det myeloida facket i det medfödda immunsystemet består av ett antal celltyper vars funktioner inkluderar clearance av skadade och apoptotiska celler, antigenpresentation, immunsuppression och skydd av värden från främmande mikroorganismer.

monocyter representerar en mycket plastisk delmängd av celler som komponerar det medfödda immunsystemet. Dessa celler kan korsa vaskulaturen och, när de utsätts för specifika cytokiner, genomgår differentiering i olika celltyper. Cirkulerande monocyter klassificeras som antingen icke-klassiska eller klassiska och kan särskiljas genom deras mönster av cellytreceptoruttryck. De klassiska monocyterna i cirkulationsdisplayen CD14 + + + Hi / CD16 – / lo och förekommer särskilt vid infektions-eller sjukdomsplatser (1,2).

humana icke-klassiska monocyter i cirkulationsdisplayen CD16 + + + Hi / CD14+ / lo ytuttryck (1). Efter aktivering genomgår monocyter flera morfologiska och biokemiska funktionella förändringar, vilket resulterar i monocytdifferentiering i nya celltyper såsom makrofager (3).

i ett paradigm som kallas klassisk aktivering visar humana monocyter fenotypisk plasticitet som kan initieras genom exponering för Th1-responsfrämjande cytokininterferon-sackarid (IFN-sackarid) eller tumörnekrosfaktor sackarid (TNF-sackarid), såväl som endotoxin lipopolysackarid (lps) (4,5). Denna mekanism för klassisk aktivering genererar M1-makrofager, som fungerar för att producera proinflammatoriska mediatorer som ger värdskydd mot bakterier och virus (6). Humana monocyter kan också differentieras till m2-makrofager genom exponering för Th2-responsfrämjande cytokiner såsom interleukin-10 (IL-10) och transformerande tillväxtfaktor-sackarios (TGF-sackarios) (4,7). M2-makrofager uttrycker höga nivåer av CD206 (mannosreceptor) och CD163, producerar låga nivåer av proinflammatoriska cytokiner och främjar sårläkning och matrisremodellering.

dendritiska celler (DCs) är en annan uppsättning monocyt-härledda immunceller vars funktion är att presentera antigener till T-celler för att initiera ett adaptivt t-cellbaserat immunsvar. DCs kan kategoriseras i stor utsträckning i tre undergrupper: klassisk (CDC), plasmacytoid (PDC) och monocyt-härledd (modc). CDC: er finns vanligtvis i lymfoidvävnaden, mjälten, lymfkörtlarna och benmärgen. PDC liknar plasmaceller och finns vanligtvis i blodcirkulationen (8). Monocyter kan differentieras till DCs, som ofta kallas monocyt-härledda DCs (moDCs), efter exponering för granulocytmakrofagkolonistimuleringsfaktor (GM-CSF) och IL-4 (9,10). moDCs har rapporterats uttrycka cellytmarkörer CD80, CD83, CD86 och CD1a in vitro (11-13). Medan moDCs skiljer sig från makrofager i cellform och funktion, delar de uttryck av flera cellytantigener, inklusive CD11c, CD206 och CD1a (14).

flera grupper har rapporterat framgångsrik differentiering av humana CD14 + monocyter i makrofager; men många av dessa publicerade protokoll är olika. En vanlig variation bland dessa metoder är inkludering (15) eller utelämnande (16) av IL-6. En annan skillnad mellan protokoll är behandlingstiden. Denna brist på konsekvens mellan protokoll är problematisk.

för att ta itu med dessa problem undersökte och jämförde vi inkluderingen och utelämnandet av IL-6 i cytokinbehandlingen som används i vanliga humana monocytdifferentieringsmetoder. Vi fann att i frånvaro av IL-6 producerar dessa strategier celler med låg grad av homogenitet, vilket kan ge tvetydiga experimentella resultat. För det andra, för att ytterligare ta itu med detta problem, utvecklade vi en ny fas in vitro-strategi med införandet av IL-6. Vi fann att denna strategi förbättrade den cellulära homogeniteten hos M1-och M2-makrofager såväl som moDCs som differentierades från humana CD14+ monocyter. Denna förbättring av metodiken kommer att ge forskare bättre modeller för att undersöka immunsystemet och sjukdomstillstånd.

material och metoder

cellpreparat

Buffy coats samlades in från helblod från fem eller fler friska manliga givare som hade blivit poolade. Perifert blod mononukleära celler (Pbmc) framställdes från buffy coats av Ficoll-Paque (1.077 g/mL densitet) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ) densitet gradient centrifugering vid 400 kg g vid 18 kg C för 35 min för att separera blodbeståndsdelar. Celler tvättades flera gånger med användning av 1 PBS-PBS och räknades med hjälp av en Nexcelom-Cellometer Auto T4 plus-cellräknare (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). En gång räknat isolerades CD14 + monocyter från Pbmc genom magnetisk märkning med Mab CD14 konjugerade mikrokulor (130-050-201; Miltenyl Biotec, San Diego, CA) följt av separation med hjälp av magnetiska kolumner (130-042-401 och 130-042-302; Miltenyl Biotec) enligt tillverkarens instruktioner, med ett undantag: vid insamling av CD14+ – celler från magnetkolonnen spolades cellerna initialt ut med 5 mL buffert som endast förlitar sig på gravitation (utan användning av den medföljande kolven). Efter den första 5 mL sköljningen tillsattes ytterligare 5 mL buffert och sköljdes försiktigt med den medföljande kolven.

cellkultur

humana CD14+ monocyter såddes vid en celldensitet av 2,0–3.0 msk 105 celler / mL i rpmi 1640 medium med 2 mm/L L-glutamin (Life Technologies, Frederick, MD) kompletterat med 10% värmeinaktiverad FBS (Sigma, Carlsbad, CA), 100 U/mL penicillin (Life Technologies) och 100 mg / mL streptomycin (Life Technologies) vid 37 kg C i en fuktad 5% CO2-inkubator. För att differentiera celler till M1-makrofager var de cytokiner som användes GM-CSF (20 ng/mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-6 (20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL) och endotoxin LPS (20 ng/mL). För M2 makrofagdifferentiering var de cytokiner som användes makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF), IL-4, IL-6 och IL-13 i en koncentration av 20 ng/mL (PeproTech). moDCs genererades genom tillsats av GM-CSF (100 ng/mL) och IL-4 (20 ng/mL). Tidpunkten för varje strategi beskrivs vidare i Figur 1.

flödescytometri

Polariserade makrofager och DCs odlades i 9 dagar på 10 cm2-rätter (BD Falcon, Billerica, MA). På dag 9 uppsamlades media och icke-vidhäftande celler; vidhäftande celler tvättades med användning av 1 kg PBS, avlägsnades med användning av celldissociationsbuffert (Life Technologies) och tillsattes sedan till de uppsamlade media/icke-vidhäftande cellerna som skulle tvättas. Suspenderade celler centrifugerades och tvättades två gånger (1 kg PBS, 0,5% BSA, 2 mm EDTA), räknades och inkuberades sedan med fluorofor-konjugerade primära antikroppar mot CD206 (FITC), CD36 (PE), CD163 (PE-Cy7), E-cadherin (AlexaFluor-488), CD86 (PE), CD1a (FITC), CD83 (PE), CD80 (PE), CD124 (PE) och cd64 (FITC) i mörkret för 45 min vid 4 msk C. fluorescens detekterades av en s3tm-cellsorterare (Bio-Rad, Hercules, ca).

Endocytosanalys

Polariserade humana makrofager pläterades i glasskivor med 4 brunnar (MA Nunc Lab-Tek II, Thermo Scientific, Waltham, MA) med en densitet av 3.0 oc 105 cell / mL vid Dag 7 och fortsatte att odlas med lämpliga cytokiner under de återstående 2 dagarna. Perylenbisimid (PBI-12-Man) (17) var en snäll gåva från Ke-Rang Wang vid Hebei University. Celler odlades med 10 osk / mL PBI-12-Man för 30 min vid 37 osk C, tvättades sedan med 1 osk PBS. Celler fixerades med 70% etanol och monterades med DAPI (P36962; Life Technologies). För att visualisera endocytos av PBI-12 Man var glidbanor upphetsade och emitterade vid 585 nm. Röda fluorescensbilder kvantifierades med hjälp av Metafer slide scanning programvara (MetaSystems, Boston, MA). Statistisk testning var per bildas med hjälp av MATLAB R2015a programvara (Mathworks, Inc., Natick, MA). Rank-sum-test utfördes för att testa för univariat statistisk signifikans mellan prover.

immunofluorescens

makrofager differentierades med användning av tidigare beskrivna metoder i 7 dagar och överfördes sedan till Nunc Lab-Tek II 4-brunns glaskammarglas med lämpliga cytokiner. Celler lämnades att växa under de kommande 7 dagarna; 14 dagar efter initial plätering fixerades celler med 70% etanol och monterades med hjälp av Prolong Diamond anti-fade mountant med DAPI. Celler visualiserades med användning av faskontrast och fluorescensmikroskopi på EVOS FL Auto (Life Technologies).

resultat och diskussion

strategier och villkor för human CD14+ monocytdifferentiering

vi började med att bedöma vilka strategier som var mest effektiva för att producera homogena populationer av humana M1-och M2-makrofager samt modc. Humana CD14 + monocyter isolerades och såddes på vävnadsodlingsplattor för att differentieras till makrofager eller moDCs in vitro. Vi testade sedan tre specifika behandlingsförhållanden för att bestämma metoden som gav de mest enhetliga makrofag-och moDC-populationerna. För det första villkoret odlade vi celler med tillsats av endast GM-CSF eller M-CSF i 9 dagar (Figur 1). Detta villkor kallas ”endast” (Figur 1). Den andra behandlingsstrategin var att kontinuerligt exponera celler för tillämplig cytokinmiljö på dag 0, fylla på media, cytokiner och LPS på Dag 5 och analysera cellerna på Dag 9. Detta villkor kallas ”kontinuerligt” (Figur 1). Den tredje strategin var att stimulera CD14 + monocyter med antingen GM-CSF eller M-CSF i 5 dagar, följt av tillsats av färska medier som innehåller LPS för humana M1-makrofager och alla tillämpliga cytokiner för en given behandlingsgrupp (GM-CSF, IFN-bronkialoch IL-6 för M1-makrofager eller M-CSF, IL-4, IL-13 och IL-6 för M2-makrofager). Denna behandlingsstrategi kallades ”fasad” (Figur 1). Behandling av CD14 + monocyter med 100 ng/mL GM-CSF och IL-4 i 5 dagar och ersättning av media och alla cytokiner på dag 5 genererade modc. Modc: erna stimulerades sedan med IL – 6 och LPS i 24 timmar före analys (dag 8) för att främja DC-mognad och aktivering. Denna odlingsmetod kallades ”stimulerad” (Figur 1). Modc: erna som aldrig fick IL-6 och LPS-exponering kallades ”un-stimulerad” (Figur 1). Efter 9 dagars odling under de specifika betingelser som beskrivits ovan analyserades cellytreceptoruttryck och cellfunktionalitet.

IL-6-exponering ökar m2-polarisationseffektiviteten in vitro

tidigare studier har visat att makrofagexponering för cytokin IL-6 inte bara snedvrider monocytdifferentiering från en dendritisk cell till en makrofagfenotyp utan att IL-6-exponering också ökar mRNA-uttrycksprofilen associerad med m2-makrofager (15,18). För att bekräfta dessa fynd och för att testa effekten av IL-6 på M1-och M2-polarisering behandlades humana CD14+ monocyter under kontinuerliga och fasade odlingsbetingelser med eller utan IL-6. Undersökning av M2-makrofagytmarköruttryck i M1-differentierade celler visade inga signifikanta förändringar när de odlades med IL – 6 (figur 2), vilket tyder på att IL-6-behandling inte shuntar M1 polariserade makrofager mot en m2-fenotyp.omvänt visade analys av de kontinuerliga och fasade m2-makrofagodlingsgrupperna att IL-6-behandling ökade uttrycket av M2-makrofagytmarkörer. I M2-makrofagpopulationer förblev både CD206-och CD36-uttrycket högt och verkade oförändrat när de exponerades för IL-6 (figur 2, a och B). CD163 och E-cadherin visade emellertid signifikanta ökningar i ytuttrycksnivåer och befolkningshomogenitet när de behandlades med IL-6 (figur 2, C och D). Detta demonstreras av en minskning av de LÅGUTTRYCKANDE CD163-och E-cadherintopparna (röda pilar i Figur 2, C och D) och det resulterande skiftet mot en homogent höguttryckande befolkning.

IL-6 används ofta för att inducera moDC-mognad (18,19). För att bestämma om IL-6-behandling kan resultera i oönskade moDCs inom makrofagpolariserade populationer, mogna DC-ytmarkör (CD83) uttryck undersöktes. Flödescytometrisk analys visade att ingen av M1-eller m2-odlingsförhållandena främjade någon signifikant ökning av CD83-uttryck (figur 2e). Detta tyder på att det inte fanns någon moDC-kontaminering inom dessa makrofagpopulationer eller att några förorenande modc var IL-6-okänsliga.

Fasadpolarisering leder till ökat uttryck av kanoniska M1 -, M2-och moDC-cellytmarkörer

för att bekräfta att humana CD14+ – monocyter differentierades fullständigt till antingen makrofager eller moDCs vid Dag 9 användes flödescytometri för att analysera cellytmarkörer och bedöma morfologiska skillnader (Figur 3, A-C). Humana CD14 + monocyter differentierades (Figur 1) för att bedöma vilken strategi som skulle ge högt uttryck för lämpliga ytmarkörer av celltyp. En panel av cell-ytmarkörer testades för var och en av celltyperna. Vår M1 cell-ytmarkörpanel bestod av de kanoniska markörerna CD86 och CD80 (Figur 3, A-C). För M2-makrofagpanelen använde vi CD206, CD163, CD124 (IL-4-receptor-bukspottkörtel), E-cadherin och CD36 (klass B-rensningsreceptor) (Figur 3, A-C). För moDCs användes CD83, CD86 och CD1a. Ytuttrycksnivåer för alla testade markörer bestämdes för alla celltyper (kompletterande figur S1). Median fluorescensintensitet (MFI) beräknades och visades som vik-förändring i förhållande till motsvarande ostainerad kontroll (se tabeller i Figur 3).

intressant visade analys av M2-cellytmarkörerna, CD36 och IL-4RA, i M1 GM-CSF-endast polariserade makrofager dramatiska ökningar (figur 3a). Vid jämförelse av GM-CSF-endast behandlade celler till alla M1-behandlingsgrupper hade GM-CSF-endast gruppen markant högre CD36-uttryck. Dessa GM-CSF-endast celler uttryckte också låga nivåer av M1-associerade markörer CD86 och CD80. På samma sätt gav det kontinuerliga tillståndet celler som inte bara var låga i CD86 och CD80 utan också höga i CD36-och IL-4RA-uttryck. Omvänt, när humana CD14+ monocyter differentierades under M1-fasförhållandet, var CD86 och CD80 märkbart uppreglerade, medan CD36 och IL-4Ra-uttrycket förblev lågt. Ytterligare flödescytometrisk analys av cellytmarköruttryck avslöjade att M1-makrofager hade lägre uttryck av CD206, CD36 och CD163 i förhållande till m2-makrofager under både fasad och kontinuerlig exponering (kompletterande siffror S1 och S4). Dessutom genererar dessa varierade odlingsförhållanden celler med distinkta morfologiska egenskaper och struktur (figur 3A). Medan GM-CSF-endast behandlade celler verkar vara större, avslöjade forward scatter (FSC) data minimala skillnader i storlek mellan grupperna (kompletterande siffror S2 och S3). Jämförelse av intern komplexitet (SSC) mellan behandlingsförhållanden avslöjade en ökning av granularitet i GM-CSF och fasade grupper (kompletterande figur S2). Tillsammans visar dessa resultat att endast GM-CSF och kontinuerlig behandling ger celler som uttrycker låga nivåer av M1-markörer och höga nivåer av vissa m2-markörer, såväl som uppvisar morfologiska förändringar.

m2 makrofagodlingsförhållanden gav något mer tvetydiga resultat än de som hittades med M1-makrofagodlingsförhållandena (figur 3b). I förhållande till den enda m-CSF-gruppen visade de fasade och kontinuerliga grupperna ökade uttrycksnivåer för CD206. Omvänt var IL-4Ra ytnivåer markant högre I m-CSF-endast förhållanden, relativt både kontinuerliga och fasade. E-cadherinuttryck förblev enhetligt över grupper, medan CD163 var signifikant högre i både m-CSF-bara och fasade grupper. En observation av anmärkning är att den kontinuerliga exponeringsgruppen var konsekvent mycket mindre homogen med avseende på cellytmarköruttryck. Detta illustreras av den bimodala fördelningen och den stora variansen i uttrycksnivåer som finns på histogrammet. Dessutom kan dramatiska morfologiska skillnader ses mellan behandlingsgrupperna. Baserat på faskontrastbilderna producerade endast m-CSF-gruppen Celler som verkar vara mindre och mycket granulära (figur 3B). Flödescytometrisk analys visar att dessa celler har liknande storlek (FSC), men det finns en ökning av cellulär granularitet i de fasade och kontinuerliga behandlingsbetingelserna (kompletterande figur S2). Slutligen förändrade glutaminberövande m2-polarisering, vilket visar att metaboliska produkter är nödvändiga enligt denna strategi (kompletterande figur S5). Sammantaget tyder dessa data på att de fasade förhållandena ger störst effektivitet för M2-makrofagpolarisering.

vi undersökte sedan ytmarköruttryck av moDCs som inte stimulerades eller stimulerades med IL – 6 och LPS 24 h före flödescytometrisk analys. Stimulering med IL – 6 och LPS resulterade i en ökning av CD80 -, CD83-och CD86-uttryck (figur 3C). Mogen DC-markör CD83-cellytuttryck ökade dramatiskt vid aktivering med IL – 6 och LPS på Dag 8 i förhållande till den un-stimulerade gruppen. Detta bekräftade att IL – 6 och LPS kunde främja dendritisk cellmognad (kompletterande figur S1L). CD1a-uttrycket förblev enhetligt mellan de ostimulerade och stimulerade grupperna. Intressant nog förblev de stimulerade DC: erna i suspension, men de verkade börja aggregera och hålla sig till varandra (figur 3C). Dessa resultat bekräftar tidigare fynd angående moDC-polarisering och ger en ytterligare kontroll för ytmarköranalys för att identifiera oönskade moDC-populationer inom de olika makrofagodlingsförhållandena.

m2 makrofager genererade av fasad cytokinexponering har m2-associerad funktionalitet

mannosreceptorn (CD206) är en endocytisk och återvinningsreceptor som uttrycks starkt i våra m2-makrofagpopulationer under fasade behandlingsförhållanden. Vi ville därefter bedöma CD206-medierad endocytisk upptag i våra makrofager. Detta bestämdes med användning av PBI-12-Man, ett biokompatibelt medel som fluorescerar vid bindning till mannosreceptorn (17). Efter en 1-timmars behandling av både M1-och M2-makrofager med PBI-12-Man var den röda fluorescensen av PBI-12-Man övervägande intracellulär I m2-makrofager under fasade och kontinuerliga behandlingsbetingelser (Figur 4, A och B). Detta resultat tyder på att cellytans bindning till CD206 och endocytos resulterar i vesikulär lokalisering. Detta överensstämmer med tidigare data från flödescytometri, som visade att under fasade behandlingsbetingelser visade m2-makrofagerna ett högre cellytuttryck av CD206 i förhållande till M1-makrofagpopulationen. Intressant fann vi att GM-CSF-bara celler visade höga nivåer av PBI-12-Man endocytos (Figur 4, A och B). Detta korrelerar med våra flödescytometriska data (Figur 2), vilket visade att GM-CSF-endast odlingsförhållanden producerar M1-celler med m2-associerat ytmarköruttryck. Sammantaget visar vi att dessa celler hade de normala egenskaperna hos makrofager och att CD206 var funktionell i M2-makrofagpopulationen.

Efter 14 dagar i odling visade m2-makrofager också förmågan att smälta, nå över 200 kg i storlek och innehålla flera kärnor per cell (figur 4c). Dessa liknade flera kärnbildade jätteceller (MNGCs) som har rapporterats ha fagocytiska och andra förmågor (20). Dessutom har MNGCs associerats med främmande material i kroppen, tuberkulos och cancer (20-23). Denna cellulära fusion hittades exklusivt i våra m2-makrofagpopulationer och var mycket mer signifikant i det fasade m2-tillståndet. Medan de enda m-CSF-grupperna hade några multinukleära celler (figur 4C) var deras storlek och antal mycket lägre än den fasade gruppen. Med tanke på dessa cellers förmåga att utföra denna makrofagassocierade funktion indikerar dessa resultat vidare att de fasade odlingsförhållandena producerar mycket M2-liknande makrofager.

här beskrev vi vårt nyutvecklade fasade protokoll för makrofagpolarisering. Vi fann att införandet av IL-6 och fasadpolarisationsbehandlingstidpunkten är absolut kritiska för att generera de mest M1 – och M2-liknande makrofagerna in vitro. Detta resultat testades noggrant jämfört med andra polariseringsmetoder. Av den anledningen tror vi att den fasade polarisationsmetoden ger ett väsentligt steg framåt. Detta kommer att ge forskare enhetliga experimentella standarder för att producera homogena populationer av makrofager att använda in vitro och förmågan att jämföra deras resultat. Medan detta protokoll erbjuder ett antal förbättringar jämfört med nuvarande polarisationsstrategier, tror vi att ytterligare forskning och optimering av exponeringstider och cytokincocktailen skulle vara användbar. Detta kommer att hjälpa oss att ytterligare förstå de komplexa rollerna av M1 och M2 makrofager i olika former av sjukdomsprogression och främja utvecklingen av nya terapier.