föreningar

ALDH1A1-hämmare har nyligen beskrivits 30. LDHA-hämmare beskrevs tidigare i Rai et al.29. IDH1-hämmare beskrevs tidigare i Urban et al. och Davis et al.24,36. Andra föreningar som användes i studien var metotrexat (Medchem Express, HY-14519), Panobinostat (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MedChem Express HY-18690), Isofagomine (Toronto Research Chemicals #I816010), Lumacaftor (BioVision #2857) och LY2857785 (MEDCHEM Express, HY12293). För qHTS testades föreningar i mekanismen förhörsplatta (MIPE) i 11-poäng (intraplatta, 1:3 utspädningsfaktor). Kinashämmarsamlingen innehållande 977 kinashämmare testades i 7-punktsdoser (interplate, 1:5 utspädningsfaktor). I alla fall användes DMSO som fordon.

kloning

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Öppna Läsningsramar (ORF) av generna av intresse klonades in i acceptorryggbenen med BamHI/EcoRI (N-terminal) eller nhei / BamHI (C-terminal) platser genom PCR-förstärkning av kodningsområdet med Infusionskompatibla oligonukleotider, definierade i detalj i kompletterande tabell S1. IDH1, LDHA, DHFR, GC och ALDH1A1 konstruktioner framställdes genom GeneArt Gensyntes (ThermoFisher) i pcDNA3.1 (+). För Gateway-kloning (endast IDH2-konstruktioner) skapades en destinationsvektor som innehåller 86B-taggen genom att ersätta v5-taggen i pcDNA3.2-V5/DEST. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ’scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes ”LPTFLYKVVDLEGPR” prior to the 86b tag.

cellkultur

HEK293T, LN18, ov-90, HeLa, 22rv1, mda-MB-468 och HT-29-celler erhölls från ATCC (CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132 respektive HTB-38). HuCC-T1 och CC-LP-1 var en snäll gåva av Dr.N. Bardeesy (Massachusetts General Hospital, Boston). Hek293t-celler odlades i DMEM (4,5 g/L glukos) med 10% fetalt bovint serum (FBS), 6 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 50 U/mL penicillin och 50 kg / mL streptomycin. Ln18, HT-29, CC-LP-1 och HeLa-celler odlades i ovanstående medium utan natriumpyruvat. Ov-90-celler odlades i en 1:1-blandning av MCDB 105-medium (Cell Applications Inc.) och m199 medium (Hyklon, GE), kompletterat med 15% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin (Life Technologies) och en slutlig koncentration av 1,85 g/L natriumbikarbonat (Hyklon, GE). 22rv1 -, HuCC-T1-och MDA-MB-468-celler odlades i RPMI 1640 kompletterat med 10% FBS, 6 mM L-glutamin, 100 enheter/mL penicillin, 100 kg/mL streptomycin. Alla celler odlades vid 37 C i en fuktad inkubator som hölls vid 5% CO2 och testades negativt för mykoplasma med hjälp av en mycoalert detection kit (Lonza).

rekombinant protein och peptidproduktion och rening

11S och 86B proteiner framställdes av GenScript. För rekombinant 11S-fragment smältes den kodande DNA-sekvensen till en 6x His-tagg för att underlätta nedströmsrening och sekvensen subklonades till en E. coli-uttrycksvektor. BL21-Stjärnceller (DE3) transformerades med rekombinanta plasmider och en enda koloni inokulerades i LB-medium innehållande IPTG för induktion av proteinuttryck. SDS-PAGE och Western blot analysis användes för att övervaka uttrycket och välja optimal skördetid. Celler skördades genom centrifugering och pellets lyserades genom ultraljudsbehandling. Efter His-tag-rening steriliserades fraktioner genom ett 0,22 occurm-filter. Proteiner analyserades av SDS-PAGE och Western blot med användning av standardprotokoll och en mus-anti-His mAb (GenScript, Cat.No.A00186). koncentrationen av renat protein bestämdes med användning av en Bradford-proteinanalys med BSA som standard. Protein lagrades i 1x PBS, 10% glycerol, pH 7.4 och renhet var ungefär 90%, vilket uppskattades genom densitometrisk analys av Coomassie Blue-stained SDS-PAGE gel under reducerande förhållanden. Den 15 aminosyran 86B peptiden lagrades i ultrapure dH2O och var 99,9% ren av HPLC.

låg genomströmning (96-brunns PCR-plattor eller-remsor) CETSA-komplementeringsanalys

celler transfekterades i 6-brunnsskålar med användning av en omvänd transfektionsförfarande, där 1,25 ml komplex (6,25 kg Lipofektamin 2000 och 3 kg DNA per brunn) kombinerades med 1,25 ml HEK293T-cellsuspension (1 kg 106/mL, 1,25 kg 106 celler totalt). För CDK9 användes 2 mikrogram DNA per brunn. Efter 24 timmar (48 timmar för CDK9) skördades celler genom trypsinisering och resuspenderades vid 1 106 celler/ml (om inte annat anges) i CETSA-buffert innehållande DPBS (med CaCl2 och MgCl2) plus 1 g/L glukos, 1x Halt proteashämmare cocktail (ThermoFisher) och 0,5% DMSO (DMSO tillsattes inte för experiment som fick efterföljande förening och fordonsbehandling). För temperaturintervallexperiment (utan förening eller enstaka doser), proverna alikvoterades till PCR-remsor vid 30 occyl per rör. Förening tillsattes och celler inkuberades vid 37 2CB C för 1 h. proverna upphettades sedan för 3.5 min med användning av en föruppvärmd termisk cykler, tillåtet att jämvikta till rumstemperatur, och 6 occyl av 6% NP40 tillsattes till varje brunn. För frysnings-upptiningsexperiment placerades rör i ett aluminium-PCR-block på ett torris/etanolbad i 3 minuter följt av inkubering vid 37 kcal C i 3 minuter, vortexing i 3 sekunder och upprepa dessa steg ytterligare tre gånger. 11S (GenScript) och furimazin substrat (från Nano-Glo luciferas analyssystem, Promega) tillsattes, vid slutliga koncentrationer av 100 nM och 0.5x, respektive, och prover analyserades för luminiscens intensitet med användning av en ViewLux hög genomströmning CCD imager (Perkin Elmer) utrustad med tydliga filter.

384-well CETSA-analys

celler transfekterades i T75-kolvar med användning av en omvänd transfektionsprocedur, där 9 mL komplex (45 kg Lipofektamin 2000 och 22,5 kg DNA) kombinerades med 10 mL HEK293T-cellsuspension (1 kg 106 celler/mL, totalt 10 miljoner celler). Efter 24 timmar skördades celler genom trypsinisering, resuspenderades vid 1 106 106 celler/ml enligt beskrivningen ovan och dispenserades (15 184-brunnsceller/brunn) i 384-brunns PCR-plattor (Roche) med användning av en Multidrop Combi (ThermoFisher). Föreningar (63 nl) eller DMSO vehicle control (63 nL) fästes därefter med hjälp av ett stiftverktyg (GNF) och inkuberades i 1 h vid 37 kcal C. plattorna förseglades och upphettades vid den angivna temperaturen i 3,5 minuter och kyldes till 25 kg C med AB qPCR-maskin (Roche) med ramphastighet på 1,5 kg c/SEK för uppvärmningsfas och max ramphastighet för kylfasen. Tre av 6% np40 tillsattes per brunn och inkuberades under 30 min för att tillåta celllys följt av tillsats av 11S och furimazin substrat (vid slutliga koncentrationer av 100 nM och 0,5 x, respektive). Prover analyserades för luminiscensintensitet med användning av en ViewLux-läsare.

1,536-well CETSA-analys

celler transfekterades och skördades enligt ovan (384-well-protokoll). Celler dispenserades (5 occl cell / brunn) i 1,536-brunns vita plattor (Aurora, cyklisk olefinpolymer, cat# EWB041000A) med användning av en Multidrop Combi. Föreningar (23 nL) fästes därefter med hjälp av ett stiftverktyg (Wako Automation) och inkuberades i 1 h vid 37 CCG.plattor upphettades vid den angivna temperaturen och tiden med hjälp av ett värmeblock (se nedan) och kyldes till 25 CCG. en 6% np40 tillsattes per brunn och plattor inkuberades i 30 min för att tillåta celllys följt av tillsats av 3 11 CCG (slutlig koncentration 100 nM) och furimazinsubstrat. Plattor centrifugerades och analyserades för luminiscensintensitet med användning av en ViewLux-läsare. För ldha-och CDK9-skärmarna, en slutlig koncentration av 0,5 X och 0.25X furimazin användes respektive. Normaliseringskontroller inkluderar DMSO-och GSK2837808A-behandlade prover eller ouppvärmda prover för LDHA respektive CDK9. CDK9-motskärmen utfördes enligt ovan med följande skillnader: 5 oktransfekterade hek293t-celler (1 oktransfekterade 106/mL i CETSA-buffert) dispenserades i 1,536-brunnsplattor följt av tillsats av förening, 37 C-inkubation, uppvärmning och lyssteg enligt ovan. Därefter tillsattes 500 pM (slutlig) av 86b till brunnarna, följt av tillsats av 100 nM 11s och 0,25 x furimazinsubstrat (slutlig).

aluminiumblocket för uppvärmning av en 1,536-brunnsplatta designades genom att mäta en platta för att bestämma måtten på området gränsat av gjutna förstärkningsribbor i X och Y, och bottenbrunnsytan och bottenflänsytan i Z. sedan formades ett block som skulle bearbetas från 6061 T6 aluminiumplatta, vilket skulle vara en fri passform med ungefär 0,5 mm avstånd för plattan i alla axlar. Blocket bearbetades med en manuell vertikal fräsmaskin, pinnfräsar och en ansiktsbruk. För ugnsuppvärmningsexperiment placerades plattor i mitten av konvektionslabbugnen (ThermoFisher) och täcktes med metalllock för att minimera avdunstning.

CETSA i cellulära lysater

celler samlades i CETSA-buffert vid 1,0 106 celler/mL (som beskrivits ovan) och NP40 tillsattes till en slutlig koncentration av 0,4%. Efter roterande prover end-over-end för 30 min (rumstemperatur), lysater klargjordes genom centrifugering vid 20,000 xnumx g för 10 min (4 oC). Kofaktor (t.ex. NAD+) tillsattes till det klarade lysatet. För temperaturresponsexperiment överfördes 25 occyl lysat till PCR-rör och upphettades i 3,5 min till olika temperaturer. För isotermiska dos-responsexperiment dispenserades 5 occyl av klargjort lysat till 1536-brunnsplattor med användning av en bioraptr FRD-arbetsstation och prover upphettades på ett aluminiumblock. Prover tilläts jämvikta till rumstemperatur och substrat tillsattes (slutlig koncentration: 100 nM 11s, 0,5 x furimazin). Luminiscens fångades med hjälp av en ViewLux imager som beskrivs ovan.

Western blots

prover bearbetades enligt beskrivningen i avsnittet om komplementeringsanalys med låg genomströmning, med användning av frys-tina cykler för Lys. Lysater centrifugerades vid 15,200 xnumx kg för 20 min vid 4 xnumx xnumx C. prover kördes på en 4-12% Bis-Tris NuPAGE gel (Termofiskare) med MOPS buffert och överfördes till ett PVDF-membran med användning av ett iBlot 2-överföringssystem vid 25 V för 7 min. Membranen blockerades med en 5% mjölklösning (50 mM Tris HCl, pH6; 150 mM NaCl; 0,1% Tween-20) och primära antikroppar inkuberades över natten vid 4 kg C i blockerande lösning. Antikroppar var: anti-IDH1 (, cellsignalering # 8137, 1:500), Anti-IDH1(R132H) (Millipore #MABC171, 1:500), anti-LDHA (, cellsignalering #3582, 1:1000). Anti-kanin / mus-HRP (kanin = cellsignalering 7074; mus = cellsignalering # 7076) tillsattes vid 1:2500 och inkuberades i 1 h vid rumstemperatur. En kemiluminescerande signal genererades med Supersignal west dura solution (ThermoFisher) och fångades med hjälp av ett Biorad Chemidoc-system. Densitometrisk analys utfördes med hjälp av Photoshop-programvara (Adobe).

2-Hg-analys

HEK293T-celler omvända transfekterade i 24 brunnsrätter genom att lägga till 2.5 msk. 105 celler på transfektionskomplex (0,75 kr.g. plasmid-DNA, 1,5 kr. L. Lipofektamin 2000 per brunn). Cellodlingsmedium uppsamlades efter 72 h och 15 occyl överfördes till 384-väl ogenomskinlig platta. 1,5 occyl på 660 mM HCl tillsattes till varje brunn och prover inkuberades vid rumstemperatur i 10 minuter. 1,5 occyl av 720 mM Tris-HCl-bas tillsattes till varje brunn. Sedan, 52 oc 2-Hg detektionslösning (100 mm HEPES (pH 8,0), 100 oc NAD+, 1 oc / mL aktiv rekombinant D-2-Hydroxyglutaratdehydrogenas (D2HGDH; Biovision, Cat: P1001), 5 oc resazurin, 0,03 mg / mL diaphorase (Sigma, Cat: D5540) tillsattes och plattan inkuberades vid rumstemperatur. En 2-HG standardkurva framställdes i 100 mM HEPES (pH 8,0). Fluorescens mättes på en ViewLux-läsare med Ex: 525, Em: 598/25-filter.

biokemiska analyser

ldha-biokemiska analyser utfördes som tidigare beskrivna29. Kortfattat, 3 oc l humant laktatdehydrogenas 5 (2 nM slutlig) (nr. A38558H, Meridian Life Science, Inc.) i LDH-analysbuffert (200 mM Tris HCl, pH 7.4, 100 occurm EDTA och 0.01% Tween-20) sattes till en svart fast botten 1536-brunns analysplatta (Greiner Bio-One). Efter överföring av föreningsstift (23 nL) avgavs 1 kg substratlösning innehållande NADH (0,06 mm slutlig) och natriumpyruvat (0,2 mM slutlig) (Sigma-Aldrich) i LDH-analysbuffert för att initiera reaktionen. Efter 5 min inkubation vid rumstemperatur tillsattes 1 MIKL detekteringsreagens till varje brunn. Plattor överfördes omedelbart till en ViewLux-läsare och eventuell resulterande resorufinfluorescens mättes (ex 540 nm, em 590 nm) vid 0 och 10 min. Fluorescens normaliserades med användning av enzymfria och DMSO-behandlade kontrollbrunnar på varje platta.

aldh1a1 biokemisk analys med användning av otaggat protein utfördes som tidigare beskrivet31, 37. Kortfattat dispenserades 3 Aci l av 20 nM renad human ALDH1A1 i analysbuffert (100 mM HEPES pH 7.5 med 0.01% Tween 20) i en 1,536-brunns fast botten svart platta (Greiner Bio One). Tjugotre nl av föreningar eller kontroll Bay 11-7085 överfördes via stiftverktyg (Wako Automation). Proverna inkuberades (rumstemperatur, skyddad från ljus) i 15 minuter följt av en tillsats av 1 kg substrat av NAD + och Propionaldehyd (slutliga koncentrationer av 1 mM respektive 80 kg). Plattorna centrifugerades och lästes i kinetiskt läge på en ViewLux imager utrustad med 340 nm excitation, 450 nm emissionsfilter för 5 min. Förändringen i fluorescensintensitet över 5 min normaliserades med användning av enzymfria och DMSO-behandlade kontrollbrunnar på varje platta.

TR-FRET Lanthascreen Eu-Kinasbindningsanalys för CDK9 / cyclin K köptes från ThermoFisher och utfördes enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat, 4 occyl av en master mix innehållande 4 nM CDK9/cyklin K (Invitrogen #PV4335), 2 nM Biotin Anti-His Ab, 2 nM Eu-Streptavidin, och 10 nM Kinas Tracer 236 lösning i 1x Kinas buffert dispenserades i Greiner 1,536-väl vita medium bindande plattor med användning av en BioRAPTR FRD arbetsstation. Tjugotre nl av förening och kontroller (DMSO och LY2857785 vid en slutlig koncentration av 6 occurm) levererades omedelbart till analysplattorna via stiftverktygsöverföring. Plattorna tilläts inkubera i 1 h vid rumstemperatur, och tr-FRET fluorescens mättes därefter med en PerkinElmer EnVision multilabel plate reader (Ex: 317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; fördröjningstid 100 occurs; Integrationstid 200 occurs).

Laktatproduktionsanalys

HEK293T-celler odlades enligt beskrivningen ovan. Celler sköljdes med PBS, trypsinerade och resuspenderade i fenolröd fri DMEM (Life Technologies) utan tillskott. Celler pläterades omedelbart till 1536-brunns svarta klara bottenplattor (Corning) vid 250-celler per brunn i 4-millimetervolym. Förening eller fordonskontroll tillsattes till brunnar via stiftverktygsöverföring och celler inkuberades vid 37 kg C under 1 h. två kg av laktatreaktionsblandning (Biovision K607-100) tillsattes till varje brunn och plattor täcktes och inkuberades vid rumstemperatur i 30 minuter. Fluorescens mättes med användning av en ViewLux microplate imager utrustad med Ex / Em 528/598 nm filter.

aldefluoranalys

för initial bestämning av 86B-märkt aldh1a1-aktivitet transfekterades celler med användning av en omvänd transfektionsprocedur, där 1 mL komplex (6 kg Lipofektamin 2000 och 3 kg DNA) kombinerades med 1 mL ln18-cellsuspension (5 kg 105/mL) och 100 kg/brunn av blandning dispenserades i svarta, klara botten 96-brunnsplattor (Corning). Efter 24 h avlägsnades media och ersattes med 100 oc/brunn av Aldefluorbuffert (STEMCELL Technologies) innehållande BAAA-substrat och Hoechst 33342 (Termofiskare, slutliga koncentrationer av 500 nM respektive 0,5 nM). Därefter tillsattes DMSO eller deab för fordon (slutlig 1 kg) och plattorna inkuberades i 30 minuter vid 37 kg för att möjliggöra omvandling av BAAA till BAA. Celler tvättades och 100 oc/brunn av aldefluorbuffert dispenserades före avbildning på en in Cell 2200 (GE Healthcare). För analyser med hög genomströmning transfekterades ln18-celler i T75-kolvar med användning av en omvänd transfektionsprocedur som beskrivits ovan för HEK293T CETSA-analyser med hög genomströmning. Efter 16 h skördades och pläterades celler (1000 celler/brunn / 5 kg) i svart, optisk kvalitet klar botten, TC behandlade 1536-brunnsplattor (Aurora-mikroplattor) med användning av en Multidrop-kombidispenser och inkuberades över natten vid 37 kg C. aldefluoranalysen med högt innehåll utfördes därefter på transfekterade ln18-celler eller otransfekterade OV-90 som tidigare beskrivts31. Bilder analyserades med hjälp av In Cell Investigator v1.6. 2 analysprogramvara ’ s canned multi-Target Analysalgoritm (GE Healthcare) som beskrivs.

Membranvärmeintegritetsanalys

30 000 hek293t-celler framställdes i 30 cetsa-buffert med 1x proteashämmare cocktail (ThermoFisher) kompletterat med 0,5% DMSO (1,5% DMSO totalt). För DMSO-toleransexperimentet tillsattes DMSO till DPBS vid 0, 1, 2 eller 3%. Cellsuspensioner upphettades i 3,5 min vid 42 till 74 CCB, med användning av 4 graders intervall, avlägsnades sedan till ett aluminiumblock på våt is. Cellsuspensioner blandades med lika delar Trypanblå (LONZA) (=0,2% trypanblå) och räknades omedelbart med användning av en C-chip hemocytometer (iNCyto, Korea). Trypan positiv (permeabiliserad) och negativ (intakt) räknades, med n = 2 vid varje temperatur. För ytterligare cellinjer bereddes en miljon celler i 100 ukyl fenolröd fri DMEM innehållande 1% DMSO. Celler upphettades för 3 min över 42 till 90 CCG med 4 graders intervall och avlägsnades sedan till ett aluminiumblock på våt is. Membranintegritet bedömdes som beskrivits ovan.

PAMPA

den omrörande dubbla diskbänken PAMPA-metoden patenterad av pION Inc. (Billerica, MA) användes för att mäta föreningens permeabilitet som tidigare beskrivts38. Föreningar späddes i donator-och acceptorlösningar buffrade till pH7.4 och DMSO-koncentrationen var 0.5%. Permeabilitetsberäkningar utfördes med användning av Pion Inc. programvara.

qHTS-analys

Data från varje analys normaliserades plattvis till motsvarande kontroller som beskrivits tidigare 39. Samma kontroller användes också för beräkning av Z-faktorn för varje analys. Procent aktivitet härleddes med hjälp av intern programvara (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Alla koncentrationsresponskurvor monterades och AC50 beräknades med GraphPad Prism-programvaran; kurvor klassificerades som tidigare beskrivna27. Area under kurvan (AUC) beräknades med hjälp av trapetsregeln för att approximera området mellan svarskurvan och x-axeln över koncentrationsområdet. Ekvivalenta koncentrationsområden användes för alla föreningar inom ett experiment. Effekt cutoff på 3 msk från medelvärdet (av fordonskontroll) användes för att klassificera aktiva föreningar.