Abstrakt
befintliga kemotaxisanalyser genererar inte stabila kemotaktiska gradienter och mäter således—över tid-funktionellt endast ospecifik slumpmässig rörelse (kemokinesis). I jämförelse har microfluidic teknologi kapaciteten att frambringa en tätt kontrollerad microenvironment som kan vara stabilt underhålls för längre perioder av tid och är, därför, mottaglig till anpassning för analys chemotaxis. Vi beskriver här en ny mikrofluidisk anordning för känslig analys av cellulär migration och visar dess tillämpning för utvärdering av kemotaxi hos glatta muskelceller i en kemokingradient.
1. Introduktion
riktad cellmigration spelar en kritisk roll vid inflammatoriska störningar, kärlsjukdom, sårläkning och tumörmetastas . Ett antal in vitro-metoder har utvecklats för att kvantifiera cellmigration, inklusive stängning av monolagersår (”scratch assay”) och Boyden-kammaren . Dessa nuvarande metoder är emellertid relativt okänsliga. Dessutom kan sådana tillvägagångssätt faktiskt mäta endast kemokinesis, det vill säga ökad slumpmässig rörelse, snarare än kemotaxiriktad cellmigration.
faktum är att nyttan av scratch-analysen och Boyden chamber transwells begränsas av deras metodologiska design.
För scratch-analysen görs ett definierat ”sår” (scratch) i ett sammanflytande cellmonolager; celler vid kanterna av defekten fyller sedan gradvis i tomrummet och tiden till återställd sammanflöde kvantifieras. Snabbare reparation av repan har tolkats för att återspegla förbättrad ”kemotaxi” på grund av cellmanipulation eller naturen hos lösliga medel som tillsätts mediet. Medan experimentet är konceptuellt enkelt och tekniskt lätt att utföra, badas cellerna i en enhetlig koncentration av medel, och det finns ingen kemoattraktant koncentrationsgradient under hela experimentet; rörelsen som fyller i gapet representerar därför bara en ”slumpmässig promenad.”Således är” migrationen ” i en skrapanalys till stor del en funktion av endast ökad kemokinesis. Dessutom, som vanligtvis utförs-särskilt under flera timmar av en långvarig analys-stängningen av ett rep ”sår” innefattar sannolikt också en väsentlig komponent av cellproliferation.
den andra vanligaste metoden för att mäta ”kemotaxi” innebär användning av Boyden chamber transwells. Olika koncentrationer av specifika kemokiner placeras i anordningens nedre fack, medan cellerna som ska utvärderas inkuberas i den övre insatsen; ett mikroporöst membran separerar de två kamrarna och bildar ett stöd för celltillväxt och en partiell barriär för migration. Celler som räknas vid membranets nedre yta, eller som ackumuleras i den nedre kammaren, bedöms vanligtvis vid en enda fast slutpunkt. Denna analys har fördelen av en uppenbar riktad migration, det vill säga från övre till nedre kammaren men är fortfarande problematisk. För det första finns det ingen ”gradient” av kemokiner från topp till botten utan snarare bara en enda stegfunktion från låga till höga koncentrationer. För det andra finns det inget sätt att upprätthålla kemokindifferensen från topp till bottenkamrarna . Initialt är kemokinkoncentrationen i det nedre facket större men inom några minuter till timmar utjämnas koncentrationerna på grund av diffusion, vid vilken punkt specifik kemotaxi upphör. Istället återspeglar långsiktiga mätningar mer sannolikt ett betydande element i kemokinesis. Dessutom, när celler faller genom membranet och in i den nedre kammaren, finns det ingen möjlighet för omvänd migration. Slutligen är Boyden-kammaren också begränsad eftersom cellräkning kräver att experimentet avslutas; en tidskurs kräver därför flera enheter.
mikrofluidisk teknik kan övervinna dessa begränsningar genom att generera en långsiktig stabil och kontrollerbar gradient av lösliga faktorer som kontinuerligt kan övervakas över tiden . Med hjälp av celler som har behandlats för att blockera proliferation tillåter en sådan anordning en sann pågående bedömning av kemotaxi kontra kemokinesis. Figur 1 visar en sådan anordning där käll-och sänkkoncentrationerna upprätthålls genom att skapa motsvarande brunnar vars volymer är stora i förhållande till det diffusa flödet genom den anslutande hydrogelkanalen . Vid steady state bildas en linjär koncentrationsgradient mellan dessa två brunnar. Även om interstitiellt flöde genom hydrogelregionen kan störa gradienten om de hydrostatiska trycket i de två brunnarna inte är lika, elimineras tryckgradienter genom att ansluta källbrunnarna och sjunkbrunnarna med ytterligare kanaler och reservoarer som fungerar som vägar med låg resistans för vätskeflöde och tryckjämvikt. Gradienter kan således bibehållas i flera dagar och användas för att studera cellmigration på ett känsligt och specifikt sätt med en mängd olika celltyper . Arbetet som presenteras här beskriver användningen av sådana anordningar för att bedöma kemotaxi för primära kulturer av glatta muskelceller och att jämföra det med scratch och Boyden chamber tekniker för känslighet.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Device design and stability of concentration gradients as a function of time. (a) de nedre 3 brunnarna är cell-och/eller källbrunnar för kemokiner, och de övre 3 brunnarna fungerar som reservoarer för att upprätthålla ekvivalenta Tryck i de nedre brunnarna. Beroende på experimentell design kan sidobrunnarna eller den centrala brunnen fungera som källbrunnar; celler i en central brunn kan migrera mot olika kemokinstimuli på vardera sidan, eller olika cellpopulationer i sidobrunnarna kan migrera mot en central kemokinstimulans. (b, c) koncentrationsgradienter visas schematiskt efter tillsats av en fluorescerande färgindikator med låg molekylvikt till källbrunnen och källbehållaren, antingen 2 timmar (b) eller 72 timmar (c). (D) grafisk visning av koncentrationsgradienter från 0 timme till 72 h efter tillsats av fluorescerande färgämne till källbrunn och behållare.
2. Material och metoder
2.1. Primära glatta muskelceller (SMC) kultur
Aortas skördades från 8 veckor gamla C57/B6-möss (Charles River, Wilmington, MA) med steril dissekering sax. Adherent fett avlägsnades och aortas inkuberades i 20 minuter vid 37 kcal C i Dulbeccos modifierade Eagle ’ s medium (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) innehållande 1% penicillin/streptomycin, 2% fetalt bovint serum och 5 mg/mL kollagenas typ II (Invitrogen). Aortas sköljdes i kallt DMEM och adventitia dissekerades försiktigt bort; de skars sedan i små bitar och inkuberades i 30 minuter vid 37 kcal C i DMEM innehållande 1 mg/mL kollagenas typ i (Invitrogen) och 0,125 mg/mL elastas typ III (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO). Efter upprepad pipettering för att dissociera vävnaden suspenderades den resulterande cellblandningen i färskt ”SMC-medium” (DMEM med 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin/streptomycin; 2% icke-essentiella aminosyror, 1% L-glutamin; alla reagenser från Invitrogen) och odlades vid 37 kg C i en 5% CO2-inkubator på plattor belagda med 1 mg/mL fibronektin i 30 minuter. När cellkulturen är etablerad (vanligtvis efter den första passagen) odlas SMC på obelagda plastflaskor (Corning Incorporated, Corning, NY).
SMC användes från passager 2 till 7 och var 99.5% ren som bedömts genom flödescytometri efter färgning för glatt muskulatur-actin. För färgning skördas celler och fixeras med 1% paraformaldehyd (Sigma-Aldrich) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). FITC-konjugerad antismooth muskel-actin antikropp (Sigma-Aldrich) vid 1 : 100 utspädning i 10x BD perm/tvättbuffert (BD Pharmingen, San Jose, Kalifornien) applicerades i 10 min vid rumstemperatur. Celler tvättas två gånger med 1% fetalt bovint serum i PBS och en gång med 1% fetalt bovint serum i PBS innehållande 1% formaldehyd och analyseras omedelbart med flödescytometri (FACScalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). FITC-konjugerad mus IgG1-isotyp (BD Pharmingen) används som en isotypkontroll. Celler för kemotaktiska analyser skördades när de hade uppnått sammanflöde.
2.2. Mitomycin-C-behandling
celler trypsinerades (0,25% trypsin-EDTA; Invitrogen) i 2 minuter vid 37 CCG, tvättades med SMC-medium och inkuberades sedan som en encellig suspension i 40 CCG / mL mitomycin-C (MMC; Sigma-Aldrich) i SMC-medium för 30 min vid 37 kcal C. Efter ytterligare två tvättar i PBS bedömdes celler för livskraft, proliferation eller migrationskapacitet. För sårläkning (scratch) – analysen utfördes MMC-behandling efter SMC-plätering och när cellerna var 100% sammanflytande; celler inkuberades i 40 oC/mL MMC i SMC-medium i 30 min vid 37 oc C och tvättades sedan två gånger i PBS före analys.
2.3. SMC-Proliferationshämningsanalys
Efter MMC-behandling eller kontrollinkubation i SMC-medium odlades SMC i 6-brunnsplattor (Corning Incorporated). Celler återhämtades efter 1 h, 24 h eller 48 h genom trypsinisering och cellnummer och livskraft bedömdes genom att räkna med hjälp av en hemocytometer och trypanblå uteslutning.
2.4. Sårläkning / Skrapanalys
SMC odlades i 12-brunnsplattor (Corning Incorporated) tills de sammanfogades och behandlades sedan med MMC. Efter tvättning tillsattes färskt SMC-medium och cellmonoskiktet repades på ett reproducerbart sätt med hjälp av en steril 200 oc-pipettspets. Olika koncentrationer av trombocyt-härledd tillväxtfaktor (PDGF; R&d-system, Minneapolis, MN) i SMC-media tillsattes till varje brunn. Avståndet mellan kanterna på repdefekten mättes och i genomsnitt från fem separata punkter vid 3, 6 och 9 h, eller tills sårdefekten hade stängts.
2,5. Boyden Chamber Transwell Assay
100 oc l SMC–suspensioner vid 1,0–1,5 oc l 105 celler/mL (1,0-1,5 oc l 104 totala celler) laddades in i de övre transwellinsatserna (Costar, Corning Incorporated) och 600 oc l SMC-media innehållande olika koncentrationer av PDGF placerades i det nedre facket. Efter 6 h, 12 h eller 24 h inkubation färgades transwellmembranet med Hoechst 33342 (Invitrogen) enligt tillverkarens rekommendation och transmigrerade celler på nedre ytan räknades på ett fluorescensmikroskop med användning av MetaMorph NX-Mikroskopiautomation och Bildanalysprogramvara (BioCompare, South San Francisco, CA). Inga celler identifierades någonsin i mediet i den nedre kammaren. I experiment för att bedöma om cellmigration representerade kemotaxi eller slumpmässig kemokinesis i frånvaro av en koncentrationsgradient, blodplätt härledd tillväxtfaktor-BB (PDGF) tillsattes till den nedre kammaren, endast toppinsatsbrunn, eller både toppinsats och nedre kammare.
2.6. Mikrofluidanordning analys
mikrofluidanordningarna(figurerna 1(A)-1 (c)) framställs enligt beskrivningen på annat håll . Som visas i Figur 1(d) är gradienter av tillsatta reagens stabila i minst 72 timmar. Beroende på det experimentella protokollet placeras celler som ska utvärderas i den centrala brunnen och olika kemotaktiska gradienter utvecklas från de två sidobrunnarna. Alternativt kan migrationen av två olika populationer av celler utvärderas från sidobrunnarna och upplever identiska koncentrationsgradienter genererade av reagenser placerade i den centrala brunnen. Cellkoncentrationer var alltid 4-5 105/ml och 40 av cellsuspensionerna (1,6–2,0 103 celler) laddades i testbrunnar.
celler inkuberades i anordningarna för olika tidpunkter och färgades sedan med Hoechst 33342 (Invitrogen). Placeringen av varje cell bestämdes med användning av fluorescensmikroskopi (Nikon Eclipse TE2000-U; Nikon Instruments, Inc., Melville, NY), och avståndet migrerades bedömdes med hjälp av Matlab-programmet (MathWorks, Natick, MA). ”Total migration” definieras som summan av de avstånd som migrerats av alla celler bortom en initial startplats; detta migrationsindex används för statistisk analys (Figur 2).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
bedömning av cellmigrering i mikrofluidiska enheter. Celler pläterades i den centrala nedre brunnen av en mikrofluidisk anordning, med 50 ng / mL PDGF i SMC-medium placerat i den vänstra nedre brunnen och SMC-mediet ensamt placerat i den högra nedre brunnen, följt av inkubation vid 37 CCC för 48 h. (a, b) faskontrastbild av cellkemotaxi från den centrala kanalen i riktning mot 50 ng/mL PDGF i den vänstra kanalen; bilderna delas längs kanalen mellan diskbänken och källbrunnarna så att kanalens fulla längd kan visas med en förstoring som är tillräcklig för att tillåta cellulär upplösning. (c, d) faskontrastbild av cellkemokinesis från den centrala kanalen endast i riktning mot SMC-medium. (e, f) fluorescensbild med låg effekt av vänster (e) eller höger; (f) kanal vid 48 h efter färgning med Hoechst 33342. (g) högeffektfluorescensbild av den vänstra kanalen i panel (e); den svarta fyrkanten utan celler nära bildens högra sida (asterisk) är en strukturell post som markerar startpunkten för migreringen. h) exempel på migrationsanalys. En vertikal röd linje betecknar startpunkten; avståndet från startpunkten till mitten av varje cellkärna mäts, och summan av alla dessa individuella mätningar blir det totala migrationsavståndet med Matlab.
kollagen typ I (Invitrogen) används för att fylla kanalen mellan centrala och sidobrunnar och är substratet genom vilket celler migrerar. Både 1 mg/mL och 2 mg/mL kollagen kan användas. Även om 1 mg/mL kollagen resulterar i något högre ospecifik bakgrundscellkemokinesis och gelbelastning är tekniskt svårare än med 2 mg/mL kollagen, tillåter den lägre kollagenkoncentrationen större migration av primära kulturer av SMC, och analyskänsligheten är bättre. Om inte annat anges var koncentrationen av kollagen i migrationskanalerna 1 mg/mL för alla experiment.
2.7. Statistisk analys
statistiska jämförelser gjordes med hjälp av Student-test eller enkelriktad ANOVA. Betydelsen definierades på nivån.
3. Resultat och diskussion
som visas i Figur 3 (a) blockeras cellproliferation genom MMC-behandling. Det finns ingen signifikant skillnad i cellviabilitet mellan MMC-behandlad SMC (%) och obehandlad SMC (%) i upp till 48 timmar efter behandling. Således representerar cellackumulering i de olika migrationsanalyserna sann cellrörelse utan någon komponent i cellproliferation. Detta är viktigt eftersom utan MMC-behandling kan migrationsindex från långvariga inkubationer förväxlas av sammanfallande cellulär proliferation.
(a)
(b)
(C)
(d)
(a)
(b)
(C)
(d)
i scratch-analyser(Figur 3 (B)) med primära SMC-kulturer migrerade celler slumpmässigt (kemokinesis) för att fylla i defekterna i jämförbara hastigheter oavsett PDGF-koncentration, inklusive i frånvaro av något kemotaktiskt medel. Utan MMC-behandling tenderar sårfel att stängas något tidigare, vilket tyder på ett element av cellproliferation.
Figur 3 (c) visar migrationsresultaten för SMC med hjälp av Boyden chamber transwell-analysen. Den tidiga (12 h) tidpunkten visar liten men signifikant ökad migration som svar på 10-50 ng/mL PDGF kontra ingen kemokin i bottenbrunnen. Det fanns emellertid ingen särskiljbar skillnad i migration över ett 10-faldigt koncentrationsområde av PDGF, vilket tyder på att analysen är relativt okänslig, åtminstone för primära SMC-kulturer. Dessutom finns det efter 24 timmar inga skillnader mellan någon av koncentrationerna av kemokiner (inklusive mediumkontrollen) som tyder på att migration vid denna tidpunkt är ospecifik när cytokinkoncentrationerna har börjat jämvikta mellan de övre och nedre brunnarna.
för att formellt visa att migration över membranet i den övre brunnen inte nödvändigtvis beror på riktad kemotaxi, tillsattes PDGF till den övre brunnen, med eller utan PDGF i det nedre facket. Även i frånvaro av en kemokingradient ledde PDGF i den övre kammaren till markant ökad transmigration (Figur 3(d)); detta kan endast hänföras till ökad kemokinesis.transwellexperimenten antyder således att även om initiala PDGF-koncentrationsskillnader kan inducera en viss grad av ökad cellmigrering mot högre koncentrationer i de nedre brunnarna, leder efterföljande PDGF-diffusion till slumpmässig kemokinesis.
i jämförelse visar dosresponsexperiment med användning av mikrofluidiska enheter (Figur 4) signifikant kemotaxi vid koncentrationer så låga som 2.5 ng/mL PDGF (Figur 4 (b)) och visar en dosberoende ökning av kemotaxi med en topp på cirka 25-50 ng/mL(Figur 4 (A)). Intressant är att högre koncentrationer av PDGF (t.ex. 100 ng/mL) leder till mindre migration, vilket överensstämmer med en högdos kemotaxisstopp (18). Observera, utan föregående MMC-behandling, är migrationsindexet större(Figur 4 (A)), vilket belyser det icke-negativa bidraget från spridning till ”uppenbar” kemotaxi som uppträder med längre analystider. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or ”gold standard” Boyden chamber approaches.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Microfluidic device assay. (a) Dosresponskurvor med och utan föregående MMC-behandling. MMC-behandlade och icke-behandlade SMC placerades i sidocellsbrunnar, med olika koncentrationer av PDGF (5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL och 100 ng/mL) närvarande i de centrala källbrunnarna. Migration mättes efter Hoechst 33342 färgning och fluorescensmikroskopi efter 48 h, med hjälp av Matlab-programmet för att beräkna total migration. Kontroller (endast SMC-medium) och varje koncentration av PDGF utvärderades i tredubbla enheter. Signifikanta skillnader kan ses från 5 ng/mL till 100 ng / mL PDGF jämfört med kontrollen (). (B) Kemokinesis kontra kemotaxi i mikrofluidiska enheter. MMC-behandlad SMC med eller utan 2,5 ng/mL PDGF pläterades i den centrala cellbrunnen; 2,5 ng/mL eller 50 ng/mL PDGF tillsattes till sidokällbrunnarna. Utan PDGF närvarande i den centrala cellbrunnen visar analysen signifikant större total migration efter 48 h med 50 ng/mL i källbrunnen (”0-50”) kontra 2, 5 ng / mL i källbrunnen (”0-2, 5”). Närvaron av 2, 5 ng/mL PDGF i den centrala cellbrunnen leder till signifikant större total migration när det finns en koncentrationsgradient (”2, 5-50”; ) hänförlig till en lokal kemokineseffekt. I frånvaro av en gradient (”2,5–2,5”) finns det en kemokinesassocierad migration som är signifikant mindre än migrationen som ses när en gradient är närvarande (”0-2, 5”;). (c) time-course experiment utförs som panel (b).
inte bara kan den mikrofluidiska enheten användas för mätning av kemotaxi, men det kan också specifikt skilja bidrag från kemokinesis och kemotaxi till migration (Figur 4(B)). Således, i frånvaro av en kemokingradient (t.ex. 2.5 ng / mL PDGF i både mitt-och sidobrunnar) återspeglar migrationsindexet kemokinesis. I jämförelse, utan PDGF i mittbrunnen och 2,5 ng/mL i sidbrunnen, återspeglar migrationsindexet riktad kemotaxi. Den mikrofluidiska enheten kan också bedöma kemotaxi i närvaro av befintlig kemokinesis, som när mittbrunnen innehåller 2, 5 ng/mL PDGF och sidbrunnen innehåller 50 ng/mL. Det finns en liten men statistiskt större migration när stimulansen är en kemotaktisk gradient snarare än enkel kemokinesis.eftersom kemokingradienten etableras inom 2 timmar (17) och är stabil i flera dagar kan celler kontinuerligt migrera upp koncentrationsgradienten över tiden (Figur 4(c)). I jämförelse har andra klassiska metoder antingen ingen koncentrationsgradient (skrapanalys) eller har bara en övergående kemokingradient, så att kemokinesis—snarare än riktad kemotaxi—blir alltmer bidragande.
den mikrofluidiska enheten som rapporterats i detta arbete är överlägsen i ett antal avseenden jämfört med andra in vitro-metoder som tidigare använts för att studera kemotaxi. I synnerhet har Boyden-kammaren-som involverar en kemokingradient över ett poröst membran-varit en standardkemotaktisk analys sedan 1950-talet. emellertid har denna enhet betydande begränsningar i att gradienter varken är stabila eller linjära, med ett initialt skarpt koncentrationssteg upp som gradvis försämras över tiden. Mer nyligen Micro-electromechanical system (MEMS) teknologier framkallades som använder microfluidic biochips för att efterlikna in-vivo villkorar; i dessa apparater, celler exponeras kontinuerligt till skjuvkrafter under kontrollerat flöde. Det kontinuerliga flödet av dessa enheter utgör emellertid en utmaning för underhållet av stabila kemokingradienter. Även om hydrogeler mellan källan och sänkkanalen kan skapa linjära koncentrationsgradienter , kan subtila variationer i brunnarna och kanalerna ge upphov till tryckgradienter som stör gradienterna genom interstitiellt flöde ; dessutom tenderar det kontinuerliga flödet av anordningarna att späda ut eventuella kemoattraktanter som utsöndras av cellkällor. I den nya mikrofluidiska anordningen som beskrivits tidigare och validerats för glatt muskelcellmigration i detta dokument upprätthåller stora volymkällor och sjunkbrunnar stabila kemokingradienter i den anslutande hydrogelen; vilket interstitiellt flöde som helst elimineras genom att ansluta källan och sjunkbrunnarna med ytterligare kanaler och reservoarer som fungerar som en motståndskondensatorkrets. Koncentrationsgradienterna är således stabila och linjära i flera dagar. Det nuvarande arbetet har ytterligare förfinat applikationen och införlivat mitomycin-C-behandling för att minska eventuella förvirrande bidrag från proliferation och demonstrera hur kemotaxi och kemokinesis kan bedömas i samma experimentella inställning.
intressekonflikt
författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
bekräftelser
detta arbete stöddes av ett bidrag från BWh-BRI-Fonden för att upprätthålla forskningsexpertis-Bridge Research Grant. Chen Zhang stöddes av China Scholarship Council i 18 månader. Ovid C. Amati och Richard T. Lee stöddes delvis av NSF Science and Technology Center CBET-0939511.
