Svampvärd

filamentösa svampar kan fungera som värdar för en mikrobiell karminsyracellfabrik eftersom de har kapacitet att leverera ett gott utbud av acetyl-CoA-och malonyl-CoA-byggstenar för syntes av polyketiden byggnadsställning. De erbjuder också den nödvändiga cellulära infrastrukturen för att rymma er-membranbundet C-glukosyltransferas UGT28. Eftersom A. nidulans har en välutvecklad genteknisk verktygslåda valde vi denna art som utgångspunkt för utvecklingen av en svampkarminsyracellfabrik. Liksom de flesta filamentösa svampar kan A. nidulans producera en uppsjö av biosyntetiskt olika sekundära metaboliter inklusive ett betydande antal aromatiska polyketider. Chiang et al. har tidigare visat att radering av genkluster som är ansvariga för bildandet av de stora endogena PKS-produkterna i A. nidulans11, förbättrade potentialen hos A. nidulans som en cellfabrik för heterolog produktion av polyketider. På detta sätt ökas poolerna av acetyl-CoA och malonyl-CoA byggstenar, och de efterföljande kemiska analyserna för bildandet av nya produkter förenklas. Som ett första steg mot en svampcellsfabrik för karminsyraproduktion eliminerade vi därför de biosyntetiska vägarna för de dominerande aromatiska polyketiderna som potentiellt kan störa karminsyraproduktionen och komplicera analysen och nedströmsreningen. Specifikt eliminerades genklusterna för produktion av asperthecin, monodictyphenone och sterigmatocystin såväl som generna som var ansvariga för grön conidia pigmentbildning, wA och yA, eliminerades i en icke-homolog endjoining defficient A. nidulans bakgrund. Förutom den förväntade bristen på konidiala pigment visade den resulterande stammen, NID2252, inga synliga effekter på morfologi och kondition (kompletterande fil, Fig. 1). Vi använde därför NID2252 som referensstam och som grund för byggandet av en svampcellsfabrik för karminsyraproduktion.

Design av en halv naturlig väg för flavokermesinsyraantronbildning

den huvudsakliga vägspärren för byggandet av en mikrobiell karminsyracellfabrik var brist på en naturlig PKS som syntetiserar flavokermesinsyraantron, den första förmodade mellanprodukten i vägen. För att kringgå denna begränsning följde vi en alternativ biosyntetisk väg för produktion av denna polyketid. Octaketide flavokermesinsyraantron, med dess C7-C12, C5-C14 och C2-C15 cykliseringsmönster, kunde i teorin bildas i ett enda steg av en svamp icke-reducerande typ I iterativ PKS som har en lämplig produktmall domän (Fig. 1 vänster). Emellertid har inga sådana enzymer ännu beskrivits i litteraturen. En alternativ mekanism för att bilda flavokermesinsyraantron är via en tvåstegsreaktion där en PKS syntetiserar en icke-reducerad linjär oktaketidkedja, som därefter cykliseras till den önskade strukturen av transverkande cyklaser/aromataser (Fig. 1 höger). Reaktioner av denna typ finns i naturen i t.ex. aktinorhodin (Act) – vägen i Streptomyces coelicolor12. I detta fall syntetiseras oktaketid-ryggraden av ett bakteriellt typ II-PKS-system med flera subenheter, KSa, ks och ACP (act minimal PKS), som reduceras med actKR vid position C9 och därefter viks av aromatas/cyklas, actARO/CYC och cyklas actCYC2, för att ge den tricykliska föreningen 3,8-dihydroxi-1-metylantrakinon-2-karboxylsyra (DMAC) 7. DMAC visar samma veck som flavokermesinsyraantron men reduceras vid C9-positionen.

av särskilt intresse för den aktuella studien är ZhuI-cyklas och ZhuJ aromatas från Streptomyces sp. R1128, som katalyserar två sekventiella cykliseringsreaktioner av icke-reducerade linjära polyketider i veck som liknar flavokermesinsyra en trone13. Specifikt är ZhuI-cyklas ansvarig för att stänga den första ringen, C7-C12 och ZhuJ aromatas för att stänga den andra ringen, C5-C14. Den tredje ringen, C2-C15, bildas spontant. ZhuI och ZhuJ har tidigare varit co-uttryck i S. coelicolor med oktaketidbildande typ II verkar minimala PKS vilket resulterar i bildning av flavokermesinsyra, känd som 3,6,8-trihydroxi-1-metylantrakinon-2-karboxylsyra (tmac) i bakteriell litteratur14. Tyvärr kan en identisk strategi vara svår att genomföra i A. nidulans eftersom typ II minimal PKSs inte har implementerats framgångsrikt i heterologa värdar utanför Streptomyces-släktet trots flera försök15. Och våra försök att rekonstruera act miniPKS i A. nidulans och Saccharomyces cerevisiae visade sig på liknande sätt misslyckade (data visas inte). Ett alternativt sätt att bilda den erforderliga icke-reducerade oktaketiden är att förlita sig på typ III PKS-enzymer, som framgångsrikt har uttryckts i jäst, t.ex. i samband med flavonoidbiosyntes16. Av särskilt intresse är Aloe arborescens octaketide synthase (OKS), som har beskrivits för att producera icke-reducerade oktaketider som spontant viks till SEK4 och SEK4b i vitro17 (Fig. 2a). I Aspergillus förblev det emellertid otestat om produkterna av typ III PKSs, som är AVS-oberoende enzymer som frigör karboxylsyror, kan vikas av ZhuI-typen av cyklas som har beskrivits för att verka på AVS-bundna substrat. I den aktuella studien satte vi oss därför ut för att testa kompatibiliteten hos växt typ III OKS med cyklaser / aromataser från bakteriella typ II PKS-system, i syfte att utveckla en artificiell de novo biosyntetisk väg för bildning av flavokermesinsyraantronprekursor för bildning av karminsyra.

produktion av polyketidprekursorer för karminsyraproduktion i A. nidulans

för att testa in vivo-prestanda för OKS i en svampvärd, satte vi in OKS som kontrollerades av A. nidulans gpdA-promotorn som en enda kopia till ett definierat locus (integrationsplats 5, IS5) i A. nidulans genome18. Två stammar konstruerades, en som uttrycker den ursprungliga OKS-kodningssekvensen och en som uttrycker en kodonoptimerad version för uttryck i A. nidulans. Efter sju dagars inkubation på fasta Tillväxtmedier, se avsnittet metoder för detaljer, visade båda stammarna en stark rödbrun färgning av myceliet (Fig. 2b). Metabolisk profilering av HPLC-HRMS av stammarna avslöjade inte några spår av en icke-reducerad oktaketid, utan snarare den förväntade SEK4 och SEK4b tillsammans med flavokermesinsyra och tre andra rikliga föreningar med okänd identitet (Fig. 2c), som inte fanns i referensstammen NID2252. SEK4 och SEK4b identifierades baserat på grundlig HPLC-HRMS/MS-analys (tilläggsfil, Fig. 2) och överensstämde med tidigare rapporterade värden19 medan flavokermesinsyra jämfördes med en autentisk referens isolerad från D. coccus9 (kompletterande fil, Fig. 3). Metaboliten eluerar vid 13,0 min. hade en pseudomolekylär Jon + av m / z 303.0867, motsvarande en molekylformel av C16H14O6, i överensstämmelse med den kända oktaketid shuntprodukten, mutaktin, som tidigare beskrivits i Streptomyces-baserade experiment med Act-genen cluster7. Denna identifiering bekräftades genom detaljerad analys av UV-spektrumet och stöddes av retentionstiden i förhållande till SEK4 och SEK4b (kompletterande fil, Fig. 4). De två ytterligare metaboliterna med molekylformler av C16H12O6 (- m/z 299.0566) indikerade oktaketidprodukter men motsvarade emellertid inte en vanlig shuntprodukt (kompletterande fil, Fig. 5). Därför isolerades metaboliterna och strukturförklaring baserad på 1D och 2D NMR-experiment identifierade dem som dehydro-SEK4 (även känd som B26 i bakterielitteraturen) och dehydro-SEK4b20 (kompletterande fil, Fig 6-11). Bildandet av de sex nya polyketiderna som observerats i OKS-stammen kan förklaras av tre olika spontana första ringförslutningsreaktioner: C7-C12( SEK4, dehydro-SEK4 och flavokermesinsyra), C10-C15 (SEK4b och dehydro-SEK4b) och C7-C12 efter C9-ketonreduktion (mutaktin) (Fig. 2a och tilläggsfil, Fig. 12). Av dessa möjliggör endast den första ringförslutningstypen (C7-C12) den efterföljande bildningen av den önskade flavokermesinsyraantronen via en andra C5-C14 och tredje C2-C15-ringförslutning. SEK4 och SEK4b har tidigare rapporterats att dehydrera spontant för att bilda dehydro-SEK4 respektive dehydro-SEK4b, medan bildandet av mutaktin beror på enzymatisk reduktion av C9-positionen för polyketidkedjan före vikning21. Bildningen av flavokermesinsyra, en känd mellanprodukt i karminsyravägen (Fig. 1), var oväntat eftersom denna metabolit inte har rapporterats bilda spontant från icke-reducerade oktaketidkedjor. Detta tyder på att A. nidulans naturligt producerar ett antal cyklaser / aromataser som främjar det önskade vikningsmönstret. Metabolitprofileringen av de två OKS-uttrycksstammarna visade inga väsentliga skillnader i produktionsnivåer och vi bestämde oss för att fokusera på stammen som uttrycker den ursprungliga versionen av OKS som grund för vidareutveckling av en svampcellsfabrik för karminsyraproduktion.

konstruera vikningsvägen för icke-reducerade oktaketider

den promiskuösa vikningen av den icke-reducerade oktaketiden minskar utbytet av önskvärd flavokermesinsyra. Vi föreställde oss därför att flavokermesinsyraproduktionen kunde ökas genom att effektivisera vikningsprocessen i önskad riktning genom att uttrycka kodonoptimerade versioner av ZhuI och ZhuJ. För att undersöka om ZhuI och ZhuJ stör den nativa metabolismen av A. nidulans konstruerade vi först stammar som uttrycker ZhuI och ZhuJ individuellt och i kombination från definierade genomiska loci (IS6 och IS7) i A. nidulans nid2252 referens stam. Metabolisk profilering av HPLC-HRMS av de tre stammarna avslöjade inte några detekterbara metaboliska skillnader (Fig. 3b). Vi konstruerade sedan en stam som uttrycker OKS med ZhuI, som kodar för cyklaserna som katalyserar bildandet av C7-C12 första ringförslutningen (Fig. 3a). Jämfört med stammen som bara uttryckte OK, visade denna stam 2,5-, 2,2-och 2,1-faldiga ökningar i flavokermesinsyra, SEK4 respektive dehydro-SEK4 nivåer. I överensstämmelse med ZhuI vägledande vikning i önskad riktning åtföljdes dessa metaboliska förändringar av reducerade nivåer av metaboliter innehållande de oönskade första ringveckarna (Fig. 3b och Tabell 1). En stam som uttrycker OKS och ZhuJ, som kodar för aromataserna som katalyserar C5-C14 andra ringförslutning (Fig. 3A), producerade en 2,7-faldig ökning av flavokermesinsyranivåer. Denna ökning åtföljdes av en minskning av nivåerna av metaboliter med en C7-C12 första ringveck (SEK4 och dehydro-SEK4), medan, som förväntat, nivån av metaboliter med den oönskade C10-C15 första ringveck (SEK4b och dehydro-SEK4b) inte påverkades (Fig. 3b och Tabell 1). Slutligen visade analys av stammen som uttryckte ZhuI, ZhuJ och OKS en 4,1-faldig ökning av produktionen av flavokermesinsyra jämfört med när OKS uttrycktes ensam. Dessutom är denna ökning 60% högre än vad som observerades med stammarna som uttrycker OKS i kombination med antingen ZhuI respektive ZhuJ (Tabell 1). Detta resultat indikerar att cyklas och aromatas, på ett additivt sätt, kan öka flödet i den artificiella de novo-vägen mot den önskade produkten, flavokermesinsyra (Fig. 3b).

överraskande och mycket uppmuntrande avslöjade ytterligare metabolisk analys av stammen som uttrycker OKS, ZhuI och ZhuJ att den ökade bildningen av flavokermesinsyra åtföljdes av produktionen av kermesinsyra (Fig. 4). Därav, A. nidulans tillhandahåller det nödvändiga monooxygenaset för omvandling av flavokermesinsyra till kermesinsyra, som kan tjäna som den slutliga mellanprodukten i karminsyravägen (Fig. 1).

produktion av karminsyra i A. nidulans

det sista steget i bildandet av karminsyra innefattar C-glukosylering av kermesinsyra (Fig. 5a). Det ansvariga enzymet för detta steg i den karminsyrabiosyntetiska vägen har tidigare identifierats i D. coccus och kännetecknats av heterologt uttryck i S. cerevisiae8. Vi införde därför UGT2-kodningsgenen, optimerad för uttryck i A. nidulans, i IS4-locus av nid2252-referensstammen och för att slutföra den halvnaturliga karminsyrabiosyntetiska vägen i A. nidulans, i samma locus i stammen som uttrycker ZhuI, ZhuJ och OKS. Uttrycket av UGT2 ensam i referensstammen påverkade inte utseendet på tillväxtmediumfärgen eller den metaboliska profilen för A. nidulans jämfört med referensstammen NID2252 (Fig. 5b, c). Däremot gav samuttryck av OKS, ZhuI, ZhuJ och UGT2 upphov till en röd färgning av mediet, vilket tyder på att ett mer vattenlösligt färgämne(er) bildades (Fig. 5b). Riktad LC-HRMS-analys av denna stam bekräftade bildandet av karminsyra22 (tilläggsfil, Fig. 13), tillsammans med dcII9, 23 och en dcii-isomer (kompletterande fil, Fig. 14), visar att UGT2 var funktionell i A. nidulans och kunde framgångsrikt slutföra den biosyntetiska vägen (Fig. 5c). Positiv identifiering av karminsyra och dcII baserades på liknande retentionstider, UV-spektra, MS och MS/MS fragmenteringsmönster för rena standarder för de två föreningarna. Tre isomerer av karminsyra har beskrivits i litteraturen (karminsyra, DCIV och DCVII) av Stathopoulou et al.23, visar alla tre olika retentionstider i LC-MS / MS – baserad analys. I vår analys upptäckte vi bara karminsyra och inte DCIV och DCVII baserat på retentionstid och fragmenteringsmönster av autentisk karminsyrastandard isolerad från D. coccus (kompletterande fil, Fig. 13). Tillsammans visar våra data att det är möjligt att producera karminsyra i A. nidulans baserat på en halv naturlig väg.