Abstrakt

olika tekniker är tillgängliga för isolering av Candida i munhålan. Sådana metoder spelar en viktig roll vid diagnos och hantering av oral Candidos. Den växande betydelsen av Candida är delvis relaterad till uppkomsten av HIV-infektion och den mer utbredda användningen av immunsuppressiv kemoterapi. Tillsammans med Candida albicans har det skett ett större erkännande av vikten av nonalbicans Candida-arter vid oral Candidos. Identifiering av infekterande stammar av Candida är viktigt eftersom isolat av Candida-arter skiljer sig mycket, både i deras förmåga att orsaka infektion och även i deras mottaglighet för antimykotiska medel. Således ger denna översyn En översikt över de tillförlitliga metoderna för candidal isolering och identifiering av isolat från munhålan.

1. Introduktion

termen Candida härstammar från det latinska ordet candid, vilket betyder vit. Sporerna av Candida är en kommensal, ofarlig form av en dimorf svamp som blir invasiv och patogen pseudohyphae när det finns en störning i florans balans eller vid försvagning av värden .

översättningen av denna endogena commensal till den sjukdomsframkallande parasiten kan associeras med andra faktorer än själva organismens patogena attribut, vilket är ganska unikt jämfört med de flesta andra infektionssjukdomar, där virulensen hos organismerna anses vara nyckelfaktorn i patogenesen. Därför är Candida-arter strikt opportunistiska. Det kan konstateras med att varken de ytliga eller systemiska formerna av Candida-infektioner kunde initieras i frånvaro av underliggande patologi .

det finns många arter av Candida (Tabell 1), men den vanligaste som återvinns från munhålan, i både kommensalt tillstånd och i fall av oral Candidos, är C. albicans. Det uppskattas att denna art står för över 80% av alla orala jästisolat.

under de senaste åren har det varit ett ökat intresse för infektioner orsakade av den opportunistiska patogenen Candida. Den växande betydelsen av Candida är delvis relaterad till uppkomsten av HIV-infektion och den mer utbredda användningen av immunsuppressiv kemoterapi . Identifiering av infekterande stammar av Candida är viktigt eftersom isolat av Candida-arter skiljer sig mycket, både i deras förmåga att orsaka infektion och även i deras mottaglighet för antimykotiska medel .

tillsammans med C. albicans har det varit ett större erkännande av vikten av icke-albicans Candida-arter i mänsklig sjukdom. C. glabrata och C. krusei är arter som har fått uppmärksamhet på grund av deras förbättrade resistens mot vissa antifungala medel. C. dubliniensis är en nyligen identifierad patogen art, som först beskrevs 1995 när den koisolerades med C. albicans från fall av oral Candidos hos HIV-infekterade individer .

denna översyn ger en översikt över de tillförlitliga metoderna för candidal isolering och identifiering av isolat från munhålan.

2. Patogena attribut av Candida

övergången av Candida från en ofarlig kommensal till en patogen organism är komplex och är relaterad till subtila miljöförändringar som leder till uttryck av en rad virulensfaktorer (Tabell 2). Det är den kombinerade effekten av både värd-och candidalfaktorer som i slutändan bidrar till utvecklingen av oral Candidos .

oavsett typ av Candidos är Candida-artens förmåga att kvarstå på slemhinnor hos friska individer en viktig faktor som bidrar till dess virulens. Detta är särskilt viktigt i munhålan, där organismen måste motstå den mekaniska tvättverkan av ett relativt konstant flöde av saliv mot matstrupen .

ingen enskild dominerande virulensfaktor för Candida erkänns även om det finns ett antal faktorer som har varit inblandade i att främja infektionsprocessen. Dessa inkluderar attribut som är involverade i vidhäftningen av Candida till orala ytor (t. ex. relativ hydrofobicitet i cellytan och närvaron av specifika adhesinmolekyler), förmågan att motstå värdimmunförsvarsmekanismer (t. ex. högfrekvent fenotypisk omkoppling och morfologisk övergång) och frisättning av hydrolytiska enzymer (t. ex., utsöndrade aspartyl proteinaser och fosfolipaser) som kan inducera skador på värdceller .

3. Oral Candidos

Samaranayake föreslog en klassificering där de orala candidosskadorna delades in i två huvudgrupper: grupp i eller primära orala candidoser begränsade till lesioner lokaliserade till munhålan utan involvering av hud eller andra slemhinnor; grupp II eller sekundära orala candidoser, där lesionerna finns i såväl orala som extraorala ställen såsom hud (tabell 3). Grupp i-lesioner består av de klassiska triaden—pseudomembranösa, erytematösa och hyperplastiska varianterna—och vissa har föreslagit ytterligare indelning av den senare i plackliknande och nodulära typer .

4. Diagnos av Oral Candidos

diagnos av oral Candidos kan ofta göras på arten av de kliniska presentationsfunktionerna, även om mikrobiologiska prover bör tas om möjligt för att både identifiera och kvantifiera eventuella Candida som kan vara närvarande och ge isolat för antimykotisk känslighetstestning.

5. Metoder för isolering

tekniker som är tillgängliga för isolering av Candida i munhålan inkluderar användning av ett smet, en vanlig vattpinne , en avtryckskultur , insamling av hela saliv , koncentrerad oral sköljning och slemhinnebiopsi. Varje metod har särskilda fördelar och nackdelar och valet av provtagningsteknik styrs främst av arten av den lesion som ska undersökas (Tabell 4). Där en tillgänglig och definierad lesion är uppenbar, föredras ofta en direkt provtagningsmetod, såsom användning av en vattpinne eller ett avtryck, eftersom detta kommer att ge information om de organismer som finns vid själva lesionen. I fall där det inte finns några uppenbara skador eller i fall där lesionen är svår att komma åt är ett indirekt prov baserat på odling av salivprover eller en oral sköljning mer acceptabelt.

kvantitativ uppskattning av svampbelastning kan göras med avtryck, koncentrerad oral sköljning och odling av oral sköljning, som ett sätt att skilja mellan kommensal transport och patogen existens av oral Candida, med högre belastningar som anses sannolikt i den senare .

6. Direkt mikroskopi

morfologiska egenskaper hos Candida-arter (Tabell 5) måste undersökas för identifiering. Ett smet är av värde för att skilja mellan jäst-och hyphalformer men är mindre känsligt än kulturella metoder . Kaliumhydroxid (KOH) beredning av provet avslöjar icke-Pigmenterad septathyphae med karakteristisk dikotom förgrening (i en vinkel på cirka 45 kcal) . I KOH-Calcofluor fluorescerande fläckmetod kommer svampegenskaper som hyfer, jästceller och andra svampelement att fluorescera .

ett utstryk som tas från lesionsstället fixeras på mikroskopglas och färgas sedan antingen av gramfläcken eller av periodisk syra Schiff (PAS) teknik. Med hjälp av dessa metoder verkar candidal hyphae och jäst antingen mörkblå (Gram-fläck) eller röd/lila (PAS) .

vid kronisk hyperplastisk Candidos är en biopsi av lesionen nödvändig för efterföljande detektering av invaderande Candida genom histologisk färgning med antingen PAS eller Gomoris metenamin silverfläckar. Demonstration av svampelement i vävnader görs eftersom de färgas djupt av dessa fläckar. Förekomsten av blastosporer och hyphae eller pseudohyphae kan göra det möjligt för histopatologen att identifiera svampen som en art av Candida och, med tanke på närvaron av andra histopatologiska egenskaper, göra en diagnos av kronisk hyperplastisk Candidos .

7. Laboratoriekultur

7.1. Svabb

en svabb på ett lesionsställe är en relativt enkel metod för att detektera tillväxt och semikvantitativ uppskattning av Candida kan erhållas. Provtagningsmetoden innebär att försiktigt gnugga en steril bomullspinne över lesionsvävnaden och sedan inokulera ett primärt isoleringsmedium såsom Sabourauds dextrosagar (SDA) .

7.2. Koncentrerad oral sköljning

den orala sköljtekniken innebär att patienten håller 10 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (0, 01 m, pH 7, 2) i munnen i 1 minut. Lösningen koncentreras sedan (10-faldigt) genom centrifugering och en känd volym, vanligtvis 50 oc, inokuleras på ett agarmedium med användning av ett spiralpläteringssystem. Efter 24-48 timmars inkubation vid 37 CCG bedöms tillväxten genom uppräkning av kolonier och uttrycks som candidalkolonibildande enheter per mL (cfu mL−1) sköljning .

7.3. Imprint Culture

imprint-metoden använder en steril skumdyna av känd storlek (typiskt 2,5 cm2), som tidigare doppats i ett lämpligt flytande medium, såsom Sabourauds buljong, omedelbart före användning. Dynan placeras sedan på målplatsen (slemhinna eller intraoral protes) i 30 sekunder och överförs sedan till en agar för odling .

8. Odlingsmedia

det mest använda primära isoleringsmediet för Candida är SDA som, även om det tillåter tillväxt av Candida, undertrycker tillväxten av många arter av orala bakterier på grund av dess låga pH. införlivandet av antibiotika i SDA kommer att öka dess selektivitet ytterligare . Typiskt inkuberas SDA aerobt vid 37 C i 24-48 timmar. Candida utvecklas som grädde, släta, pasty konvexa kolonier på SDA och differentiering mellan arter är sällan möjlig . Det uppskattas att mer än en Candida-art förekommer i cirka 10% av orala prover och under de senaste åren har förmågan att upptäcka nonalbicans-arter blivit allt viktigare .

under de senaste åren har andra differentiella medier utvecklats som möjliggör identifiering av vissa Candida-arter baserat på koloniutseende och färg efter primärkultur. Fördelen med sådana medier är att närvaron av flera Candida-arter i en enda infektion kan bestämmas vilket kan vara viktigt vid val av efterföljande behandlingsalternativ . Exempel på dessa inkluderar Pagano-Levin-agar eller kommersiellt tillgängliga kromogena agarer, nämligen CHROMagar Candida, Albicans ID, Fluroplate eller Candichrom albicans .

Pagano-Levin agar skiljer mellan Candida-arter baserat på reduktion av trifenyltetrazoliumklorid. Mediet producerar blekfärgade kolonier av C. albicans, medan kolonier av andra Candida-arter uppvisar varierande grader av rosa färg. Pagano-Levin agar har en liknande känslighet för SDA men är överlägsen för detektering av mer än en art i provet , CHROMagar Candida identifierar C. albicans, C. tropicalis och C. krusei baserat på kolonifärg och utseende , medan Albicans ID och Fluroplate har visat sig vara fördelaktiga för den förmodade identifieringen av C. albicans . Specificiteten för identifiering rapporteras vara 95% För CHROMagar Candida och 98,6% för Albicans ID och Fluroplate agars . Användningen av CHROMagar Candida som en primär isoleringsagar har citerats som ett tillvägagångssätt som tillåter diskriminering av den nyligen beskrivna C. dubliniensis från C. albicans. På CHROMagar Candida utvecklas C. dubliniensis enligt uppgift som mörkare gröna kolonier jämfört med C. albicans . Diskriminering mellan dessa två arter med Kromagar verkar dock minska vid subkultur och lagring av isolat. Misslyckande av C. dubliniensis att växa på agarmedier vid den förhöjda inkubationstemperaturen på 45 kcal C har nyligen föreslagits som ett alternativt test för att skilja mellan dessa två arter .

9. Identifiering av Candida-arter

identifiering av jäst baserat på primära odlingsmedier kan bekräftas genom en mängd kompletterande tester som traditionellt baseras på morfologiska (Tabell 5) och fysiologiska egenskaper hos isolaten.

9.1. Morfologiska kriterier

bakterierörstestet är standardlaboratoriemetoden för att identifiera C. albicans. Testet innefattar induktion av hyphala utväxter (groddrör) när de subkultiveras i hästserum vid 37 kcal C i 2-4 timmar. Cirka 95% av C. albicans isolat producerar groddrör, en egenskap som också delas av C. stellatoidea och C. dubliniensis .

C. albicans och C. dubliniensis kan också identifieras från andra arter baserat på deras förmåga att producera morfologiska egenskaper som kallas chlamydosporer. Chlamydosporer är refraktila, sfäriska strukturer som genereras vid termini av hyfer efter odling av isolat på ett näringsfattigt medium såsom majsmjölagar. Isolat inokuleras i ett korsluckmönster på agar och överlagras med en steril täckglas. Agars inkuberas i 24-48 timmar vid 37 CCG och undersöks sedan mikroskopiskt för chlamydospore närvaro .

9.2. Fysiologiska kriterier / biokemisk identifiering

biokemisk identifiering av Candida-arter baseras till stor del på kolhydratutnyttjande. Traditionell testning skulle ha involverat odling av testisolat på en basal agar som saknar kolkälla. Kolhydratlösningar skulle sedan placeras i brunnar i den sådda agar eller på filterpappersskivor belägna på agarytan. Tillväxt i närheten av kolkällan skulle indikera utnyttjande. Kommersiella system bygger på samma princip men testkolhydrater är inrymda i plastbrunnar belägna på en testremsa. Tillväxten i varje brunn läses av förändringar i grumlighet eller färgförändringar i vissa kitsystem. Numeriska koder som erhållits från testresultaten används för att identifiera testorganismen baserat på databasjämförelse .

9.3. Serologi

serologiska tester används ofta för att fastställa den kliniska betydelsen av Candida-arter isolat. Stigande titrar av lgG-antikroppar mot C. albicans kan återspegla invasiv candidiasis hos immunkompetenta individer. Detektion av IgA-och IgM-antikroppar är viktigt för att identifiera en akut infektion. Immunsupprimerade individer visar ofta variation i antikroppsproduktion och i ett sådant fall rekommenderas användning av ett antigendetekteringstest. Tester som enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) och radioimmunanalys (RIA) för detektion av candidialt antigen, antingen cellvägg mannan eller cytoplasmatiska beståndsdelar är nu tillgängliga i utvecklade länder .

serologisk diagnos försenas ofta och testerna saknar fortfarande känslighet och specificitet. Dessutom är antikroppsproduktion hos immunkomprometterade patienter variabel, vilket gör diagnosen komplicerad . Detta beror på det faktum att svampantigener och metaboliter ofta rensas snabbt från cirkulationen och närvaron av antikroppar innebär inte alltid en Candida-infektion, särskilt hos patienter med allvarlig underliggande sjukdom eller som tar immunsuppressiva läkemedel .

serologiska tester är normalt inte ett diagnostiskt verktyg för oral Candidos. Sådana tester kan dock vara ett prognostiskt instrument hos patienter med svår oral Candidos som svarar dåligt på antimykotisk behandling .

9.4. Molekylbaserade identifieringsmetoder

identifiering genom analys av genetisk variabilitet är ett mer stabilt tillvägagångssätt än att använda metoder baserade på fenotypiska kriterier. För identifiering av Candida baserat på genetisk variation är analyser av elektroforetiska karyotypskillnader och restriktionsfragmentlängdspolymorfismer (RFLPs) med användning av gelelektrofores eller DNA-DNA-hybridisering .

artspecifika PCR-metoder har också använts för identifiering av Candida-arter. Flera målgener har rapporterats för diskriminering av Candida-arter, även om de som oftast förstärks är sekvenserna av ribosomalt RNA-operon. Identifiering kan erhållas baserat på PCR-produktstorlekar erhållna efter gelelektroforesupplösning eller PCR-produktsekvensvariation bestämd antingen genom direkt sekvensering eller genom användning av restriktionsfragmentanalys efter skärning av PCR-sekvenser med restriktionsendonukleaser .

fluorescens in situ hybridisering med peptid nukleinsyra metod (PNA fisk) är en ny detektionsteknik som riktar sig till mycket konserverade artspecifika sekvenser i den rikliga rRNA av levande C. albicans. Enskilda celler kan detekteras direkt utan behov av förstärkning . Denna teknik uppnår en känslighet på 98,7-100%, med en specificitet på 100%, vilket möjliggör diskriminering av C. albicans från fenotypiskt liknande C. dubliniensis .

Molekylbaserad teknik kan också användas för att identifiera stammar av Candida-arter, även om användningen av tekniker som pulserad Fältgelelektrofores (PFGE), slumpmässig Amplifierad polymorf DNA (RAPD) analys och upprepad sekvensförstärkning PCR (REP) är till stor del reserverade för epidemiologiska undersökningar inom forskning av oral Candidos .

10. Slutsats

under de senaste åren har en större tonvikt lagts på tillförlitlig identifiering av Candida-arter från humana kliniska prover. En schematisk representation för candidal isolering och identifiering presenteras i Figur 1. Eftersom Candida är den bosatta mikrofloran krävs lämpliga isoleringsmetoder för att fastställa närvaron i munnen tillsammans med deras antal. Det är också viktigt att identifiera de infekterande stammarna av Candida eftersom isolat av Candida-arter skiljer sig mycket, både i deras förmåga att orsaka infektion och även i deras mottaglighet för svampdödande medel. Olika fenotypiska tekniker är tillgängliga för att identifiera isolerad Candida inklusive användning av morfologiska odlingstester, differentiella agarmedier och biokemiska assimileringstester. Dessa metoder kompletteras med nya molekylära tekniker som till stor del är reserverade för epidemiologiska undersökningar.

Figur 1

Schematisk representation av isolering och identifiering av Candida-arter från munhålan.