utnyttjande av ATP-analoger av konstruerade CDK: er

vi genererade mutanta ’Shokat’ CDK: er innehållande aminosyrabyten vid en konserverad skrymmande rest i deras ATP-bindningsfickor. I fallet med CDK2 och CDK3 var detta en fenylalanin till alaninbyte vid position 80, betecknad CDK2 (F80A). Vi syntetiserade också 12 ATP-analoger för att bestämma om de konstruerade CDK: erna kan använda dessa analoger för att fosforylera rekombinant retinoblastom (Rb) protein in vitro och fann att de utnyttjade N6-(2-fenyletyl)-ATP (PE-ATP) mest effektivt (Figur 1a och data visas inte). Även om både vildtyp och cyklin E-CDK2 (F80A) använde normalt ATP för att fosforylera glutation-S-transferas (GST)-Rb-protein, kunde endast F80A-Kinas använda PE-ATP. Liknande resultat erhölls med cyklin E-CDK3, men i detta fall kunde f80a-mutanten inte längre använda normal ATP, även om den strukturella grunden för denna observation är oklar (Figur 1a). Dessa studier bekräftade att vildtypen och konstruerade kinaser uppvisar de önskade ATP-specificiteterna.

medan de mutanta CDK: erna effektivt använde PE-ATP för att fosforylera Rb in vitro, misslyckades liknande experiment med användning av radioaktivt märkt PE-ATP i celllysater eftersom det märkta fosfatet klyvdes från PE-ATP av en ATPas-aktivitet i lysaterna (data visas inte). Vi bytte därför till tiofosfatformen av ATP-analogen (PE-ATP-Kazaki-S), som inte hydrolyserades av lysater (Figur 1b). Även om kinaser ofta använder ATP-Kazaki-S mindre effektivt än normalt ATP, har tiofosforylering flera fördelar i detta sammanhang. För det första är tiofosfater mer stabila och resistenta mot fosfataser . För det andra, eftersom det inte finns några existerande tiofosforyleringshändelser i cellerna, ger tiofosfatmärkning unika markörer för proteiner fosforylerade av mutantkinas. Slutligen har tiofosfatgruppen liknande kemiska egenskaper som sulfhydrylgruppen och är mottaglig för kemiska modifieringar. Vi uttryckte och renade lösliga vildtyp-och cyklin a-CDK2 (F80A) komplex från bakterier och utförde en liknande RB-kinasanalys för att testa deras förmåga att använda PE-ATP-Kazaki-S. Som visas i Figur 1C, även om båda kinaserna kan använda ATP eller ATP-sackios-S för att fosforylera GST-Rb-protein (som indikeras av dess elektromobilitetsförskjutning), kan endast f80a-mutanten använda PE-ATP-sackios-S. Vi använde således PE-ATP-sackios-S för alla våra efterföljande studier.

enkelstegsrening av tiofosforylerade peptider

användningen av konstruerade CDK och ATP-analoger underlättar mycket specifik substratfosforylering: nästa utmaning är hur man identifierar dem inom ett komplext lysat. Vi försökte utnyttja tiofosfatmärkena för att kovalent fånga och berika tiofosforylerade peptider efter fosforylering och uppslutning av lysaterna. Ett nyckelproblem var emellertid att kemiskt skilja tiofosforpeptider och cysteininnehållande peptider. Även om en kemoselektiv metod för att berika tiofosforpeptider har beskrivits, gör det överväldigande överflödet av cysteinrester i en komplex proteinblandning detta tillvägagångssätt svårt . Vi använde en enkel infångnings – och frisättningsmetod för att selektivt isolera tiofosforylerade peptider inom trypsiniserade celllysater (figur 2a). Proteinerna i lysatet fosforylerades in vitro med cyklin a-CDK2 (F80A) och PE-ATP-sackarios-S. proteinblandningen smältes därefter och de resulterande peptiderna blandades med Tiopropylsefaros 6B , ett aktiverat disulfidharts som fångar både cysteininnehållande peptider och tiofosforpeptider genom en disulfidbytesreaktion. Eftersom traditionell ditiotreitol (DTT) eluering frigör båda typerna av bundna peptider, utnyttjade vi de kvalitativa skillnaderna mellan hartsbundna tiofosfatpeptider och cysteininnehållande peptider vid fosfortiolatsulfidbindningen respektive alkyldisulfidbindningen. Vid höga pH-värden hydrolyseras fosfortiolatsulfidlänken och alkyldisulfiden förblir intakt . Behandling av hartset med en stark bas (såsom natriumhydroxid) frisätter specifikt tiofosforpeptider (och omvandlar dem också till normala fosfopeptider), men inte de cysteininnehållande peptiderna, genom hydrolysering av fosfortiolatsulfidbindningen (Figur 2B). Eftersom peptider bundna via cystein inte elueras i det sista steget, kan vi inte återställa cysteininnehållande tiofosforpeptider. Dessutom resulterar elueringen i förlust av tiofosfatsignaturen genom att omvandla tiofosfopeptiden till en fosfopeptid. Vår tiophopopeptidisoleringsmetod skiljer sig blygsamt från Blethrow et al. genom att vi fångar upp tiofosfopeptiderna med disulfidbyteskemi (disulfidharts) istället för alkylering (jodoacetamidharts), och vi eluerar dem selektivt med bashydrolys snarare än oxidation.

för att testa genomförbarheten av detta tillvägagångssätt, fosforylerade vi GST-Rb med cyklin A-CDK2 (F80A) och PE-ATP-Kazaki-S, och tillämpade vårt reningsförfarande på en trypsinsmältning av reaktionsblandningen. De isolerade peptiderna analyserades med elektrospray tandem masspektrometri (ESI-MS/MS) med användning av en jonfälla masspektrometer. Peptider identifierades genom att matcha tandemmasspektra till en human proteinsekvensdatabas (med GST-Rb-sekvens tillsatt) med hjälp av SEQUEST-programvara . GST-Rb-substratet innehåller fem cysteiner samt sju SP / TP-platser, vilka är platser som gynnas för CDK-fosforylering . Vi återhämtade flera fosfopeptider innehållande endast och alla förväntade fosforyleringsställen (Tabell 1). Dessutom återhämtade vi inga cysteininnehållande peptider och mycket få icke-specifika peptider. Detta gav ett principbevis för våra storskaliga analyser.

identifiering av humana cyklin a-CDK2-substrat i celllysater

vårt mål var att identifiera potentiella cyklin a-CDK2-substrat i proteomskala. För att minska provkomplexiteten fraktionerade vi hela celllysatet av HEK293-celler i 11-fraktioner med jonbytarkromatografi och ammoniumsulfatutfällning (ytterligare datafil 1). Vi utförde sedan in vitro-kinasanalyser på varje fraktion. Som en positiv kontroll tillsatte vi också en liten mängd GST-Rb till varje reaktion. Efter att ha smält reaktionsblandningen med trypsin tillämpade vi vårt reningsprotokoll för att isolera tiofosfopeptiderna från peptidblandningarna. De återvunna peptiderna utsattes för vätskekromatografi-MS / MS-analys och databassökning. Vi återhämtade varierande antal peptider och minst en RB-fosfopeptid från var och en av lysatfraktionerna (ytterligare datafil 2).

CDKs fosforylatproteiner på ett prolinriktat sätt på antingen serin eller treonin, och många studier stöder tanken att motivet S/T-P-X-R/K representerar CDK-konsensusmotivet. Från fosfopeptiderna identifierade vi totalt 203 proteiner: 180 kandidater fosforylerades inom SP-eller TP-motiv (prolinriktad; ytterligare datafil 3). Dessa kandidatsubstrat representerar ett brett spektrum av biologiska processer, inklusive cellcykelkontroll, DNA-och RNA-metabolism, translation och cellulära strukturer (Figur 3). Totalt 96 av 222 (43%) av de prolinriktade platserna överensstämde med den kända CDK-konsensusen (med en positivt laddad rest i +3-positionen). Intressant nog innehöll cirka 24% av de prolinriktade platserna (53/222) en positivt laddad rest i antingen +4 eller +5-positionerna, vilket tyder på att detta motiv också kan gynnas av CDK2. Verkligen, Blethrow et al. noterade också att ett betydande antal cyklin B-CDK1-substrat innehåller icke-konsensusställen. För de peptider som innehöll icke-konsensusställen fann vi att cirka 50% av motsvarande proteiner Bar minst ett k/RXL-eller K/Rxlx-motiv (där Bisexuell är en stor hydrofob rest och X är vilken aminosyra som helst) distalt till fosforyleringsställena, och nästan alla av dem Bar minst ett minimalt RXL-motiv (ytterligare datafil 3). Detta överensstämmer med den väletablerade tanken att dessa motiv främjar cyklin A-CDK2-bindning till substrat . Förutom att välja för fosforyleringar med CDK-konsensusmotiv identifierade vi 28 proteiner som tidigare har implicerats som CDK-substrat (markerade med fetstil i ytterligare datafil 3) . Således har nästan 15% av våra kandidater tidigare hittats som CDK-mål, vilket ytterligare stöder tanken att våra metoder fångade och berikade för CDK2-substrat. Slutligen har 43% av de fosforyleringar vi hittat tidigare identifierats i storskaliga, in vivo fosfoproteomanalyser, vilket indikerar att dessa fosforyleringar inte är begränsade till våra I lysatförhållanden .

både våra studier och de som rapporterats av Blethrow et al. används liknande fosfopeptidisoleringsscheman och relaterade cyklin-CDK, och vi förväntade oss att det kan finnas väsentlig överlappning i substraten som avslöjats av båda studierna. Faktum är att vi hittade nästan 50% (30/68) av cyklin B-CDK1-substraten i vår lista över cyklin A-CDK2-kandidater; således är dessa metoder robusta och reproducerbara (ytterligare datafil 4). Det finns emellertid också väsentliga skillnader mellan de två listorna, och dessa berodde sannolikt på många faktorer, inklusive procedurskillnader, olika celltyper, ofullständig peptididentifiering med MS och substratspecificitet som ges av cyklin-och/eller kinasunderenheterna. Vissa av dessa skillnader kan också återspegla de olika biologiska funktionerna hos cyklin A-CDK2 och cyklin B-CDK1. Till exempel fann vi nio proteiner involverade i proteinöversättning och/eller ribosomfunktion, men ingen av dessa proteiner hittades med cyklin B-CDK1, trots deras relativt höga överflöd.

Även om vi identifierade ett antal kända CDK2-substrat identifierade vi inte några tidigare beskrivna CDK2-substrat. Några av de faktorer som anges ovan kan också redogöra för misslyckandet med att hitta kända CDK2-substrat i våra analyser. Dessutom skulle substrat som redan fosforylerats av endogena CDK inte ha tiofosforylerats in vitro. Det är också möjligt att vissa proteiner inte solubiliserades under lysatberedning och/eller ultraljudsbehandling steg och uteslutas från våra analyser. Slutligen är det möjligt att stora proteinkomplex kan ha störts av fraktioneringsprocedurerna före kinasreaktionen, och att proteiner som fosforyleras av CDK2 endast i samband med dessa komplex kanske inte upptäcks med våra metoder.

vi återhämtade också fyra fosfopeptider motsvarande cyklin A och CDK2 och 27 ytterligare fosfopeptider med icke-prolinstyrda platser (ytterligare datafil 5). Vi misstänkte att dessa fosfopeptider berodde på autofosforylering av cyklin A-CDK2 och bakgrundsfosforylering av andra kinaser, och andra har rapporterat liknande bakgrundsfosforylering . För att testa dessa möjligheter utförde vi en kontrollkinasreaktion med användning av cyklin A-CDK2 (F80A) och PE-ATP-askorbic-S utan celllysat tillsatt och återhämtade tre av de fyra cyklin a-CDK2-peptiderna (ytterligare datafil 5). Vidare, när vi utförde en liknande ’Kinas-endast’ reaktion i närvaro av 62P-ATP, observerade vi 32P inkorporering i båda dessa proteiner på ett dosberoende sätt (ytterligare datafil 6). Dessa experiment bekräftade att det fanns bakgrundsautofosforylering av cyklin A-CDK2 i de ursprungliga analyserna.

Vi utförde också kontrollkinasreaktioner med hjälp av lysatfraktionerna, GST-Rb ’spike-in’, och PE-ATP-0-S utan tillsats av cyklin A-CDK2. Dessa’ no-Kinas ’ – kontrollreaktioner fosforylerade 7 av de 27 icke-prolinstyrda fosfopeptiderna på vår lista (ytterligare datafil 5), vilket tyder på att de flesta, om inte alla, av dessa fosfopeptider berodde på bakgrundsfosforylering av kinaser som kan använda ATP-analogen i begränsad utsträckning. Till exempel innehåller de flesta av dessa peptider sura reststyrda fosforyleringsställen som är kaseinkinas 2-motiv. Kaseinkinas 2 är unik genom att den kan använda GTP såväl som ATP; sålunda kan den aktiva platsen rymma de skrymmande ATP-analogerna, såsom PE-ATP . Det är viktigt att vi inte återhämtade några RB-fosfopeptider från dessa kontrollexperiment, vilket indikerar att det inte fanns någon icke-specifik CDK-aktivitet i våra analyser. Vi återhämtade också 44 omodifierade peptider, varav 12 innehöll cysteinrester. Majoriteten av dessa peptider härstammar från flera lysatfraktioner (ytterligare datafil 2). Vi misstänker att dessa berodde på låg nivå icke-specifik bindning av peptider till hartset trots stränga tvättförhållanden, och i fallet med de cysteininnehållande peptiderna, från en liten mängd hydrolys av alkyldisulfidlänkningen under elueringssteget. Sammanfattningsvis var våra metoder mycket selektiva och våra studier identifierade en överraskande stor grupp av kandidatcyklin a-CDK2-substrat, varav de flesta inte tidigare har identifierats som CDK-mål.

validering av kandidatsubstrat som cyklin A-CDK2-mål

vi använde flera strategier för att validera några av de nya kandidaterna i vår lista som cyklin A-CDK2-substrat. Eftersom våra proteinidentifieringar baserades på peptidsekvenser började vi med att bekräfta att cyklin A-CDK2 fosforylerade tre fullängds-och infödda kandidater som immunoprecipiterades via epitope-taggar från transfekterade 293-celler (EF2, TRF2 och RAP1). Eftersom dessa proteiner inte fanns på cyklin B-CDK1-listan bestämde vi om de också fosforylerades av cyklin B-CDK1. Varje CDK2-kandidat fosforylerades av både cyklin A-CDK2 och cyklin B-CDK1, även om EF2 fosforylerades i mindre utsträckning än antingen TRF2 eller RAP1 (figur 4a). Vi uttryckte också TRF2, RAP1 och det ribosomala proteinet RL12 som GST-fusioner och renade dem från Escherichia coli. När vi använde cyklin A-CDK2 för att fosforylera TRF2 och RAP1 in vitro var proteinerna mycket fosforylerade och MS-analyser avslöjade att dessa fosforyleringar inträffade på samma ställen som vi ursprungligen identifierade (figur 4b). Vi använde också cyklin A-CDK2 och cyklin B-CDK1 för att fosforylera GST-RL12 och fann att båda CDK: erna också fosforylerade RL12 in vitro (figur 4c). Dessa studier bekräftar således att peptiderna som identifieras i vår skärm representerar proteiner som kan fosforyleras av cyklin A-CDK2, åtminstone in vitro. Även om vi hittade kvalitativa skillnader i förmågan hos cyklin A-CDK2 och cyklin B-CDK1 att fosforylera specifika proteiner, fosforylerades kandidaterna i båda fallen av båda CDK: erna. Eftersom enzympreparatet vi använde i dessa studier innehöll ett överskott av fri CDK2 (F80A), övervägde vi möjligheten att vissa substratfosforyleringar kan bero på föreningen av endogena cykliner med CDK2 (F80A) som antingen var monomera eller som kan ha dissocierats från cyklin A under analysförhållandena. Vi fann att mängden cyklin B-CDK2 (F80A) aktivitet i dessa extrakt var försumbar jämfört med cyklin A-CDK2 (F80A), och vi kunde inte upptäcka någon cyklin E-CDK2 (F80A) aktivitet (ytterligare datafil 7). Icke desto mindre kan vi inte utesluta möjligheten att vissa peptider kan ha fosforylerats av CDK2 (F80A) i komplex med en endogen cyklin, och specificiteten hos något kandidatsubstrat för cyklin A jämfört med andra cykliner som aktiverar CDK2 måste valideras enligt beskrivningen nedan.

validering av RL12 som ett in vivoCDK2-substrat

ovanstående studier validerade flera nya kandidater identifierade i vår skärm som CDK2-substrat in vitro. För att bestämma om ett nytt substrat också fosforyleras av CDK2 in vivo utförde vi en mer omfattande analys av det ribosomala proteinet RL12. Vi blandade först immunoprecipitates av epitop-taggade cyklin a-CDK2 och RL12 uttryckt i humana celler i närvaro av 62P-ATP och fann att cyklin a-CDK2 fosforylerade RL12 in vitro (figur 5a). Fosforyleringen avskaffades till stor del i en mutant RL12 där den identifierade fosfoserin S38 ersattes med en alanin, och den återställdes när S38 ersattes med en treonin (figur 5b). Vi använde sedan fosfopeptidkartläggning för att identifiera peptiden innehållande S38 och bekräftade att den fosforylerades direkt av CDK2 in vitro (figur 5c). För att testa om RL12 också fosforyleras in vivo på ett CDK2-beroende sätt på samma plats, vi metaboliskt märkta celler med 32P-ortofosfat, och immunoprecipitated vildtyp eller RL12-S38A från celler som överuttrycker antingen cyklin E-CDK2, katalytiskt inaktiv cyklin E-CDK2, eller CDK-hämmaren p21 (för att hämma endogena CDK) . Eftersom vi inte kan studera endogen rl12-fosforylering på grund av bristen på en lämplig anti-RL12 – antikropp, undersökte dessa studier fosforyleringen av ektopisk RL12 in vivo (dessa transfektionsförhållanden ledde till ett ungefär fem-till tiofaldigt överuttryck av RL12 mRNA (ytterligare datafil 8). Vi fann att vildtyp RL12, men inte RL12-S38A, fosforylerades in vivo (figur 5d). Denna fosforylering förbättrades i celler som överuttryckte cyklin E-CDK2, men inte inaktiv cyklin E-CDK2, och minskade i celler som överuttryckte p21 CDK-hämmaren (som hämmar endogena cyklin-CDK; Figur 5d). Slutligen använde vi fosfopeptidkartläggning och fosfoaminosyraanalyser av rl12-proteinimmunutfällt från de märkta cellerna och bekräftade att rl12-fosforylering med cyklin E-CDK2 in vivo också inträffade på S38 (figur 5e). Rl12 S38 fosforylering in vivo har också rapporterats i fosfoproteomstudier .

Även om vi har validerat var och en av de nya kandidaterna som vi hittills har testat genom att visa att fullängdsproteinerna fosforyleras av CDK2, kommer vissa kandidater på vår lista sannolikt inte att vara fysiologiskt relevanta cyklin a-CDK2-substrat. Exempelvis utfördes kinasreaktionerna i lysater, och in vivo subcellulär avdelning kan begränsa tillgången till CDK2 till vissa kandidater. Dessutom är det möjligt att andra cellulära kinaser antingen är överflödiga med eller viktigare än CDK2 med avseende på enskilda substrat in vivo. Det är därför kritiskt att kandidater utvärderas noggrant i ett så fysiologiskt sammanhang som möjligt. Mot detta ändamål använder vi i pågående studier en geninriktad metod för att mutera en delmängd av dessa fosforyleringsställen i de endogena generna för att studera deras fysiologiska betydelse.