bidragit med Paul Barber
DNA-extraktion via Chelex
Chelex är ökänd för att vara så ombytlig som det är billigt och enkelt. Här är några tips för bra förstärkningar: 1. Ibland provfungerar bäst om de används omedelbart, ibland är det bättre att vänta över natten innan du använder dem. Experimentera och hitta vad som fungerar för din Art. Resultaten kan variera med taxa.2. När du gör initiala PCR, gör en seriell utspädning av Mall.Mängden Chelex-DNA-extraktion som används i en PCR kan vara så hög som hälften av PCR-volymen eller så låg som 1 mikroliter av en 1:10 000 utspädning. Jag tycker att 1 mikroliter av en 1: 1 är bra för de flesta applikationer.3. Om du inte får förstärkningar från din PCR första gången med ett Chelex-extrakt, upprepa vortex, spin, incubate, vortex, spin, sit overnight-proceduren som beskrivs ovan. Ofta kommer detta att göra ett negativt PCR-arbete.
metod ~ ~ pos = headcomp
- med blekmedel, sterilisera en torr reagensspatel och en liten magnetisk omrörare.
- Förbered en 5-10 viktprocent uppslamning av Chelex100 harts (biorad del 143- 3832,100-200 mesh Chelex, natrium form) och UV steriliserad HPLC vatten. Det mest effektiva sättet att göra detta är att ta ett 50 ml sterilt falkrör, placera in på en skala inuti en liten bägare och noll skalan. Tillsätt sedan 5 gram Chelex och fyll till 50 ml mark med vatten.
Precision är inte kritisk. Steril teknik är.
- placera steril omrörare i röret och placera på magnetisk omrörare. Chelex sätter sig snabbt, så om slammet inte är väl blandat kommer dina koncentrationer och resultat att vara varierande. Håll uppslamningen väl blandad, alikvot 300 – 500micro liter i 0,6 eller 1,6 ml eppendorf rör (igen, steril) och locket omedelbart. Om du har tillgång till en laminär flödeshuvud är det ett bra ställe att göra allt detta. Du kanske vill torka av skalan och omröraren med en 10% blekmedel och/eller UV-sterilisera före användning.
- slå på värmeblocket. Ställ in på 95 msk C. fyll hål med vatten.
- använd sterila pincett (Flamma över alkoholbrännare flera gånger för att sterilisera), ta bort en liten bit vävnad från ditt prov. Denna bit vävnad bör vara tillräckligt stor för att vara synlig, men inte så stor att den är lätt synlig. Tänk dig att klippa en 0,2 mm sektion av en standardklammer. Det här är mycket stort. För mycket vävnad kan hämma dina reaktioner.
sterilisera pincett mellan prover.
- när du är klar, gör en negativ Chelex-kontroll genom att doppa dina steriliserade tångar i ett rör av Chelex-uppslamning.
- Virvelprov och chelex-uppslamning i 10-15 sekunder.
se till att locken är ordentligt fastsatta innan de börjar.
- snurra prover kort med hög hastighet i en mikrocentrifug
- inkubera prover i 20 minuter vid 95 kg c
*blocktemperaturen kan sjunka något när du gör detta steg. Denna droppe är normal. Kontrollera rören medan du inkuberar för att säkerställa att locken inte har lossnat.*
- Virvelprover igen i 10-15 sekunder.
var försiktig eftersom ånga kan tappa locket från centrifugröret. Håll locken nere.
- snurra rören igen med hög hastighet i mikrocentrifug.
- prover är redo att användas.
använd endast supernate för PCR-reaktioner. Chlex pärla kommer att inaktivera Taq!
denna metod är baserad, med tillstånd, på ett originalprotokoll tillgängligt här.
