Abstract
karbendazim, som fungicid, användes ofta för att kontrollera svampsjukdomar i jordbruk, skogsbruk och veterinärmedicinska läkemedel. I denna studie bedömdes karbendazims akuta och reproduktiva toxicitet med Caenorhabditis elegans (C. elegans) som modell för att preliminärt utvärdera de potentiella riskerna med denna fungicid i jordbruksproduktion och applicering. Resultaten visade att tillväxten av C. elegans hämmades av 0,01 occurg/L karbendazim. Behandlingen av 0,1 Kg / L karbendazim orsakade en signifikant minskning av rörelsebeteendet och betydande skador på reproduktions-och antioxidantsystemet, vilket ledde till att nematodernas livslängd förkortades drastiskt. Dessa resultat ger en bättre förståelse för karbendazims miljörisk och ger upphov till nya farhågor om säkerhet.
1. Introduktion
bekämpningsmedel, ett slags kemiska eller biologiska reagens, används ofta i jordbruket för att reglera växttillväxt och kontrollsjukdomar och insektskadegörare, vilket kan främja grödans tillväxt och förbättra avkastningen . Den utbredda användningen av bekämpningsmedel kommer dock att leda till olika grader av rester i grödor eller livsmedel och därmed påverka människors hälsa . Problemen med bekämpningsmedelsrester har inte bara väckt stor uppmärksamhet hos konsumenterna utan också blivit en av de viktigaste faktorerna som påverkar livsmedelssäkerheten .
karbendazim, som ett bredspektrum fungicid, har använts för att bekämpa svampsjukdomar inom jordbruk, skogsbruk och veterinärmedicinska läkemedel . Karbendazim kategoriseras emellertid i den farliga kategorin Kemikalier av Världshälsoorganisationen och har klassificerats i prioriteringslistan över hormonstörande kemikalier av Europeiska kommissionen . Under de senaste åren är det uppenbart att den utbredda användningen av karbendazim med över räckvidd och överdosering och det faktum att karbendazim är svårt att brytas ned båda leder till problemet med karbendazimrester i jordbruket . Även om den toxiska effekten av karbendazim har rapporterats sedan 1980-talet, blir toxiciteten hos karbendazim ett hett ämne på grund av den ökande oro för miljömässiga endokrina störningar . Karbendazim har förbjudits i flera länder på grund av dess negativa effekter på miljö och hälsa, såsom utveckling och reproduktionsstörningar, toxicitet och mutagenicitet . De negativa effekterna av karbendazim på de biokemiska, histopatologiska och hematologiska parametrarna i lever, njure och endokrina körtlar och deras hormonella nivåer har illustrerats hos råttor . Dessutom behöver den ytterligare studier om låg koncentration på grund av rester av karbendazim.
Caenorhabditis elegans (C. elegans), som en viktig forskningsmodell, används ofta för att göra en viss bedömning. Enligt Amrit et al. , C. elegans har många fördelar, såsom liten storlek, snabb generationstid, lätt att odla på laboratorium och kort vuxen livslängd. C. elegans valdes i denna studie som modellorganism för att utvärdera toxiciteten hos låg koncentration av karbendazim, vilket kan betraktas som ett referensvärde för tillämpningen av karbendazim i jordbruket.
2. Material och metoder
2.1. Kemikalier och stammar
karbendazim (renhet 29%; Aladdin 99%; Biochemical Technology Co., LTD, Shanghai, Kina) löstes i N, N-dimetylformamid (DMF; Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD, Shanghai, Kina) för att producera 1 g/L carbendazim ursprungliga lösningen. Koncentrationerna av DMF var 0,1% i Slutliga exponeringslösningar (0.01, 0.1, 1, 10, 100 osk/l). 0,1% DMF utan karbendazim var kontrollgruppen. C. elegans (vildtyp N2) erhölls ursprungligen från Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, MN, USA). Nematoderna odlades på NGM-plattor (nematod growth medium) som såddes med Escherichia coli OP50 vid 20 kcal C såsom beskrivits . L1-larv C. elegans uppsamlades genom att tvätta de gravida nematoderna med en blekningsblandning (1 M NaOH, 10% NaHOCl).
2.2. Dödlighet
carbendazim ursprungliga lösningar (1 g / L) späddes med S flytande medium (1,12 g K2HPO4, 5,92 g KH2PO4 och 5,85 g NaCl späddes med 1 L vatten) för att få de slutliga karbendazimkoncentrationerna av 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, och 1 mg / L, som innehöll 0,1% DMF. S flytande medium med 0,1% DMF var kontrollgruppen. 30 nematoder (L4) testades i 96-brunnsplattor för varje koncentration. Överlevnaden av nematoder räknades under ett mikroskop efter odling i 24 timmar i inkubatorn. Processen för testet är baserat på metoden för Xiang et al. . Tre parallella experiment behövdes.
2.3. Locomotion Behavior
minst 10 C. elegans (L4) plockades slumpmässigt från varje koncentration för att bestämma lokomotivbeteendet, vilket registrerades av både huvud-thrash-frekvensen och kroppsböjningstiderna . Antalet Huvud-thrash frekvens räknades av förändringar i böjningsriktningen vid mitten av C. elegans i 1 min. Mätning av kroppsböjning definierades som tiderna för riktningsförändringarna av den del av nematoderna som odlades i NGM utan E. coli OP50 på 30 s.
2.4. Tillväxt-och Utvecklingsanalyser
C. elegans exponerad för karbendazim för 24 h analyserades. Kroppslängden för nematoder utsatta för karbendazim bedömdes av Image J-programvaran. Avkomman till varje C. elegans från L4-larver till dag 1 registrerades i L3-scenen efter att ha överförts individuellt till en ny platta varje dag tills reproduktionen upphörde . Minst tre parallella tester utfördes.
2,5. Livslängdsanalys
alla C. elegans som testades för livslängd odlades i samma skick vid 20 kcal C. Den synkroniserade C. elegans odlades i NGM-plattor med olika koncentrationer av karbendazim fram till dag 4. De testade nematoderna skulle sedan överföras till nya NGM-plattor var 2: e dag. Överlevande och döda C. elegans registrerades dagligen (från och med den första vuxendagen) tills alla nematoder för varje koncentration hade dött . Minst tre parallella tester utfördes.
2.6. Bestämning av oxidativ skada
intracellulär ROS mättes med 2′,7′-diklordihydrofluorosceindiacetat (H2DCFH-DA), som är den överlägset vanligaste och känsliga reaktiva syredetekteringssonden. Vildtypen N2 C. elegans tvättades i M9-buffert och stördes sedan ultraljud. Supernatanten analyserades ROS-nivån enligt instruktionen av ROS-satsen. Den slutliga arbetskoncentrationen av H2DCHE-DA var 10 kcal . Excitations-och emissionsabsorbansvåglängderna var 485 nm respektive 535 nm. Minst tre parallella tester utfördes.
intracellulärt totalt superoxiddismutas (t-SOD) bestämdes enligt instruktionen från t-SOD-kit köpt från Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Efter att ha tvättats med M9 tre gånger stördes de undersökta nematoderna ultraljud och reagerade med ett t-SOD-kit. Absorbansvåglängden var 550 nm. Dessutom användes supernatanten för att detektera nivån av protein för varje koncentration, i vilken absorbansvåglängden var 595 nm. Minst tre parallella tester utfördes.
2.7. Dataanalys
Alla data gavs som genomsnittlig standardfel i medelvärdet (sem) med hjälp av envägs ANOVA. Grafer presenterades med Origin 8.5 och GraphPad Primer 7, och statistisk analys utfördes med hjälp av SPSS 19.0-programvaran. Den statistiska signifikansnivån utfördes med användning av och .
3. Resultat
3.1. Bestämning av Rörelsebeteendet hos C. elegans after Carbendazim Acute Exposures
LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans efter karbendazim akuta exponeringar genom att analysera data om Huvud-thrash frekvens och kroppsböjningstider för nematoder (figurerna 1(A) och 1(b)). Båda uppvisade signifikanta minskningar vid karbendazimkoncentrationerna från 0,01 kg/L till 100 kg/L (). Dessutom minskade huvudet thrashes av nematoder exponerade för 100 occurg/L till 68,27%. För kroppsböjningstestet, när karbendazimkoncentrationerna var 10 kg/L och 100 kg/L, hade den en signifikant hämmande effekt på kroppsböjningarna hos C. elegans med 36,77% respektive 35,48% jämfört med kontrollen.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Bestämning av tillväxt och utveckling av C. elegans efter karbendazim akuta exponeringar
jämfört med kontrollgruppen (figurerna 1(C) och 1(d)), kroppslängd och kroppsyta reducerades signifikant () i exponeringsgrupperna från 0, 01 Kg/L till 100 kg/L. Båda minskade med 19, 16% och 22, 15% vid behandling av 0, 01 kg/l jämfört med kontrollgruppen. Koncentrationen av 10 oc / l presenterade de mest negativa effekterna, och kroppslängd och kroppsyta av C. elegans minskade med 35,21% respektive 65,22% jämfört med kontrollgruppen.
3.3. Bestämning av kull storlekar av C. elegans efter karbendazim akuta exponeringar
enligt Figur 2, kull storlekar av nematoder hade en signifikant minskning () i behandlingsgrupperna från 0,1 oc/l till 100 oc/L. kull storlekar av C. elegans minskade mest signifikant, vilket minskade till 43,71% vid behandling av 10 oc/l jämfört med kontrollgruppen.
3.4. Bestämning av livslängden för C. elegans efter karbendazim akuta exponeringar
C. elegans livslängd hämmades signifikant av 0,01 kg/L till 100 kg/L karbendazim enligt livslängdskurvan som visas i Figur 3. Resultaten visade att C. elegans livslängd minskade från 24 till 20 dagar med behandling av 0,01 occurg/L karbendazim. Livslängden för nematoder behandlade med 0,01 kg/l karbendazim reducerades med 20,00%. När exponeringskoncentrationen för karbendazim var 100 kg/l minskade livslängden för C. elegans mest med 45,83%.
3.5. Effekter av akut exponering för karbendazim på antioxidantsystemet hos C. elegans
ROS – nivåerna för kontroll och behandlad C. elegans vid karbendazimexponering av olika koncentrationer visas i Figur 4(A). Det indikerades att nivån av intracellulär ROS ökades signifikant () vid intervall från 0,01 kg/L till 100 kg/l karbendazim. Jämfört med kontrollnivån ökades ROS-nivån högst med 70,60% vid behandling av 10 kg/L. enligt resultaten av intracellulära SOD-nivåer hade den en ökning vid behandlingen från 0.01 Kg/L till 100 kg/l karbendazim (Figur 4 b). SOD-nivån ökades med 10,70% vid 0,1 occurg/L karbendazim jämfört med kontrollgruppen.
(a)
(b)
(a)
(b)
4. Diskussion
karbendazim, som fungicider, används ofta i jordbruket för att hämma tillväxten av svamp. Karbendazim har förbjudits att använda i Australien, större delen av Europeiska unionen och USA på grund av dess allvarliga toxikologi och ihållande natur . För denna studie var det första gången att använda C. elegans som modellorganismer för att utvärdera effekterna av karbendazim på lokomotivbeteende, tillväxt och utveckling, reproduktion, livslängd och antioxidantsystem. Dessutom visade resultaten att det hade ett negativt inflytande på C. elegans.
enligt 24 h-LC50 är den akuta toxicitetskoncentrationen av C. elegans utsatt för olika koncentrationer av karbendazim 0, 867 mg/L. 96-h LC50 av karbendazim som svar på zebrafisk har illustrerats som 1, 75 mg/L . Äggen av preussisk karp Carassius gibelio har visat toxicitetseffekterna vid en koncentration av 0, 036 mg/L . Studier visade att tillväxten och utvecklingen av Navicula sp. hämmas av karbendazim med ett 24 h-EC50-värde på 2,18 mg/L. även om algtillväxthastigheten återvinns efter 72-timmars exponering, förblir klorofyll-a-innehållet signifikant minskat när behandlingen av karbendazim var över 0,5 mg/L . I detta närvarande valdes C. elegans utsatt för en låg koncentration av karbendazim för att utvärdera dess effekter beroende på den faktiska koncentrationen av human daglig exponering. Låga koncentrationer av karbendazim betyder inte att det är säkert. Karbendazim visar negativa biologiska effekter vid mycket lägre doser i vissa studier.
Lokomotivbeteende utvärderades för att bedöma neurotoxiciteten hos C. elegans (L4 larva) efter 24-timmars exponering för karbendazim. Resultaten visade att carbendazim kunde ha negativa effekter på lokomotivbeteende genom detektering av huvudkrossning och kroppsböjning av C. elegans, som båda var känsligare vid den högre exponeringsgruppen. Lokomotivbeteendet hos zebrafiskembryon utsatta för karbendazim är känsligt . Tidigare studier har visat att fisk har ett onormalt beteende när subletala koncentrationer av karbendazim är 0,22–0,43 mg/L .
utvecklingsmissbildningar kan också vara en orsak till onormal rörelse . Tillväxten och utvecklingen av C. elegans analyserades i vår studie. Resultaten visade att kroppslängden och kroppsområdet för C. elegans var signifikant inskränkt vid behandlingen som översteg 0,01 kg/l karbendazim. Den normala tillväxten av ryggradsdjur är relaterad till den metaboliska sköldkörtelhormonhomeostasen . Williams et al. har indikerat att karbendazim kan orsaka spermierförlust efter implantation, fostermissbildning och långsam tillväxt och utveckling.
reproduktionstoxiciteten hos karbendazim har visats att karbendazim kan hämma mikrotubulpolymerisationen av svamp-och däggdjursceller, vilket orsakar störning av mikrotubulaggregatet genom att verka med Bisexuell tubulin, vilket resulterar i försämrad segregering av kromosomer i processen för celldelning . Bildandet av mikrotubuli genom icke-kovalenta bindningar av XXL-och XXL-tubulin är ansvarig för kromosomsegregering i processen med mitos och meios . Broodstorleken på C. elegans minskar signifikant vid 0,1 Kg/L karbendazimkoncentration. Karbendazim har visat sig påverka reproduktionssystemen i japanska vaktlar och hamstrar . Slutsatsen var att C. elegans livslängd avsevärt minskade med karbendazim koncentration av ≥0.01 µg/L baserat på vår studie. Studier har visat att karbendazim har lett till infertilitet och utvecklingstoxicitet och manifesterar embryotoxicitet, bakteriecellapoptos och teratogenes hos olika däggdjursarter .
Apoptos är en komplex programmerad celldöd, vilket är ett högt reglerat fenomen som kännetecknas av en serie cellulära processer . Många studier har presenterat att produktionen av ROS inducerad av oxidativ stress är relaterad till apoptotisk celldöd . Vår studie fann att karbendazim kunde inducera en signifikant ökning av ROS-värdena och en liten ökning av SOD-värdena. Oxidativ stress orsakad av miljöföroreningar inducerar det ökade uttrycket av ROS och skadar därefter antioxidantförsvaret . SOD är ansvarig för avgiftning av giftiga fria radikaler och deras aktiviteter, som används för att utvärdera oxidativ stressnivå och cellulär antioxidantstatus . Metalloenzym SOD accelererar omvandlingen av endogena cytotoxiska superoxidradikaler till H2O2, och ökningen av SOD-uttrycksnivåer kan bidra till att förbättra enzymaktiviteterna för att eliminera de superoxidradikaler som induceras av karbendazim och för att förhindra förekomsten av cellulär dysfunktion vid exponering av karbendazim . Högre exponeringskoncentrationer av karbendazim kan orsaka allvarlig oxidativ stress, som därefter förstör balansen mellan cellhomeostas och främjar apoptos . Karbendazim i låga koncentrationer kan emellertid fortfarande väsentligt skada reproduktionssystemet enligt våra resultat.
5. Slutsats
så vitt vi vet utvärderade den aktuella studien säkerheten för karbendazim exponerad för C. elegans för första gången. Det visade att carbendazim kan ha en skadlig effekt på lokomotivets beteende, utveckling och tillväxt, reproduktion, livslängd och antioxidantsystem av C. elegans. Hoppas att det måste ägna mer uppmärksamhet åt tillämpningen av karbendazim baserat på resultaten. Dessutom måste säkerheten för karbendazim för användning utvärderas ytterligare, särskilt bioackumuleringstoxiciteten och potentiella genotoxiska effekter.
datatillgänglighet
Alla data som genereras eller analyseras under denna studie ingår i den här artikeln.
intressekonflikter
författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
bekräftelser
denna forskning stöddes av National Natural Science Foundation of China (31501569).
