djur

zebrafisk bibehölls vid 28,5 kg C på en ljuscykel på 14 timmar/10 timmar i Danieau-lösning . Den kombinatoriska kristallmutanten (albb4 / b4; nacrew2 / w2; roya9/a9) genererades genom sekventiellt korsning av tre olika singelmutanta stammar, nämligen nacrew2/w2 (ref. 9), roya9 / a9 (ref. 4) och albb4 / b4 (ref. 18) mutanter. Det är viktigt att både larver och vuxna kristallsebrafiskar är livskraftiga och inte uppvisar synliga morfologiska, funktionella eller beteendemässiga avvikelser än pigmenteringsfenotypen. Casper-mutanten erhölls genom att korsa nacrew2/w2 och roya9/A9 mutanter, som tidigare beskrivts4. AB-linjen användes för att erhålla zebrafisk av vildtyp. Transgena linjer som används i denna studie inkluderar Tg(elavl3:GCaMP5G)21 och Tg (elavl3:GCaMP6f)28. Konfokala funktionella avbildningsexperiment utfördes i nacre-mutanten. Ljusarkbildningsexperiment utfördes i nacre, casper och kristallmutanter. Tvåfoton funktionella avbildningsexperiment utfördes i kristalllarver. För att behandla zebrafisklarver med PTU följde vi standardprocedurer8, speciellt larver höjdes i 200 occurm PTU (Sigma) I Danieau-lösning från 24 timmar efter befruktning (hpf). TG (elavl3:GCaMP5G) larver som används för konfokal funktionell avbildning av visuellt framkallad neural aktivitet i optic tectum behandlades med 200 occurm PTU från 24 hpf till 3 dpf och avbildades vid 4 dpf. Detta arbete godkändes av det lokala djurskydds-och etiska Granskningsorganet (King ’ s College London) och utfördes i enlighet med djur (Scientific Procedures) Act 1986, under licens från Storbritanniens hemmakontor (PPL70/8057).

bildbehandling

heldjursmikroskopi in vivo

heldjursbilder av vuxen zebrafisk togs med en Nikon D7000 digital SLR-kamera utrustad med en Sigma 150 mm makrolins. Vuxna zebrafisk bedövades med 0.2% tricaine (MS222, Sigma) i fiskfacilitetsvatten och placeras i en 90 mm petriskål som innehåller fiskfacilitetsvatten. Avbildning av larver utfördes med användning av ett Zeiss Axioskop-mikroskop anslutet till EXi Blue CCD-kameror (Retiga) och volocity acquisition software (PerkinElmer). Larvsebrafisk bedövades med 0,02% tricaine i Danieau-lösning och immobiliserades i 1% låg smältpunkt agaros (Sigma) på glasskivor.

konfokal kalciumavbildning

Avbildning utfördes med användning av ett ZEISS LSM 710 konfokalt mikroskop utrustat med ett spektraldetekteringsavsökningshuvud och en 20X/1.0 NA vatten nedsänkning mål (Carl Zeiss). Funktionella tidsserier av visuellt framkallade kalciumsvar i retinala ganglionceller (RGC) förvärvades med en hastighet av 4,1 Hz och 0,415 0,415 0,415 256 pixlar (256 256 pixlar) och 1 au hålöppning. Excitationsljus tillhandahölls av en 488 nm multi-line laser. Icke-anestetiserade TG(elavl3:GCaMP5G) larver immobiliserades i 2% låg smältpunkt agaros (Sigma) framställd i Danieau-lösning och monterade ryggsidan upp på en upphöjd glasplattform som placerades i en skräddarsydd Danieau-fylld kammare. Agarosen var tillräcklig för att begränsa larverna så att anestesi inte krävdes. Avbildning utfördes på eftermiddagen (1-8 pm).

Ljusarkavbildning

helhjärnans ljusarkavbildning utfördes med användning av ett ZEISS Lightsheet Z. 1-Mikroskop utrustat med två 10x/0.2 NA-belysningsmål och ett 20x / 1.0 NA-mål för detektering av vatten-nedsänkning (Carl Zeiss). 488 nm laser excitation ljus användes för att framkalla gcamp6f fluorescens och en 505-545 BP filter användes för emitterad ljusdetektering. Pivot-skannern (Carl Zeiss) användes för att leverera homogen belysning och undviker därför skuggor längs belysningsaxeln. Tjockleken på det lätta arket var 5,39 OC i mitten och 10,8 OC i kanterna på synfältet. Exponeringstiden var 29.97 ms. Storleken av volymetriska bilder var 623 × 798 × 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 pixlar) med en upplösning på 0.415 × 0.415 × 0.631 µm. 4 DPF nacre, casper och crystal TG(elavl3:GCaMP6f) larver förlamades först i 10-15 minuter i Bisexuell-bungarotoxin (1 mg/ml; Biotium) framställt i Danieau-lösning. Därefter immobiliserades larverna i 2% låg smältpunkts agaros (Sigma) och placerades inuti en glaskapillär (20 oC-volym, 701904; märke). Vi extruderade därefter sektionen av agaroscylindern som innehöll larvens huvud från kapillären och orienterade larverna så att huvudets ryggsida stod inför detekteringsmålet och ögonen stod inför de två belysningsmålen. Hela hjärnan ljus-ark avbildning av casper mutant larver utfördes med användning av en skräddarsydd ljus – ark mikroskop byggt av Dr Martin Meyer (King ’ s College London) och utrustad med en 20x/1.0 NA vatten-nedsänkning XLUMPlanFLN detection objective (Olympus).

tvåfotonkalciumavbildning

tvåfotonfunktionell Avbildning i näthinnan utfördes med användning av ett Nikon A1R MP-mikroskop utrustat med en 4-kanals GaAsP NDD och ett Apochromat 25x/1.1 NA vatten-nedsänkningsmål (Nikon). Excitation tillhandahölls av en kameleont Ultra II-Lägeslåst Titan-safirlaser (koherent) inställd på 930 nm. Tidsserier av visuellt framkallat kalcium svar förvärvats till en kurs av 4 Hz och 0.248 × 0.248 µm upplösning (512 × 256 pixlar). Efter aktivering av laserskanningen väntade vi 60 sekunder innan vi startade den visuella stimuleringen för att säkerställa näthinnan anpassad till bakgrundsljusnivån orsakad av multifotonlasern. 4 DPF-kristall TG(elavl3:GCaMP6f) larver förlamades först i 10-15 minuter i Bisexuell-bungarotoxin (1 mg/ml; Biotium) framställt i Danieau-lösning. Därefter immobiliserades larverna i 2% låg smältpunkts agaros (Sigma) och monterades på en upphöjd skräddarsydd glasplattform med ryggsidan uppåt (45 kcal vinkellutning) och ett öga mot en LCD-skärm (Se visuell stimulering) som placerades under en skräddarsydd Danieau-fylld kammare. Avbildning utfördes på eftermiddagen (1-8 pm).

visuell stimulering

rörliga staplar i konfokal beredning

rörliga staplar stimuli genererades som tidigare beskrivna22,33. Ett diffusionsfilter (3026, Rosco) var bunden till ena sidan av kammaren för att fungera som en projektionsskärm. Agarosen framför ögat mot projektionsskärmen avlägsnades, vilket möjliggjorde en fri bild av den projicerade bilden på kammarens sida. Larver var placerade 3 cm från skärmen och den projicerade bilden fyllde ett synfält på ~97 63 6. Visuella stimuli bestod av ljus (56 cd/m2) eller mörka staplar (8 cd/m2) (175% respektive 25% av genomsnittlig luminans) på en genomsnittlig grå bakgrund (32 cd/m2). Eftersom inga kvalitativa skillnader mellan ljusa och mörka staplar noterades kombinerades data erhållna med användning av de två stimuli. Varje stapel hade en bredd på 10 kg som rörde sig med en hastighet av 20 kg/s och separerades från föregående stapel med 30 kg, vilket möjliggjorde mer än en stapel på skärmen åt gången. De långa axlarna på staplarna var ortogonala mot rörelseriktningen. Var och en av de 12 rörelseriktningarna presenterades en gång (3 sekunder) i en pseudo-slumpmässig ordning som är unik för varje skiva i varje avbildat djur. Varje inter-epokintervall var 10 sekunder för att gcamp5g-signaler skulle återgå till baslinjen. Ett tomskärmsnull på 2 sekunder var också interfolierat. Visuella experiment genererades och kontrollerades med hjälp av specialskriven Labview och MATLAB-kod (MathWorks), implementerades på en ViSaGe stimulus presentatör (Cambridge Research Systems) och levererades via en DLP Pico-projektor (Optoma).

rörliga galler i tvåfotonberedning

rörliga gallerstimuli i tvåfotonberedningen genererades och kontrollerades med Psykopy39 och levererades via en LCD-skärm (SKD5VA-3, GoodWell-teknik) placerad under en skräddarsydd Perspex-kammare. Ett långpassat rött glasfilter (FGL610, Thorlabs) placerades mellan LCD-skärmen och kammaren för att möjliggöra samtidig bildbehandling och visuell stimulering. Larver var placerade 2 cm från skärmen och bilden på LCD-skärmen fyllde ett synfält på ~140 100 100 (Genomsnittlig bakgrundsluminans 30,4 cd/m2). Visuella stimuli bestod av kvadratvågsgaller (100% kontrast, rumslig frekvens 1,66 cykler/cm, temporal frekvens 1 cykler/s). Varje gallerstång var 8,5 kcal i bredd och de långa axlarna på staplarna var ortogonala mot rörelseriktningen. Var och en av de 12 rörelseriktningarna presenterades en gång (6 sekunder) med och Inter-epokintervall på 10 sekunder för att aktivera gcamp6f-signaler för att återgå till baslinjen. Ett tomskärmsnolltillstånd på 6 sekunder var också interfolierat. TTL-utlösare (0-5-0 volt) för att spela in epoktidshändelser där de genereras via en LABJACK USB DAQ-enhet (U3-LV, LabJack Corporation). Efter aktivering av laserskanningen väntade vi 60 sekunder innan vi startade den visuella stimuleringen för att säkerställa näthinnan anpassad till bakgrundsljusnivån orsakad av multifotonlasern.

Optomotorisk responsanalys

individuella 5 DPF-larver placerades i en 35 mm petriskål innehållande Danieau-lösning. LCD-skärmen på en iPhone 5 (Apple) som styrs av en MacBook Pro (Apple) genom Duet Display (Kairos Technologies) användes för att visa svartvita fyrkantsvågsgaller (85% kontrast, rumslig frekvens 0,33 cykler/mm, temporal frekvens 3,5 cykler/s) rör sig i 4 riktningar (90 msk vinkelavstånd) längst ner på petriskålen. Visuella stimuli genererades i Keynote (Apple). Varje larva testades 5 gånger totalt (varje försök varade 6 s följt av 10 s statiska galler) och fick poäng enligt de försök som den svarade på (Dvs fisk vänder och simmar i riktning mot de rörliga gallren). Larvernas beteende övervakades visuellt med hjälp av ett M165 FC Stereomikroskop (Leica).

analys

funktionella analyser

in vivo kalciumbildningsdata analyserades som tidigare beskrivna22, 33. Sammanfattningsvis behandlades funktionella tidsserier före analys enligt följande: tidsseriebilder från varje experiment korrigerades för rörelse med en styv kroppsalgoritm (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), medianfiltrerad med en kärnstorlek på 1 voxel för att ta bort mörkt och skottbrus och rumsligt jämnas ut med en 2D Gaussisk kärna = 2 voxlar för att förbättra signal-till-brus. En baslinje (B) som korrigerar för lågfrekventa drivningar bestämdes med användning av en kubik-splinealgoritm extrapolering mellan knutar i genomsnitt från 5 s av Inter-epokintervalldata. Båda relativa signalintensitetsförändringarna (KAZAKF = F-B; där F = rå fluorescens) och normaliserade signalintensitetsförändringar beräknades vid varje voxel. För befolkningsfunktionella data (voxel-wise analysis) användes un-dertill, medan %un-Fi/F0 användes för manuellt definierade regioner av intresse (Roi). För varje voxel eller ROI beräknades det integrerade svaret över epokintervallet för att ge ett enda svarsmått för varje presenterad stimulansrörelse. Integralet inom varje epokfönster är en sammanfattande metrisk som är mer resistent mot mättnadseffekter av kalciumsonden än maximal signalförändring. En tröskel för varje voxel inom en förvärvsbildsekvens bestämdes utifrån variansen för förändringar i usci under inter-epokintervall och null-tillstånd, tröskel = 5 SDS i usci. Alla voxlar som var övertröskel inom minst två visuella presentationsepoker betraktades som visuellt lyhörda och utsattes för ytterligare karakterisering.

för att analysera riktnings-och orienteringsselektiviteten hos visuellt responsiva voxels riktnings-och orienteringsselektiva index (DSI och OSI)40, baserat på monterade von-Mises eller gaussiska profiler41, beräknades tillsammans med en uppskattning för deras godhet, R2. DSI definierades som (Rpref−Rnull)/(Rpref + Rnull), där Rpref, svaret på den föredragna riktningen, var det integrerade svaret över det föredragna riktningsepokintervallet. Rnull beräknades på liknande sätt som det integrerade svaret framkallat av riktningen motsatt den föredragna riktningen. OSI definierades som (Rpref−Rorth)/(Rpref + Rorth), där Rpref, svaret på den föredragna orienteringen, var det integrerade svaret över det föredragna orienteringsepokintervallet. Rorth beräknades på samma sätt som det integrerade svaret som framkallades av den ortogonala orienteringen. För att minimera korssamtal och överpassning i samband med DSi-och OSI-mätvärden genomfördes ett strikt tillvägagångssätt. För att en voxel ska betraktas som riktningsselektiv (DS) eller orienteringsselektiv (OS) användes ömsesidigt exklusiva kriterier: DS if DSI > 0.5 och OSI < 0.5; och OS om OSI > 0.5 och DSI < 0.5. I båda fallen måste godheten för passform (R2) för DSi respektive OSI vara >0,8; således förklarade de monterade kurvorna minst 80% av de integrerade svaren. En enda von-Mises-fördelning användes för att passa svar från DS-voxlar och uppskatta deras föredragna rörelseriktning från mitten av den monterade kurvan. Summan av två von-Mises (vinkelavstånd på 180 kcal) användes för att passa svar från OS-voxlar och uppskatta deras föredragna orientering av rörelsevinklar från mitten av de monterade kurvorna. Cirkulär varians beräknades också för jämförelse som ett alternativt mått för orienteringsselektivitet (cirkulär varians < 0.4)41.

morfologiska analyser

för att bestämma hjärnvolymen avbildad i 4 dpf nacre, casper och crystal Tg(elavl3:Gcamp6f) larver, beräknade vi antalet GCaMP6f + voxels i varje volymetrisk bild genom att tillämpa adjust>tröskelfunktion följt av analyse>histogram>listkommando i ImageJ42. Därefter erhålls värden var multiplicerat med volymen av en enda voxel (0.415 × 0.415 × 0.631 µm3 = 1.086 × 10-1 µm3).

statistiska analyser

statistiska testresultat rapporteras i siffror och Figurlegender. Statistiska analyser och tester utfördes med användning av Prism 6 (GraphPad) eller MATLAB R2014b (MathWorks). Innan statistiska tester utfördes användes beskrivande statistik (t.ex. normalitetstester för att se om värden kommer från en Gaussisk distribution eller F-test för att jämföra avvikelser) för att välja lämpligt statistiskt test (rapporterat i Figurlegender tillsammans med testresultat). Kriteriet för statistisk signifikans sattes till p < 0,05.