När det gäller solubilisering och denaturering av proteiner före isoelektrisk fokusering och 2-D gelelektrofores väljer de flesta forskare urea. Detta är inte förvånande eftersom detta milda chaotropa medel helt kan störa interaktionerna mellan proteinmolekyler och öka effektiviteten av proteasaktivitet vid proteinförtunning samtidigt som proteiner effektivt förhindras från att aggregera och/eller utfällas. Dessutom används urea också för renaturering av proteiner från tidigare denaturerade prover.

trots sin popularitet som ett effektivt protein denaturant, med användning av urea lösning i smälta proteiner kommer med en särskild utmaning-det ökar risken för karbamylering. Varför skulle detta beröra dig? Här är några anledningar till varför karbamylering kan vara skadligt för ditt experiment och varför det bör undvikas till varje pris.

1. bortsett från att blockera de N-terminala ändarna av proteinmolekyler, karbamylering stör proteinkarakterisering och gör dem otillgängliga för vidare användning.
2. det angriper aggressivt sidokedjorna av arginin-och lysinrester och gör proteinet olämpligt för enzymatiska smältningar.
3. Det hindrar den enzymatiska matsmältningen av proteiner och påverkar negativt identifieringen och kvantifieringen av proteiner i MS-analys.
4. det förvirrar resultaten erhållna från peptider med oväntade retentionstider och ökar provkomplexiteten.
5. Det minskar joniseringseffektiviteten och påverkar signalintensiteten hos detekterade toppar negativt.
6. det inducerar en förändring i proteins isoelektriska punkt och leder till artefaktiska resultat.
7. Det kan påverka resultaten av in vivo karbamyleringsstudier.

vad orsakar Karbamylering?

per definition hänvisar karbamylering till Post-translationell modifiering som förändrar de strukturella och funktionella egenskaperna hos proteiner. Detta åstadkommes genom den icke-enzymatiska reaktionen mellan isocyansyra och de fria aminogrupperna.

i vattenlösningar finns urea i jämvikt med ammoniumcyanat. Det är viktigt att notera att (1) urea i lösning dissocierar spontant producerande cyanat-och ammoniumjoner, (2) det bryts ned till isocyansyra (CNOH), den form som aktivt reagerar med proteinaminogrupper och inducerar karbamylering, och (3) den hastighet med vilken urea dissocierar och omfattningen av karbamylering beror på temperatur, pH och inkubationstid.

förhindra Karbamylering: några användbara Tips att överväga

ingenting kan förändra det faktum att urea i närvaro av värme och proteiner alltid leder till karbamylering. Du kan använda urea av högsta kvalitet och fortfarande riskera karbamylering.

Tack och lov finns det flera sätt att skydda peptider från karbamylering. Här är några effektiva strategier som kan användas för att uppnå detta mål.

• använd alltid nyberedda ureabaserade reagenser när du utför proteomiska förfaranden. Använd högkvalitativa torra ureabaserade förblandade och färdiga buffertar från trovärdiga källor och var försiktig när du förbereder dina prover. Obs: förvara fast material vid rumstemperatur och håll hanteringen till ett minimum.
• ta bort urea från proteinprovet före matsmältningen genom att använda dialys och/eller snabb omvänd faskromatografi eller genom att använda spinnkolumner.
• Håll provet vid en relativt låg temperatur för att minska hastigheten vid vilken urea sönderdelas. Undvik att värma ureainnehållande buffertar över 37oC för att minska risken för karbamylering.
• Avjonisera urealösningen med ett jonbytarharts för att minska cyanatkoncentrationen.
• surgör urealösning (100 mM HCl) för att hindra bildandet av isocyansyra.
• använd reagenser som etanolamin, etylendiamin, metylamin och Tris-HCl för att minimera protein/peptidkarbamylering. Dessa reagenser hjälper till genom att rensa för cyanatmolekyler, vilket gör dem otillgängliga för peptider.

visserligen har dessa strategier sina egna nackdelar (dvs. lätt denaturerade proteiner och kan vara olämpliga för många enzymatiska digestionstekniker) men eftersom enzymsmältningar utförs i förhöjda temperaturer under en lång tidsperiod har du inget annat val än att ta bort urea från digest-blandningen. Annars löper du alltid risken för karbamylering. Det är en risk du inte vill ta.