resultat

ALDH1-uttryck i embryonal och vuxen bukspottkörtel.

baserat på tidigare studier som dokumenterar höga nivåer av aldh1 enzymatisk aktivitet i neurala, hematopoietiska och bröst epiteliala stamfäder (17-19) karakteriserade vi temporala och rumsliga mönster av aldh1-proteinuttryck i embryonala och vuxna muspancreas (Fig. 1). Med hjälp av E-cadherin som markör för pankreatiska epitelceller fann vi att aldh1-protein först kan detekteras inom det utvecklande pankreatiska epitelet på E12.5 (Fig. 1A). Vid denna tidpunkt är uttrycket begränsat till spetsarna på förgreningsrören, som nyligen föreslagits för att representera en multipotential stamfaderdomän (20). Ett liknande uttrycksmönster har tidigare rapporterats för aldh1a1-transkript (21). Uttrycket i de rörformiga spetsarna (och inte i de centrala stammarna) kvarstår genom E14.5 (Fig. 1 B och B’), och därefter nedregleras i differentierande acinarceller. I vuxen bukspottkörtel observeras epitelialt aldh1-uttryck oftast i centroacinära och terminala duktala epitelceller (Fig. 1 C-E). Mesenkymala (E-cadherin-negativa) aldh1-Uttryckande celler detekterades också omgivande endokrina öar och exokrin acini (Fig. S1).

för att ytterligare karakterisera aldh1-uttryck och aldh1-enzymatisk aktivitet i vuxna terminalkanaler/centroacinarceller använde vi preparat av perifera acinar-duktala enheter som nyligen isolerats från kollagenas-digererad mus exokrin bukspottkörtel (22). Viktigt är att dessa isolerade perifera acinar-duktala enheter är markant utarmade av stora kanaler och endokrina element. Jämfört med total bukspottkörtel uppvisade perifera acinar-duktala enheter en>400-faldig utarmning i insulintranskript, som bedömts med RT-PCR (Fig. S2A). När FACS-analys utfördes på perifera acinar-duktala enheter som skördats från transgena Ins1:DsRed-möss som uttryckte rött fluorescerande protein i Tubi-celler, var endast 3 av 10 000 celler (0,03%) från denna beredning positiva för DsRed.

ytterligare tredimensionell karakterisering av aldh1-proteinuttryck uppnåddes med användning av helmonterad fluorescerande märkning av isolerade perifera acinar-duktala enheter. Aldh1-protein lokaliserades i kombination med E-cadherin som en markör för epitelceller och med antingen FITC-konjugerad Dolichos biflorus agglutinin (DBA) eller FITC-konjugerad jordnötsagglutinin (PNA), markörer av duktala respektive acinära celler. Flerkanalig avbildning bekräftade en övervägande centroacinar / terminal duktal plats för ALDH1-Uttryckande epitelceller i vuxen bukspottkörtel (Fig. S3). Aldh1-Uttryckande celler placerades oftast mellan terminalt duktalt epitel och mer perifera acinarceller. Dessutom observerades även enstaka epiteliala aldh1-Uttryckande celler omedelbart intill terminalt duktalt epitel (Fig. S3 A och B). Både DBA-positiva och DBA-negativa aldh1-positiva celler identifierades, medan ALDH1-positiva PNA-positiva celler endast sällan identifierades.

isolering av Aldh1-Uttryckande Centroacinar och terminala duktala celler.

i hopp om att isolera aldh1-Uttryckande celler från vuxen muspankreas utnyttjade vi ett fluorogent substrat som kallas ”Aldefluor” (StemCell Technologies), som tidigare har använts i FACS-baserad isolering av hematopoietiska, neurala och bröst epitelstamceller (17-19). Innan vi försökte FACS – baserad isolering av aldh1-Uttryckande pankreatiska epitelceller, applicerade vi först detta reagens för att visualisera levande aldh1-Uttryckande celler i perifera acinar-duktala enheter (Fig. 2). Såsom visas i Fig. 2 E och F, bekräftade dessa studier den centroacinära/terminala duktala platsen för aldefluor-positiva celler med låg överflöd i vuxen muspankreas. Aldefluorpositiva centroacinar / terminala duktala celler skiljdes lätt från intilliggande acinarceller på grund av deras lilla storlek och brist på zymogengranuler. Ytterligare exempel på levande cellavbildning med Aldefluorreagenset tillhandahålls i Fig. S4. Dessa fynd antydde att anti-ALDH1-immunofluorescens och Aldefluorbaserad cytofluorescens märkte en liknande centroacinar/terminal duktalpopulation och föreslog vidare att dessa celler kan isoleras framgångsrikt av FACS.

vi förföljde nästa FACS-baserad karakterisering och sortering av enstaka celler dissocierade från perifera acinar-duktala enheter. Som ett initialt medel för att fastställa specifik gating av aldh1-Uttryckande celler använde vi en farmakologisk hämmare av aldh1 enzymatisk aktivitet (DEAB). Som avbildas i Fig. 2 A-D, denna strategi möjliggjorde isolering av en cellpopulation med låg överflöd som kännetecknas av höga nivåer av deab-känslig aldh1-enzymatisk aktivitet, innefattande 0,9% 0.2% av alla sorterade celler i vuxen muspankreas. Med hjälp av en e-cadherinantikropp för att samtidigt identifiera epitelceller befanns aldefluor ( + ) E-cadherin ( + ) celler representera 0,5% 0,13% av alla sorterade celler i vuxen muspancreas (Fig. 2D).

använda kvantitativ RT-PCR för att jämföra de aldefluor-positiva, E-cadherin-positiva (A+E+), Aldefluor-negativa, E-cadherin-positiva (A−E+), Aldefluor-positiva, E-cadherin-negativa (A+E−) och Aldefluor-negativa, E-cadherin-negativa (A−E−) populationerna isolerade från vuxna muspancreas, fann vi att A+E+ – populationen berikades avsevärt för transkript som kodar aldh1a1 och aldh1a7, och utarmat av transkript för två andra aldh1 isoformer, aldh1a2 och Aldh1a3 (Fig. 3G). Aldh8a1 detekterades inte i något av proverna. Jämfört med A−E+-populationen tömdes A+E+-celler blygsamt av transkript för Pdx1 (P < 0,09), amylas (P < 0,001) och Cytokeratin-19 (P < 0,01) (markörer uttryckta i differentierade Acinarceller, Acinarceller respektive kanalceller). Däremot kännetecknades A+ E + – celler av högnivåuttryck av Ptf1a, trots att de var utarmade av både Amylasutskrifter och amylasprotein (Fig. 3G och Fig. S5). Dessutom berikades dessa celler för transkript som kodar för Sca-1, SDF1, c-Met, Nestin, Sox9, Hey1 och Hey2, markörer som tidigare associerats med stamfader populationer i bukspottkörteln och andra vävnader. Med hjälp av immunofluorescerande märkning på cytospinpreps av FACS-sorterade celler bekräftade vi markerad anrikning för aldh1-och Sox9-protein och utarmning av amylas i A+E+ – celler (Fig. S5). Dessutom utförde vi också FACS-analys för att bestämma frekvensen med vilken aldefluor ( + ) celler också var positiva för stamcellsmarkörer såsom CD133 och Sca-1-protein och observerade att över 90% av aldefluor ( + ) cellerna dessutom samuttryckte båda dessa stamcellsmarkörer. Däremot var endast 0,11% av aldefluor ( + ) celler också positiva för den vaskulära endotelmarkören PECAM, medan 0,08% var positiva för den hematopoietiska markören CD45. När FACS-analys utfördes på perifera acinar-duktala enheter som skördats från transgena Ins1-DsRed-möss som uttrycker rött fluorescerande protein i cellerna i Cu-celler, befanns alla aldefluorceller (+) vara negativa för dsRed.

Pankreatosfäranalys av endokrin och exokrin stamfader funktion.

som en initial skärm för stamfader-liknande aktivitet analyserade vi aldefluor (+) och Aldefluor (–) celler för förmågan att bilda pankreatosfärer (Fig. 3), liknande neurosfäranalysen som vanligtvis används för att identifiera neurala förfäder (23). I dessa analyser kunde A+ E + centroacinar / terminal duktala celler unikt bilda sfärer i suspensionskultur. A+ E + – celler visade en sfärbildande effektivitet >100 gånger den för deras a−e+ – motsvarigheter (Fig. 3 A och B och tabell S1). Med lägre effektivitet kunde enstaka A+E+ – celler till och med bilda sfärer när de pläterades vid klonal densitet (en cell per brunn) i 96-brunnsplattor (tabell S1). Ingen av de E-cadherin-negativa populationerna uppvisade betydande sfärbildande kapacitet. När de odlades under en 5 – till 7-dagarsperiod uppvisade pankreatosfärer härledda från A+E+-celler starkt uttryck av E-cadherin (Fig. 3C), vilket bekräftar deras epitelidentitet, och enskilda celler inom sfärerna började ackumulera avsevärda mängder av antingen amylas eller insulin och insulin C-peptid (Fig. 3 D och E). Vid 5 dagar visade 50% av pankreatosfärerna expression av amylas, medan cirka 30% visade immunreaktivitet mot insulin C-peptid. Enskilda sfärer var generellt positiva för antingen insulin eller amylas, men inte båda. Små delmängder av celler inom sfärerna upprätthöll aldh1-uttryck under odlingsperioden och visade också kärnuttryck av Sox9-protein (Fig. 3 F och G), vilket tyder på ett eventuellt underhåll av en självförnyande stamfader pool. Denna uppenbara kapacitet för självförnyelse stöddes ytterligare av det faktum att pankreatosfärer genererade av aldefluor (+) centroacinar/terminala duktala celler kunde utsättas för seriell enzymatisk dissociation, bibehålla sin sfärbildande kapacitet över minst tre sekventiella passager med 7-dagars intervall. Dessutom var celler inom sfärer mycket proliferativa, som bedömts genom inkorporering över natten av EdU tillsatt vid antingen början eller slutet av odlingsperioden (Fig. 3H).

baserat på de distinkta stamfaderkapaciteterna som visas av A+E+ – celler undersökte vi vidare sorterade cellpopulationer för uttryck av Ngn3, en markör för endokrina stamceller (Fig. S2B). I överensstämmelse med tidigare studier (7) kunde vi inte upptäcka signifikant uttryck av Ngn3 i antingen total vuxen bukspottkörtel eller någon av de nyligen sorterade cellpopulationerna. Men när A+ E + – cellerna placerades i kultur började de generera detekterbart uttryck av Ngn3 omedelbart före början av insulinuttryck, vilket ytterligare bekräftar den endokrina stamfaderkapaciteten hos ALDH1-Uttryckande centroacinära och terminala duktala epitelceller.

Pankreatosfärer härledda från Aldefluor ( + ) terminala duktala/Centroacinära celler uppvisar Glukosresponsiv insulinsekretion.

detekteringen av celler som uttrycker insulin och insulin C-peptid i odlade pankreatosfärer föranledde bedömning av huruvida dessa celler var kapabla till glukosresponsiv insulinsekretion, en egenskap hos funktionella bukspottkörtelceller. Som en positiv kontroll använde vi ins-1-celler (klon 832/13) en odödlig kaka-cellinje som vanligtvis används för studier av insulinsekretion som svar på fysiologiska glukoskoncentrationer. Efter inkubation över natten av antingen pankreatosfärer eller Ins-1-celler i 0, 5 och 11 mM glukos skördades både supernatanter för odlingsmedier och celllysater och analyserades för utsöndrad och cellulär insulin C-peptid med användning av en ELISA-baserad analys. Pankreatosfärer härledda från aldefluor ( + ) centroacinar/terminala duktala celler utsöndrade C-peptid på ett glukosberoende sätt, med glukoskänslighet som liknar den som visas av ins-1-celler (Fig. 3I).

Aldefluor ( + ) vuxna terminala duktala/Centroacinära celler kan bidra till embryonala endokrina och exokrina linjer.

som ett ännu strängare test för pancreatic progenitor aktivitet mikroinjicerade vi isolerade aldefluor ( + ) och Aldefluor ( – ) celler i mikrodissekerade dorsala pankreatiska knoppar isolerade från E12.5 musembryon och analyserades för en förmåga att produktivt bidra till de utvecklande endokrina och exokrina linjerna (Fig. 4). Detta tillvägagångssätt användes nyligen för att dokumentera stamfader aktivitet för ngn3-Uttryckande celler som uppstår efter pankreatisk kanal ligering (7). För att spåra linjen av vuxna härledda givarceller och skilja dem från deras embryo-härledda motsvarigheter isolerade vi aldefluor (+) och Aldefluor (–) celler från bukspottkörteln hos möss som bär en allestädes närvarande uttryckt pCAG:mCherry transgene, som schematiskt avbildas i Fig. 4A (pCAG:mCherry-möss tillhandahölls vänligt av Michael Wolfgang, Johns Hopkins University). Vid jämförelse med aldefluor ( – ) celler Bar aldefluor ( + ) celler en dramatiskt förbättrad potential att bidra till framväxande endokrina linjer inom de mogna dorsala knopparna, vilket demonstreras genom samuttryck av mCherry med antingen C-peptid (Fig. 4 B–E) eller glukagon (Fig. 4 F-I). Med hjälp av överlagrad E-cadherin-märkning för att möjliggöra räkning av enskilda mCherry-positiva celler utvärderade vi kvantitativt förmågan hos vuxna aldefluor (+) och Aldefluor (−) celler att komma in i embryonala linjer. Sju dagar efter mikroinjektion av aldefluorceller ( + ) i E12.5 dorsala knoppar, uttryck av glukagon observerades i 11, 7% av kvarvarande mcherry-positiva celler, med insulin C-peptiduttryck observerat i ytterligare 11, 6% (Fig. 5N). Däremot uttryckte 2,4% av kvarvarande mCherry-positiva aldefluorceller (−) glukagon och endast 0,2% uttryckt insulin C-peptid. Intressant nog visade aldefluor ( + ) och Aldefluor ( – ) populationer ekvivalenta förmågor att komma in i icke – endokrina epitellinjer, vilket kanske återspeglar det faktum att de flesta av aldefluor ( – ) populationen bestod av redan differentierade acinarceller. Liknande frekvenser av E-cadherin, amylas och PNA-positivitet observerades i kvarvarande mcherry-positiva celler härledda från antingen aldefluor ( + ) eller Aldefluor ( – ) populationer (Fig. 4 J-N).

Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.

för att utvärdera in vivo-beteendet hos ALDH1-Uttryckande centroacinar-och terminalkanalceller bedömde vi mönster av ALDH1-uttryck i inställningen av kronisk inflammation och regenerativ metaplasi inducerad genom sekventiell administrering av lågdos caerulein. Som tidigare rapporterats (15) inducerade behandling av vuxna möss med tre injektioner av caerulein (50 kg/kg) per vecka i 3 på varandra följande veckor ett tillstånd av kronisk pankreatit följt av nästan fullständig regenerering och reparation. Denna process kännetecknas av inflammatoriska infiltrat, stromal expansion och bildandet av regenerativa metaplastiska rörformiga komplex, som inkluderar typ-1-rörformiga komplex som tidigare visat sig vara acinära cell-härledda och typ-2-rörformiga komplex (TC2), som tidigare visat sig vara nonacinära härledda och förmodligen härrör från prolifererande terminalkanalceller (15). I motsats till det relativt låga överflödet av aldh1-Uttryckande terminalkanal och centroacinarceller observerade i normal vuxen bukspottkörtel (Fig. 5 A och B), aldh1-Uttryckande terminalkanal (Fig. 5 C och D) och centroacinar (Fig. 5 e och F) celler expanderades markant i inställningen av caeruleininducerad kronisk pankreatit. Observera att typ-2-rörformiga komplex bestod huvudsakligen av aldh1-Uttryckande celler (Fig. 5h), medan typ-1-rörformiga komplex inte visade några bevis på aldh1-uttryck (Fig. 5G).