Kapillärelektrofores

IG1_02_20smc48-kapillär array

automatiserad DNA-sekvensering genom kapillärelektrofores

separering av produkterna från en radioaktivt märkt eller fluorescerande dideoxisekvensreaktion har historiskt gjorts i en poly-akrylamid-plattgel, till exempel den typ som används i en 96-Lane Abi 377. Nackdelar med denna metod inkluderar nödvändigheten av att förbereda en ny gel för varje sekvenseringskörning, manuell laddning av prover i gelen, relativt långa körtider (8 ~ 10 timmar för upplösning av ett 1KB DNA-fragment) och svårigheter i automatiserad och/eller manuell spårning av körfält.

en alternativ separationsmetod använder kapillärelektrofores. En serie av standard dideoxy-DNA-sekvenseringsreaktioner framställs, var och en i en brunn av en 8 rad x 12 kolumn 96-brunnsplatta. En serie ultratunna kapillärrör (0.1 mm inuti hålet, 50 ~ 80 cm längd) är fyllda med en harts pärla blandning och placeras i en multi-kapillär array. Ena änden av matrisen är monterad i en negativt laddad Katodplatta så att deras ändar är i linje med varje brunn i provplattan. Applicering av högspänning får det märkta DNA i varje provbrunn att komma in i motsvarande kapillär och migrera även om det mot den positivt laddade Anodreservoaren. På grund av de använda högspänningarna kräver elektroforetisk separation endast 1 ~ 3 timmar. Liksom i elektrofores av platta-gel rör sig de mindre fragmenten snabbare än de större . Slutmärkningsfärgämnena aktiveras av en laser i detektorfönstret och fluorescensvåglängden för varje fragment läses av en fotometer när den passerar en fast punkt. Till skillnad från slab gel systemet, laser och fotometer är fasta och orörliga, och kan aktivera och läsa flera sida vid sida kapillärer samtidigt som separata dataströmmar: detta undviker problemet med att spåra separata banor i en platta gel. Mobilitetsdata skickas till en dator och ett kromatogram genereras för varje prov som i huvudsak är identiskt med de i plattgelsystemet.

Kapillärsekvenser använder vanligtvis en robot för att ladda en stapel provplattor automatiskt. Kapillärmatrisen spolas med buffert mellan plattorna, så att maskinen kan lämnas obevakad för många körningar. I de största anläggningarna kan PCR-reaktioner också kopplas direkt till sekvenseringsplattor i robotarbetsstationer som tjänar dussintals eller hundratals kapillärsekvenser. Kromatogramdata placeras på en server och kan laddas ner av användare hundratals eller tusentals mil bort. Skalfördelar kan göra det billigare att lägga ut DNA-sekvensering snarare än att köpa, underhålla och bemanna en egen maskin.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.