen och vagina analyserades för att karakterisera svårighetsgraden av C. trachomatis n-infektion.
som visas i Figur 4, i kontrollgruppen var epitelcellerna och bindväven i livmoderhalsen normala, ingen hyperplasi eller inflammation observerades. I modellgruppen har livmoderhalsepitelskikt hyperplasi och de inflammatoriska cellerna infiltrerades i epitel och bindväv. Efter behandling av FVG (1,1 g/kg) kan den patologiska skadan av livmoderhalsen minskas signifikant (Figur 4).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
som visas i Figur 5, i kontrollgruppen var det vaginala epitelet normalt, ingen hyperplasi eller inflammation observerades. I modellgruppen har vaginala epitelskikt hyperplasi och de inflammatoriska cellerna infiltrerades i epitelvävnaden. Efter behandling av FVG (2, 2, 1, 1 g/kg) kan skadorna på vagina minskas avsevärt (Figur 5).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.4. FVG minskar Serumcytokinresponserna från C. trachomatis n-infektion
cytokinerna kan frisättas av epitelcellerna och immuncellerna efter C. trachomatis-infektionen, varav de flesta kommer från Th1-celler. Dessa cytokiner bidrar till immunsvaret men inducerar den patologiska skadan . Nivåerna av cytokin i serum testades för att stödja de histologiska undersökningsresultaten. På dagen var nivåerna av IL-2, IL-17 och MCP-1 signifikant uppreglerade (Figur 6). Tre doser av FVG kan effektivt hämma frisättningen av IL-17 och MCP-1. Produktionen av IL – 2 kan nedregleras av FVG vid låga doser (1, 1 och 0, 55 g/kg).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(C)
3.5. FVG minskar antalet C. trachomatis N-inducerad inklusion In Vitro
proliferationen av C. trachomatis sker i värdcellerna med bildandet av RBs. Inklusion kan bildas ungefär 12 h efter infektion, som innehåller antal RBs . In vitro-hämningen av FVG på infektionen av C. trachomatis N utvärderades med antalet inklusioner. Efter att HeLa-celler inkuberats med C. trachomatis N i 48 timmar kunde inneslutningar observeras med Giemsa-fläcken. Efter behandling med FVG (FE) minskade antalet inklusioner signifikant på ett dosberoende sätt (Figur 7).
3.6. FVG minskar den patologiska skadan av livmoderhalsen inducerad av E. coli och S. aureus
Även Om C. trachomatis rapporteras vara den vanligaste patogenen för cervicit, anaerober som E. coli, S. aureus och Klebsiella pneumoniae kan isoleras hos cervicitpatienterna . En råttcervicitmodell infekterad av blandningen av E. coli, S. aureus och N. gonorrhea hade etablerats i vårt tidigare arbete . I föreliggande forskning optimerades en mössmodell infekterad av blandningen av E. coli och S. aureus. 14 dagar efter den första infektionen visade sig livmoderhalsen vara allvarligt infekterad.
i kontrollgruppen var livmoderhalsepitelet normalt och ingen hyperplasi eller inflammation observerades. I modellgruppen har inre skikt av livmoderhalsepitel hyperplasi, och de inflammatoriska cellerna (neutrofil och eosinofil) infiltrerades kraftigt i epitelvävnaden. Efter behandling av FVG (2,2 och 1,1 g/kg) kan inflammation i livmoderhalsen hämmas signifikant (figur 8).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
4. Diskussion
diagnosen cervicit är svår på grund av bristen på det uppenbara symptomet. Hos vissa patienter kunde onormal mucopurulent urladdning och cervikal ektopi observeras . Många däggdjursmodeller av cervicit hade etablerats under de senaste decennierna. Makaker, råttor och möss kan användas för att fastställa cervicitmodellen. Både bakterier (C. trachomatis) och kemiska föreningar (fenol, ättiksyra) kan användas för att inducera cervicit . I denna forskning optimerades två musmodeller. Efter infektion med C. trachomatis N höjdes bakteriebelastningen av C. trachomatis N i livmoderhalsslem kontinuerligt över tiden. C. trachomatis n-infektionen kan leda till uppreglering av cytokiner i serum och inflammation i vävnaderna i vagina och livmoderhals. Efter infektion med blandningen av E. coli och S. aureus kunde skadan av livmoderhalsen detekteras vid patologisk diagnos.
kliniskt var antibiotika det första valet att behandla cervicit enligt olika patogener. Men framväxten av antibiotikaresistenta såsom kinolonresistenta C. trachomatis och N. gonorrhea, meticillinresistent S. aureus och vankomycinresistent E. coli blir ett allvarligt problem över hela världen på grund av missbruk av antibiotika . TCM kan bidra med alternativa strategier för behandling av cervicit. Effekterna av FVG på cervicit testades i denna forskning.
FVG är en vaginal gel, vars gelbas är blandningen av karbopol 941 och xantangummi . Under de senaste åren har många kommersiella vaginala gelpreparat av kinesisk örtformel använts för att behandla cervicit . Den vaginala läkemedelsleveransen är en traditionell mukosal läkemedelsleveransväg, som kan användas för behandling av både lokala och systemiska sjukdomar . Traditionella preparat, såsom suppositorier, geler, tabletter, vaginala filmer, bevattningar och pessarier kan användas som vaginala formuleringar . Som ett av de mest använda läkemedelsleveranssystemen har vaginala geler använts för beredning av mikrobicider, preventivmedel, arbetsinducerare och könshormoner. Jämfört med andra läkemedelsleveranssystem är vaginalgelen säkrare och har högre biotillgänglighet .
alla sex växtbaserade läkemedel i FVG kan användas vid behandling av gynekologiska sjukdomar i TCM . Enligt teorin om TCM är Gentianae radix et rhizom i denna formel ”monarkläkemedlet” eller ”huvudläkemedlet”, Stemonae radix och Fraxini cortex är ”ministerläkemedlet” eller ”assistentläkemedlet”, Paeoniae radix rubra och Dictamni cortex är ”adjuvantläkemedlet”, och Glycyrrhizae radix et rhizom är ”vägledande läkemedel”. Gentianae radix et rhizom kan bidra mest till effekterna av FVG. Iridoider och totala glukosider av pion isoleras huvudsakligen från Gentianae radix et rhizoma respektive Paeoniae radix rubra. Dessa föreningar visar signifikanta antiinflammatoriska effekter . Alkaloider och limonoider bidrar till den antibakteriella aktiviteten hos Dictamni cortex . Kumarinerna i Fraxini cortex och flavonerna i Glycyrrhizae radix et rhizome visar antibakteriella och antiinflammationseffekter . Alkaloiderna bidrar till den insekticida aktiviteten hos Stemonae radix . Dessa bioaktiva föreningar av dessa växtbaserade läkemedel kan stödja behandlingen av FVG på cervicit.
IL – 17 produceras av Th17-celler karakteristiskt. Kliniskt är koncentrationen av IL-17 i könssekretioner hos C. trachomatis-infekterade patienter signifikant högre än hos oinfekterade kvinnor . Den höga nivån av IL – 17 i muscervicitmodellen var i överensstämmelse med det kliniska resultatet. Nivåerna av IL-2 och MCP-1 är associerade med svaren från Th1. IL – 2 utsöndras från Th1-celler och stimulerar produktionen av cytokiner. Det finns en omvänd korrelation mellan nivån på MCP-1 och Th1-svaren. Inhiberingen av MCP-1 kan öka produktionen av IFN-GHz. FVG kan nedreglera koncentrationerna av IL-2, IL-17 och MCP-1. Dessa resultat antydde att FVG kunde hämma cervicit genom reglering av värdimmunsvar.
tidigt i C. trachomatis infektionscykel möjliggör typ III sekretionssystem EBs att invadera värdcellerna . Internaliseringen av C. trachomatis följs av utvecklingen av RBs och inklusioner. Hämmaren av typ III-sekretionssystemet kan blockera bildandet av inklusioner . In vitro-undersökningen visade att FVG kunde hämma antalet inklusioner i HeLa-celler.
Sammanfattningsvis etablerade vi framgångsrikt två muscervicitmodeller med infektionen av C. trachomatis n, S. aureus och E. coli. Vi bevisade att FVG signifikant kunde hämma cervicit. FVG kan nedreglera bakteriebelastningen, mildra den patologiska skadan och minska antalet inklusioner. Effekterna av FVG var associerade med hämning av patogener och reglering av värdimmunsvar. Denna forskning ger bevis för att FVG kan användas som ett nytt alternativt medel som lindrar problemet med antibiotikaresistent under behandlingen av cervicit.
datatillgänglighet
de data som används för att stödja resultaten av denna studie ingår i artikeln.
intressekonflikter
författarna har inga intressekonflikter relaterade till detta arbete.
författarnas bidrag
Xin Mao och Ronghua Zhao bidrog lika mycket till detta arbete.
bekräftelser
denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (nos. 81773977 och 81774204).
