Laboratory Notes for BIO 1003

30 augusti 1999, John H. Wahlert & Mary Jean Holland

enzymer

proteiner som fungerar som katalysatorer

(Klicka här för: material, teman, webbresurser)

celler har inte alternativen för värme och kraftig omrörning för att påskynda kemiska reaktioner genom att atomer och molekyler stöter på varandra oftare och med mer kraft. Istället gör de proteinkatalysatorer som kallas enzymer som ger ytor på vilka reaktanter möter varandra i rätt orientering, och enzymerna kan till och med försvaga bindningar som ska brytas. Enzymer har hög specificitet-endast specifika reaktanter kommer att passa på sina ytor och balansera de lokala ytladdningarna på den plats som kallas den aktiva platsen. Den speciella uppsättningen reaktanter för ett enzym kallas dess substrat(er). Enzymer, som alla katalysatorer, förändras inte av den reaktion de katalyserar; således, när alla reaktanter har omvandlats till produkter, förblir de ursprungliga enzymmolekylerna kvar.

enzymfunktionen beror på den miljö där reaktionen sker. Sådana faktorer som temperatur och pH kan i hög grad påverka förmågan hos ett enzym att göra sitt jobb. Följande serie experiment illustrerar principerna för enzymatiskt katalyserade reaktioner i biologiska system. Vi kommer att använda enzymet katekolas (eller katekoloxidas) som är vanligt i växter; det finns i den färskpressade potatisjuice som har tillhandahållits. Substraten av katekolas är katekol och syre. Substraten reagerar med varandra inom enzymets aktiva plats. Produkterna som bildas av denna reaktion är bensokinon och vatten; eftersom bensokinon har en brun färg kan du se att reaktionen har ägt rum. Detta kallas fruktbrunningsreaktionen. Bensokinon hämmar tillväxten av mikroorganismer och förhindrar att skadad frukt ruttnar. I oskadade celler lagras katekolas i vesiklar och interagerar inte med katekol.

i närvaro av enzymet katakolas:

catechol + SACORICO2 bensokinon + H2O

blanda ingredienserna som anges i alla experimenten nedan och rör om blandningen med en virvelgen eller genom att knacka på rörets sida nära botten; inkubera blandningar vid 40 grader C, om inte annat anges.

om du tvivlade på enzymets renhet, hur kan du ta reda på om det finns något annat i potatisextraktet förutom katekolas?

I. bildning och detektion av Bensokinon

detta experiment fastställer standarderna för utseende när reaktionen har eller inte har ägt rum. Använd destillerat vatten där H2O anges.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol (experiment)
10 drops potato extract with 10 drops H2O (control)
10 drops 1 % catechol with 10 drops H2O (kontroll)

hur skulle du definiera begreppen för en kontroll och ett experiment?

II. Enzymspecificitet

hydrokinon är strukturellt lik men inte detsamma som katekol. I detta experiment kommer vi att se om enzymet också kan konvertera det till bensokinon, eller om enzymet helt enkelt är för specifikt i sin design för att interagera med den liknande men inte identiska molekylen.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol
10 drops potato extract with 10 drops hydroquinone
10 drops hydroquinone with 10 drops H2O (kontroll)

kan enxymet konvertera hydrokinon till bensokinon? Hur kom du till denna slutsats?

OBS: din grupp kommer att göra antingen III eller IV—inte båda.
fråga din lab instruktör om din grupp kommer att göra III temperatur eller IV pH.

III. effekt av temperatur på enzymaktivitet

enzymer är utformade för att fungera inom ett specifikt temperaturområde. Du kan göra några gissningar om resultatet för följande temperaturer nedan. Tänk på att strukturerna som producerar enzymet är frukt och potatis; på Celsius-temperaturskalan fryser 0 grader, 22 grader är rumstemperatur och 100 grader kokar. Ju varmare det är, desto snabbare vibrerar molekylerna och rör sig om. Kollisioner av vattenmolekyler med enzymet kan ångra sin vikta struktur som hålls i position av vätebindningar; när detta händer sägs molekylen ha denaturerats. Vad skulle hända med den aktiva webbplatsen i det här fallet? Vid låga temperaturer rör sig molekylerna mycket långsamt, och chansen att de kolliderar och reagerar med varandra är mycket låg. Observera att potatisextraktet har hållits på is. Varför?

skriv ner din hypotes om effekten av temperatur på enzymaktivitet:

Ställ in 6 par provrör med 10 droppar potatisextrakt i en uppsättning och 10 droppar 1% katekol i den andra. Inkubera dem i 5 minuter, ett par i var och en av de 5 temperaturmiljöer som anges nedan. Blanda sedan potatisextraktet och katekol tillsammans; spela in den ursprungliga färgen och sätt tillbaka röret i de kontrollerade temperaturmiljöerna. Spela in färgen igen efter 5 minuter.

temperatur	Initial färg	färgförändring (5 min. after adding catechol)
0 degrees C
22 degrees C
40 degrees C
60 degrees C
80 grader C
100 grader C

stöder resultaten din ursprungliga hypotes?

vilka temperaturer denaturerar enzymet så att det inte kan återhämta sig.

vad är den vita fällningen som bildas vid 100 grader C?

IV. effekt av pH på enzymaktivitet

pH-skalan mäter antalet vätejoner (var och en med en +1 laddning) närvarande i lösning. Skalan i biologiska system går från 0 (starkt surt) till 14 (starkt basiskt). 7, den neutrala punkten, är pH i rent vatten. Minns att den vikta strukturen hos proteinmolekyler till stor del beror på vätebindning mellan motsatt laddade delar av polypeptidkedjan. Andra joner i lösning kan ersätta de matchande delarna av kedjan och få den att ångras. När detta händer, vad blir det av den aktiva webbplatsen?

skriv ner din hypotes om effekten av pH-intervallet på enzymaktivitet:

Ställ in 7 provrör med 40 droppar av en annan buffrad pH-lösning i vardera. Tillsätt 10 droppar potatisextrakt till var och en och rör om. Tillsätt sedan 10 droppar 1% katekol till vardera och rör om.

pH	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
pH 2
pH 4
pH 6
pH 7
pH 8
pH 10
pH 12

Do the results support your hypothesis?

vid vilket pH eller intervall av pH-värden fungerar enzymet bäst?

varför sätter citronsaft på nyskivad frukt retard sin brunning?

V. nödvändighet av kofaktorer för enzymaktivitet

många enzymer fungerar endast om det finns en kofaktor associerad med dem. Katekolas kräver koppar som en kofaktor. PTU är en kemikalie som har en högre affinitet för koppar än katekolas, och det tar bort koppar från enzymet. Du kan observera vad som händer med enzymets funktion när dess kofaktor avlägsnas. We refer to cofactors that our bodies need as vitamins and minerals.

Mix	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
Tube A 10 drops potato extract 5 crystals PTU and mix. After 5 minutes add 10 drops 1% catechol.
Tube B 10 drops potato extract. efter 5 minuter tillsätt 10 droppar 1% katekol.

vilket rör, A eller B, är kontrollen i detta experiment?