detta är den första i en tredelad serie om omvandlingen av E. coli. I slutet av detta bör du vara expert på E. coli-transformation och på vilka stammar du ska välja för olika applikationer. Om du redan är expert hoppas jag att det blir en trevlig uppdatering för dig. I båda fallen, kommentera nedan om du har något att lägga till.

använda elektricitet för Transformation

främmande DNA kan införas i Kompetent E. coli med elektroporation eller kemisk transformation. När du använder elektroporation applicerar du en elektrisk ström över cellen. Strömmen tros skapa momentana” porer ” i cellmembranen, vilket tvingar det negativt laddade DNA in i cellerna genom en elektrofores-typ effekt. För att göra elektrokompetent E. coli, tvätta cellerna noggrant för att avlägsna alla mediumsalter. Detta säkerställer att laddningen inte utförs genom mediet. Utför också elektroporationen vid 0 msk C för att minimera värmeskador på cellerna.

kemikalier: de arbetar också

för att göra kemiskt kompetenta celler, resuspendera E. coli i en CaCl2-lösning vid 0 kg C. Under dessa förhållanden tros Ca2 + – Jonen skapa porer i membranet, hjälpa till att binda DNA till cellmembranet och maskera den negativa laddningen på DNA. Tillsammans underlättar dessa passagen av DNA genom det hydrofoba cellmembranet. Tvinga DNA: t in i cellerna genom att applicera en kort 42 C-värmechock, vilket resulterar i en termisk ström som sveper DNA: t in i cellerna.

fördelarna och nackdelarna med varje

elektroporation är mindre besvärlig än kemisk transformation och ger i allmänhet högre transformationseffektivitet (mätt i kolonier bildade Per mikrogram DNA). Det är dock dyrare. Det kräver en specialiserad apparat för att leverera laddningen och kyvetterna för att överföra laddningen till cellsuspensionen. Elektroporation är känslig för salt-du kan förlora värdefulla prover om överskott av salt överförs till kyvetten.

personligen föredrar jag kemisk transformation. Även om det tar ungefär en halvtimme längre, finner jag att resultaten är mer förutsägbara och jag gillar det faktum att en större volym DNA kan tillsättas om koncentrationen är för låg. Du kan inte öka volymen av DNA med elektroporation på grund av risken att tillsätta för mycket salt till lösningen. Även om den allmänt citerade nackdelen med kemisk omvandling är dess lägre effektivitet, kan du nu köpa ultrakompetenta celler, såsom Stratagenes XL10-gold, så det här är inte längre så mycket av ett problem.

artiklar i denna serie:

• E. coli Electroporation vs kemisk Transformation (denna artikel)
• Kompetent E. coli: att köpa eller inte köpa?
• välja en kompetent E. coli-stam

ursprungligen publicerad den 18 September 2007. Reviderad och uppdaterad den 11 juli 2016.