Human cellytmarkör screening

hESC-och hPSC-RPE-celler dissocierades i enstaka celler med TrypLE i 5-10 min. Optiska vesiklar dissocierades i enstaka celler med TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) i 10 minuter, följt av fysisk dissociation genom en 20 G nål. För att möjliggöra samtidig analys av dessa olika populationer i samma prov, som detta slags, hPSC-RPE-cellerna, och optisk vesikler celler var märkt med CellTrace™ CFSE (med 0,25 µM) för 7 minuter vid 37 °C eller CellTrace™ Violett (5 µM) i 20 min vid 37 °C efter tillverkarens protokoll (Thermo Fisher Scientific). Därefter färgades de tre celltyperna med hjälp av BD Lyoplate-Screeningpanelerna (BD Biosciences) efter tillverkarens protokoll. Streckkodningen av celler gjorde det lätt att skilja mellan de tre grupperna av celler och för att minimera provvariationen under screeningen. Prover analyserades på 96-brunnsplattor på en LSRFortessa utrustad med 405, 640, 488, 355 och 561 nm lasrar (BD Biosciences) eller en CytoFLEX utrustad med 405, 638, 488 och 561 nm lasrar (Beckman Coulter). Icke-viabla celler uteslöts från analysen med 7-aad (7-aminoactinomycin D) nukleinsyrafärgämne (BD Biosciences). Analys av data utfördes med hjälp av FlowJo V.10-programvaran (Tree Star). Cellytmarkörskärmen utfördes en gång för 3D-optiska vesiklar och en gång för hPSC-RPE dag 60.

cellodling

hESC-linjerna HS980 och HS983 har tidigare framställts och odlats under xenofria och definierade betingelser30 (Etikprövningsmyndigheten: 2011/745: 31/3). Givarna gav sitt informerade samtycke för härledning och efterföljande användning av hESC-linjerna. WA09 / H9 hESC-linjen erhölls från Wicell och anpassades till matarfri kultur på hrLN-521 (10 kg/mL, Biolamina). Celler upprätthölls genom klonal förökning på hrln-521-belagda plattor i NutriStem hPSC XF medium (biologiska industrier), i en 5% CO2/5% O2 inkubator och passerade enzymatiskt vid 1:10 förhållande var 5-6 dagar.

hipsc-linjerna CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I och CTRL-14-II tillhandahölls vänligt av Karolinska Institutet iPSC Core facility: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). Donatorer gav sitt informerade samtycke för härledning och efterföljande användning av hiPSC-linjerna. Celler upprätthölls genom klonal förökning på hrln-521-belagda plattor (Biolamina) i NutriStem hPSC XF-medium (biologiska industrier), i en 5% CO2/5% O2 inkubator och passerade enzymatiskt vid 1:10 förhållande var 5-6 dagar.

för passage tvättades sammanflytande kulturer två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan Ca2+ och Mg2+ och inkuberades i 5 minuter vid 37 kcal C, 5% CO2/5% O2 med TrypLE Select. Enzymet avlägsnades sedan försiktigt och celler uppsamlades i färskt förvärmt NutriStem HPSC XF-medium genom mild pipettering för att erhålla en encellig suspension. Celler centrifugerades vid 300 kg i 4 minuter, pelleten resuspenderades i färskt förvärmt NutriStem HPSC XF-medium och celler pläterade på en ny hrln-521-belagd skål. Två dagar efter passagen ersattes mediet med färskt förvärmt NutriStem HPSC XF medium och byttes dagligen.

HPSC-RPE monolayer differentiering

ett steg-för-steg-protokoll som beskriver differentieringsprotokollet kan hittas vid Protokollutbyte36. hESC eller hiPSC pläterades med en celltäthet på 2,4 104 celler/cm2 på lamininbelagda rätter (20 2CG/mL) med NutriStem HPSC XF-medium. Rho-kinashämmare (Y-27632, Millipore) i en koncentration av 10 oc-m tillsattes under de första 24 h, medan cellerna hölls vid 37 oc C, 5% CO2/5% O2. Efter 24 h ersattes HPSC-mediet med differentieringsmedium NutriStem HPSC XF utan basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) och transformerande tillväxtfaktor-0 (TGF 2) (biologiska industrier) och celler placerades vid 37 c c, 5% CO2/21% O2. Från dag 6 efter plätering tillsattes 100 ng/mL Activin A (R&d-system) till media. Celler matades tre gånger i veckan och hölls i 30 dagar. Monolayers trypsiniserades sedan med användning av TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) för 10 min vid 37 kcal C, 5% CO2. Enzymet avlägsnades försiktigt och cellerna uppsamlades i färskt, förvärmt NutriStem HPSC XF-medium utan bFGF och TGF Bisexuell genom mild pipettering för att erhålla en encellig suspension. Cellerna centrifugerades vid 300 kg i 4 minuter, pelleten resuspenderades, passerade genom en cellfilter (40 kg i BD Biosciences) och celler såddes på lamininbelagda rätter (hrLN-111 och hrLN-521 vid 20 mg/mL) vid olika celldensiteter som sträcker sig från 1,4 106 till 1,4 104 celler i cm2. Replikerade celler matades tre gånger i veckan under de följande 30 dagarna med NutriStem hPSC XF-medium utan bFGF och TGF Bisexuell. För HPSC-RPE in vitro differentiering i 3D suspension EBs följde vi vårt tidigare publicerade protokoll 10. I korthet odlades pluripotenta stamceller till sammanflöde på rhLN-521 och skrapades manuellt för att producera EBs med en pipettspets på 1000 kg. EBs odlades sedan i suspension i lågfästplattor (Corning) vid en densitet av 5-7 104 celler/cm2. Differentiering utfördes i skräddarsytt NutriStem hESC XF-medium där bFGF och TGF Kazaki har eliminerats med mediebyte två gånger i veckan. Tio mikromoler av Rho-kinashämmare (Y-27632, Millipore) tillsattes till suspensionskulturerna endast under de första 24 h. efter 5 veckors differentiering skars pigmenterade områden mekaniskt ut ur EBs med användning av en skalpell. Celler dissocierades sedan med TrypLE Select, följt av spolning genom en 20 G nål och spruta. Celler såddes genom en cellfilter (20 2cbg, BD Biosciences) på LN-belagda rätter med en celldensitet av 0.6-1, 2 104 104 celler / cm2 och matas två gånger i veckan med samma differentieringsmedium som avses ovan. Ljusa fältbilder förvärvades med ett Nikon Eclipse TE2000 – s-mikroskop och en Canon SX170 IS-kamera användes för att fånga pigmentering från toppen av brunnarna.

kvantitativ realtids-PCR

Total RNA isolerades med användning av Rneasy plus Mini Kit och behandlades med RNAs-fritt DNas (båda från Qiagen). Komplementärt DNA (cDNA) syntetiserades med användning av 1 kg totalt RNA i 20 kg reaktionsblandning, innehållande slumpmässiga hexamers och Superscript III omvänt transkriptas (Gibco, Invitrogen), enligt tillverkarens instruktioner.

flödescytometri

cellsortering utfördes på HPSC-RPE-kulturer efter 21 eller 30 dagars differentiering. Celler inkuberades med de nämnda konjugerade antikropparna på IS i 30 minuter. FMO-kontroller inkluderades för varje tillstånd för att identifiera och gate-negativa och-positiva celler. Färgade celler sorterades sedan med hjälp av en BD FACS Aria Fusion Cell sorterare (BD Biosciences) med hjälp av FACSDiva Sofware v8.0.1.

strax efter sortering, 70.000 celler utspädda i 100 occl av 2% FBS och 1 mM EDTA (Sigma) var cytospinned för 5 min vid 400 r.p.m. på glas diabilder. Slides lämnades att torka över natten vid rumstemperatur, följt av fixering med 4% metanolfri formaldehyd vid rumstemperatur under 10 min och immunofluorescensfärgning.

immunofluorescens

histologi och vävnadsimmunfärgning

omedelbart efter eutanasi genom intravenös injektion av 100 mg/kg pentobarbital (allfatal vet. 100 mg/mL, Omnidea), ögonen var enukleerade och bleb-injektionsområdet märkt med grönt Vävnadsmärkande färgämne (TMD) (Histolab-produkter). En intravitreal injektion av 100 ml fixeringslösning (FS) bestående av 4% buffrad formaldehyd (Solvenco AB) utfördes före fixering i FS i 24-48 timmar och inbäddning i paraffin. Fyra mikrometer seriella sektioner producerades genom det TMD-märkta området och var fjärde sektion färgades med hematoxylin–eosin.

för immunfärgning deparaffiniserades glidbanor i xylen, dehydratiserades i graderade alkoholer och sköljdes med ddH2O och Tris-buffrad saltlösning (TBS, pH 7.6). Antigenhämtning uppnåddes i 10 mM citratbuffert (trinatriumcitratdihydrat, Sigma-Aldrich, pH 6.0) med 1:2000 Tween-20 (Sigma-Aldrich) vid 96 C C i 30 min, följt av 30 min kylning vid rumstemperatur. Slides tvättades med TBS och blockerades för 30 min med 10% normal donkey serum (Abcam) utspädd i TBS innehållande 5% (w/v) IgG och proteasfritt bovint serumalbumin (Jackson Immunoresearch) i en fuktad kammare. Primära antikroppar utspädda i blockeringsbuffert inkuberades över natten vid 4 CCG C: humant kärnmitotiskt apparatprotein (NuMA) (1:200, Abcam ab84680), BEST-1 (1:200, Millipore MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) och CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, klon ) (kompletterande Data 2). Sekundära antikroppar (donkey Anti-rabbit IgG (H + L) Alexa Fluor 555 A31572 och donkey Anti-mouse IgG (H + L) Alexa Fluor 647 A31571, båda från Thermo Fisher Scientific) (kompletterande Data 2) utspädd 1:200 i blockerande buffert inkuberades 1 h vid rumstemperatur. Sektionerna monterades med vector Vectashield med DAPI ((4′,6-diamidino-2-fenylindol)) monteringsmedium (Vektorlaboratorier) under en 24 20 mm2-täckglas.

för immunhistokemi deparaffiniserades diabilder följt av antigenhämtning (ER2-lösning, pH 9, 20 min, Leica Biosystems) och färgning (IHC-protokoll F) för CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432 ) och CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, klon) antikroppar (kompletterande Data 2) på Bond RXm-instrument (Leica Biosystems).

bilder togs med Olympus Ix81 fluorescens inverterat mikroskop eller Zeiss LSM710-NLO punktskanning konfokalt mikroskop. Analys efter förvärvet av bilderna utfördes med hjälp av ImageJ-programvaran.

fagocytosanalys

Fluoresceinisotiocyanatmärkt bovint POSs isolerades och gavs vänligt av Dr.E. F. Nandrot från Institut de la Vision, Paris37. HPSC-RPE-celler odlades på transwellmembran (0,33 cm2, Corning) belagd med hrLN-521 20 occurg/mL i 1 månad efter sådd. Cellerna inkuberades vid 37 C eller 4 c c under 16 timmar med 2,42 106 C tinade POS / Transwell utspädd i DMEM (Dulbecco ’s modified Eagle’ s medium)respektive CO2-oberoende medier (båda från Thermo Fisher Scientific). Efter inkubation släcktes cellerna med Trypanblå lösning 0.2% (Gibco, Invitrogen) i 10 min vid rumstemperatur, fixerad med 4% metanolfri formaldehyd (Polysciences) vid rumstemperatur i 10 min och permeabiliserad med 0,3% Triton X-100 I D-PBS i 15 min. Rhodaminfalloidinfärgning (1:1000, 20 min vid rumstemperatur, Biotinum 00027) (kompletterande Data 2) användes för att visualisera cellgränserna. Kärnor färgades med Hoechst 33342 (1: 1000, 20 min vid rumstemperatur, Invitrogen).

bilder förvärvades med Zeiss LSM710-NLO punktskanning konfokalt mikroskop. Efter förvärvet analys av bilderna utfördes med hjälp av Imaris (Bitplane) och POS kvantifieringar gjordes med CellProfiler 2.1.1 programvara. Moduler som används: LoadImages, ColorToGrey, Identifiyprimaryobjects, MeasureObjectSizeShape, SaveImages och ExportToSpreadsheet. Objekt identifierades med en typisk diameter på 10-40 pixelenheter med två klasser, Global, Otsu, vägd varians tröskelmetod med 0,01 och 1,0 nedre och övre gränser och 2,1 korrigeringsfaktor, med klumpade objekt som kännetecknas av intensitet.

enzymbunden immunosorbentanalys

HPSC-RPE-celler odlades på Transwellmembran (0,33 cm2, Millipore) belagda med olika substrat. Supernatanter från både HPSC-RPE apikala och basala sidor (vilket betyder övre och nedre fack i transwellen) samlades 60 h efter att mediet ändrats. PEDF-sekretionsnivåer mättes i triplikat för varje tillstånd med kommersiellt tillgängliga humana PEDF ELISA-Kit (BioVendor RD191114200R) användes, i enlighet med tillverkarens instruktioner, efter 60 dagars kultur. Den optiska tätheten Sreadings mättes med användning av SpectraMax 250 Mikroplattläsare (molekylära enheter). Resultaten presenteras som medelvärde för sem i enlighet med detta.

teer-mätningar

Transepitelial elektrisk resistans RPE-celler pläterade på Transwells (0,33 cm2, Millipore) mättes med Millicell electric Resistance System volt-ohm meter (Millicell ERS-2, Millipore), enligt tillverkarens instruktioner. Sextio dagars kulturer jämvikts utanför inkubatorn vid rumstemperatur i 15-20 minuter före experimentet. Mätningar utfördes i oförändrade odlingsmedier i tre exemplar för varje tillstånd, vid tre olika positioner för varje brunn. Medelvärden användes för vidare analys. Bakgrundsresistensen bestämdes från en blank kulturinsats i samma media belagd med motsvarande substrat men utan celler och subtraherades från respektive experimenttillstånd. Mätningar rapporteras som motstånd i ohm gånger området i kvadratcentimeter (cm2). Resultaten presenteras som medelvärde för sem i enlighet med detta.

Scanningelektronmikroskopi

HPSC-RPE-celler odlades på transwellinsatser belagda med LN521 (20 oC/mL) i 60 dagar. De fixerades genom nedsänkning i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,4. Transwellmembranet skars ut och tvättades i MilliQ-vatten före stegvis etanoldehydrering och kritisk punkttorkning med koldioxid (Leica EM CPD 030). Inlägg monterades på provstubbar med kolhäftflikar och sputter belagd med ett tunt lager av platina (kvorum Q150T ES). Scanningelektronmicroscopy avbildar förvärvades genom att använda en ultra 55 sätter in utsläpp scanningelektronmikroskop (Zeiss, Oberkochen, Tyskland) på 3 kV och SE2-detektorn.

transmissionselektronmikroskopi

HPSC-RPE-celler odlades på transwellinsatser belagda med LN521 (20 oC/mL) i 60 dagar. De fixerades genom nedsänkning i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,4. Transwellmembranet skars ut och i tunna remsor, sköljdes i 0,1 M fosfatbuffert, följt av postfixering i 2% osmiumtetroxid i 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,4, vid 4 kcal C för 2 timmar. Membranremsorna utsattes för stegvis etanoldehydrering och slutligen platt inbäddad i LX-112. Ultratunna sektioner (~50-60 nm) framställdes med användning av en Leica EM UC7 och kontrasterades med uranylacetat, följt av blycitrat. Transmissionselektronmikroskopi avbildning gjordes på en Hitachi HT7700 transmissionselektronmikroskop (Hitachi High-Technologies) drivs vid 80 kV och digitala bilder förvärvades med hjälp av en Veleta CCD-kamera (Olympus Soft Imaging Solutions).

Single-cell RNA-sekvensering bioinformatisk analys

sextio-dagars HPSC-RPE-celler dissocierades med användning TrypLE Select och passerade genom en cellsil (20 oC, BD Biosciences). De resuspenderades i en koncentration av 1000 celler/tubyl i 0,04% BSA i PBS. Celler transporterades vid 4 CCB till Eukaryotic Single Cell Genomics Facility (ESCG, SciLifeLab, Stockholm, Sverige) där ett 3′ cDNA-bibliotek förbereddes för single-cell RNA-sekvensering med 10x Genomics-plattformen (10x Genomics) med hjälp av NovaSeq 6000-programvaran. Cell Ranger 2.1.1 (10x Genomics) pipeline användes för att konvertera Illumina base call-filer till fastq-format, justera sekvensering läser till hg19 transkriptom med hjälp av STAR aligner38, och generera funktions streckkod matriser. Cell Ranger kvalitetskontrollfiltrerade celler (718, 810, 931 och 1129 cellinnehållande droppar fångades för CD140b+GD2 -, CD140b+CD184−, replikerade 1:20 respektive hESC− prover) analyserades i R version 3.5.1 (R Core Team)39, med användning av Seurat suite version 2.3.440, 41. Som en ytterligare kvalitets-kontroll, RPE celler med ett unikt uttryck av gener (≥2000 ≤5000), UMIs (≥10 000 till ≤30,000) och andel av UMI kartläggning till MT gener (≥0.025 till ≤0.10) valdes ut. På samma sätt, med detta slags unikt uttryck av gener (≥2000 ≤8000), UMIs (≥10 000 till ≤80 000 invånare), och andelen UMI kartläggning till MT gener (≥0.025 till ≤0.10). Detta filtreringssteg resulterade i slutlig dataset av 616, 725, 779 och 905 celler för CD140b+GD2−, CD140b+CD184−, replikerade 1:20 respektive hESC-prover. Före dimensionalitetsreduktion genom huvudkomponentanalys (PC) regresserades cellcellsvariation i genuttryck drivet av UMIs, mitokondriellt genuttryck och cellcykelstadier under dataskalningsprocessen42. Variabla gener inom RPE-prover valdes baserat på deras normaliserade genomsnittliga uttryck och dispersion (expression cut-off = 0,0125–5 och bottendispersion cut-off = 0,5). För PC-val bedömdes resultaten av PCHeatmap, jackStraw, PC-standardavvikelser och Clustree-analys 43. De första 15 datorerna användes för tSNE-projektionen44 och klusteranalys (upplösning = 0, 1, förvirring = 40).

cellkluster analyserades med två tillvägagångssätt. Toppdifferentialgener identifierades först för varje kluster med Wilcoxons rank-sum-test. Sekundär, signaturgenuttryck (modulpoäng) beräknades för odifferentierad hESC och flera celltyper närvarande i mänsklig näthinna. Celler som uttrycker mesodermmarkörer delades manuellt i ett separat kluster med hjälp av interaktiva plottningsfunktioner i Seurat. Data laddas upp i ArrayExpress (EMBL-EBI)—se detaljer nedan.

djur

Efter godkännande av Northern Stockholm Animal Experimental Ethics Committee (DNR N25/14) användes 10 Nya Zeelands vita albinokaniner (tillhandahållna av Lidk Jacobpings rabbit farm, Lidk Jacobping, Sverige) i åldern 5 månader, som väger 3,5 till 4,0 kg i denna studie. Alla experiment utfördes i enlighet med uttalandet för användning av djur i oftalmisk och Synforskning.

Subretinal transplantation

HPSC-RPE monolager tvättades med PBS, inkuberades med TrypLE och dissocierades till encellssuspension. Celler räknades i en Neubauer-hemocytometerkammare med användning av 0,4% Trypanblått (Thermo Fisher Scientific Corp.), centrifugerades vid 300 kcal g i 4 minuter, och cellpelleten återsuspenderades i nyfiltersteriliserad PBS till en slutlig koncentration av 1000 celler/mikhaill. Cellsuspensionen aseptiskt alikvoterades sedan i 600 enheter av UCL och hölls på is tills operationen.

djur sattes under generell anestesi genom intramuskulär administrering av 35 mg/kg ketamin (Ketaminol, 100 mg/mL, Intervet) och 5 mg/kg xylazin (Rompun vet. 20 mg/mL, Bayer Animal Health) och pupillerna utvidgades med en blandning av 0,75% cyklopentolat/2,5% fenylefrin (APL). Mikrokirurgi utfördes på båda ögonen med en 2-port 25 G transvitreal pars plana-teknik (Alcon Accurus, Alcon Nordic) som beskrivits tidigare45. Cellsuspensionen drogs in i en 1 mL spruta ansluten till ett förlängningsrör och en 38g polytip-kanyl (MedOne Surgical Inc). Utan föregående vitrektomi infördes kanylen genom den övre temporala trokaren. Efter korrekt spetspositionering, fastställd av en fokal retinal flare, injicerades 50 oc-l cellsuspension (motsvarande 50 000 celler) långsamt subretinalt ~6 mm under den nedre marginalen hos det optiska nervhuvudet och bildade en enhetlig bleb som var tydligt synlig under operationsmikroskopet. Försiktighet togs för att bibehålla spetsen i bleben under injektionen för att minimera återflöde. Efter avlägsnande av instrumentet applicerades lätt tryck på de självtätande suturlösa sklerotomierna. Två mikrogram (100 mikrogram) intravitreal triamcinolon (Triescence, Alcon Nordic) administrerades 1 vecka före operationen och inga postkirurgiska antibiotika gavs.

statistik och reproducerbarhet

för statistiska analyser utfördes tvåvägsanalys av varians och post hoc-multipla jämförelser med användning av Tukeys testkorrigering för att bedöma in vitro-skillnaderna mellan de olika densiteterna bedömda och sorterade kontra replierade förhållanden i teer-och PEDF-sekretionsanalyser.

alla kvantifieringar utfördes oblindade. Statistiska parametrar inklusive definitionerna och det exakta värdet av n (t.ex. totalt antal experiment, replikationer etc.), avvikelser, p-värden och typerna av statistiska tester rapporteras i figurerna, motsvarande figurlegender och i detta avsnitt. Statistisk analys utfördes med användning av Prism 7 (GraphPad-programvara, version 7.0 c). I alla fall utfördes statistisk analys på data från minst tre biologiskt oberoende experimentella replikat. Jämförelser mellan grupper planerades innan statistisk testning och måleffektstorlekar inte var förutbestämda. Felstaplar som visas på grafer representerar medelvärdet av sem för minst tre oberoende experiment. Alla mikrografer som visas är representativa bilder av tre oberoende experiment, om inte annat anges (t.ex. Fig. 1c).

rapportsammanfattning

Mer information om forskningsdesign finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till denna artikel.