systemisk agonistisk cancerimmunterapi inducerar differentiell expansion av CD4-och CD8-T-lymfocyter i lymfoida och perifera organ

kombination av anti-CD40 med IL-2 har visat sig inducera fördröjd tillväxt och regression över flera murina tumörmodeller . I likhet med publicerade data med cellinjetumörmodeller ledde behandling av den intraepiteliala neoplasi-outgrowth-modellen (min-O), en vävnadstransplantationslinje, med anti-CD40 och IL-2 immunterapi (IT) till signifikanta antitumörsvar (P = 0,0057) inklusive regression i >50% av de behandlade mössen (ytterligare fil 1: figur S1A). Tidigare studier har visat att dessa antitumörsvar beror på CD8 T-celler, därför bedömde vi t-cellfenotyp i mjälten såväl som i tumören och lungorna (en vanlig metastatisk plats för många olika tumörmodeller). Medan vi noterade terapi generellt inducerad CD8-expansion över alla organ, noterade vi vissa skillnader i CD8 T-cellminnefenotyp över organställen (ytterligare fil 1: figur S1B-C).

Vi och andra har tidigare visat att starka immunstimulerande terapier för cancer inducerar potent proliferation av minne (CD44high) CD4-och CD8-T-celler i mjälten och lymfkörtlarna . Det observerades också att CD4, men inte CD8, T-celler också genomgår aktiveringsinducerad celldöd på ett interferon (IFN) – beroende sätt som resulterar i obetydlig Total expansion av CD4 T-celler med siffror i samma organ jämfört med baslinjen . Dessa data genererades med hjälp av lymfoida organavläsningar. I ljuset av fenotyper som observerats i min-O-lagret kan immunterapibehandlade möss, expansion, aktivering och apoptos av aktiverade T-celler påverkas differentiellt i perifera vävnader. Därför försökte vi ytterligare karakterisera och jämföra T-cellaktivering i perifera organ (där den primära tumören och/eller metastatiska lesionerna kan finnas) och sekundära lymfoida organ (som ofta undersöks under immunterapeutiska studier för att bedöma verkningsmekanismer). Vi utvärderade CD8 och CD4 T-cell (Foxp3neg) frekvens, expansion och apoptos systemiskt i både lymfoida och perifera organ. Överensstämmer med tidigare rapporter från vår grupp, men ändrar inte signifikant deras totala frekvens (Fig. 1A), Anti-CD40/IL-2 immunterapi resulterade i signifikant expansion i det totala antalet CD8 T-celler i mjälten och lymfkörtlarna (Fig. 1b). I linje med ökningar i totala CD8-tal utvidgades frekvensen av CD8-T-celler som införlivade bromodeoxyuridin (BrdU) in vivo signifikant och andelen apoptotiska celler som bedömdes med extracellulärt Annexin V-uttryck skilde sig inte signifikant från kontroller (Fig C-D). Däremot minskade den totala CD4 T-cellfrekvensen och antalet förändrades inte signifikant jämfört med kontroller inom samma organ (Fig. 1a-b). Medan CD4 T-celler expanderade enligt bedömning av BrdU-inkorporering, gick en betydande del av dem också igenom apoptos (Fig. 1c-d) vilket resulterar i en netto obetydlig förändring av det totala antalet. Dessa data var i linje med vad som tidigare observerats . När vi bedömde icke-lymfoida organ inklusive lungor och lever såg vi liknande trender i både CD4-och CD8-T-celler, nämligen att CD8-T-celler expanderade och överlevde över alla organ som följde det (Fig. 2A-b) medan CD4 T-celler (Foxp3neg) expanderade och samtidigt gick igenom apoptos i liknande utsträckning vilket resulterade i obetydliga förändringar i både deras frekvenser och siffror (Fig. 2c-d) i periferin.

t-cellminnefenotyper varierar mellan sekundära lymfoida organ och perifera icke-lymfoida vävnader i CD8-T-celler men inte CD4-T-celler som följer den

i möss kan CD4-och CD8-T-celler kategoriseras ytterligare i minne och Na-gärna fenotyper baserade på CD62L (L-selectin) och CD44-uttryck med cd44lowcd62l+ – populationen betraktad som na-62l (tn), cd44highcd62l+ – populationen betraktad som centralminne (TCM) och cd44highcd62lneg-populationen betraktad som effektor och/eller effektorminne (te/em). Det är känt att CD4-och CD8-T-celler skiljer sig åt i deras fördelning av dessa delmängder i lymfoida och perifera organ. Medan na-frekvenser inom CD4-och CD8-populationer förblir relativt lika, är CD44high-populationen mer centralt minne skevt i CD8 – T-celler och effektorminne skevt i CD4-T-celler i en vilande organism . I de perifera organen är emellertid vävnadsboende T-celler inom både CD4-och CD8-T-cellundergrupperna övervägande av effektorns minnesfenotyp .

tidigare studier har visat att minnesfenotypceller (CD44high) är den huvudsakliga celltypen som expanderar efter stimulerande immunterapier . För att bättre förstå sammansättningen av CD4-och CD8-T-celler över olika organ utvärderade vi deras minnesfenotypstatus i varje organ som följde det. I vila var CD44high-populationen av CD8 T-celler i lymfoidorganen övervägande TCM (>90%) medan det i perifera organ var en kombination med ~60% TCM (Fig. 3a, c, e, – f). I allmänhet resulterar det i en total expansion I Cd44hög frekvens över alla organ. TCM-frekvenserna var antingen oförändrade eller något ökade, medan te/EM-populationerna expanderade signifikant (Fig. 3e-f) från ~10% till 30% i lymfoida organ och, imponerande, från ~30-85% i perifera organ.

inom CD44high populationen av CD4 T-celler, vilande möss var mer kraftigt skev mot te/EM fenotyp med cirka 60-70% i lymfoid och 75-95% i perifera vävnader (Fig. 3b, d). Som inträffade i CD8 T-celler, efter det cd44high andel expanderat men på grund av det faktum att det var så kraftigt skev till te/EM fenotyp över alla organ i vilande möss, frekvenserna av CD4 TE/EM var i stort sett konsekvent över alla organ i IT-behandlade möss (Fig. 3e). TCM CD4-frekvenserna förblev relativt låga och konsekventa över alla organ, både före och efter IT (Fig. 3f).

uttryck av aktiveringsmarkörer i CD4-och CD8-T-celler är beroende av plats och minne fenotyp

förutom skillnader i proliferation och apoptos har vi också rutinmässigt märkt att CD4-och CD8-T-celler differentiellt uppreglerar aktivering och hämmande molekyler som följer den. Det mest anmärkningsvärda exemplet på detta är PD-1 som, baserat på studier som fokuserade på sekundära lymfoida organ (mjälte och LN), företrädesvis uppreglerades på CD4 och inte CD8 T-celler och trodde sannolikt vara involverade i den förmånliga AICD-processen som inträffade i CD4 men inte CD8 T-celler som följde den . Ett annat exempel skulle vara den förmånliga uppregleringen av NKG2D på CD8 T-celler men inte CD4 som ger åskådare-inducerad lytisk förmåga efter stark cytokinexponering för minne CD8-delmängden. Tidigare studier av vårt laboratorium samt data som presenteras i Fig. 3 har visat att bland både CD4-och CD8-T-celler är de primära cellerna som aktivt prolifererar och svarar på det CD44high memory fenotypceller . Därför fokuserade vi nästa på denna befolkning.

i CD44high-populationen har det visat sig att de prolifererande CD8-T-cellerna misslyckas med att uppreglera markörer som överensstämmer med aktivering av en antigenspecifik stimulans såsom CD25 och PD-1, men ändå uppreglera markörer som tillåter dem att förvärva en åskådare fenotyp, nämligen NKG2D, vilket ger förmågan att agera mer på ett NK-liknande, antigen obegränsat sätt. Omvänt, CD44high, prolifererande (Foxp3neg) CD4 T-celler oproportionerligt uppreglera PD-1 (i motsats till CD8 T-celler och Foxp3+, regulatoriska CD4 T-celler) som vi har föreslagit tillåter dem att företrädesvis riktas mot induktion av apoptos . I överensstämmelse med dessa tidigare rapporter observerade vi liknande fenotyper bland mjält-och lymfkörtelboende, IT-behandlade CD44highCD8+ T-celler, vilket signifikant uppreglerade NKG2D men inte PD-1 (Fig. 4A, c) och CD44highCD4+ T-celler, som kraftigt uppreglerade PD-1, men inte NKG2D (Fig. 4b, d). När vi bedömde samma fenotypiska markörer i t-cellpopulationerna bosatta i perifera, icke-lymfoida organ, CD44highCD8+ t-cellfenotypen skilde sig avsevärt från de som var bosatta i de sekundära lymfoida organen. Medan CD44highCD8 + T-celler bosatta i lungorna och levern fortfarande var NKG2D+CD25neg (Fig. 4A, c), frekvensen av NKG2D+ – celler i denna population verkade öka från 20-30% i lymfoida organ till 40-50% i perifera organ (Fig. 4a). Dessutom, i motsats till lymfoida organ där PD-1-uttryck var oförändrat, ökade PD-1-uttryck signifikant i både lungorna och levern efter det i CD44highCD8+ – populationen (Fig. 4c). Omvänt var cd44highcd4 t-cellfenotyp anmärkningsvärt lik mjälte och lymfkörtel CD4 T-celler över alla organ (Fig. 4b, d) med jämförbart uttryck av PD-1 och minimal uppreglering av NKG2D. CD25 uppreglerades inte i CD4-eller CD8-T-celler på någon plats (data visas inte). Detta var oväntat eftersom vi tidigare har föreslagit att differentialuttrycket av PD-1 sannolikt var den underliggande mekanismen för differentiell induktion av apoptos mellan CD4 och CD8 T-celler efter starka immunstimulerande it-regimer. Men i de perifera organen fortsätter CD4 T-celler att påverkas oproportionerligt av apoptos trots att PD-1-uttryck är jämförbart mellan CD4-och CD8-T-celler. Detta mönster som framkom var också intressant eftersom det ökade aktiveringsmarköruttrycket i periferin tycktes direkt korrelera med te/EM-övervägande, särskilt i fallet med PD-1.

det har nyligen visats att cirkulerande TE/EM-celler uttrycker förhöjda nivåer av PD-1 hos vilande människor . Därför antog vi att CD8+ TE/EM-celler företrädesvis uttrycker dessa aktiveringsmarkörer över CD8+ TCM vilket resulterar i differentiella frekvenser av CD44highCD8+ T-celler som uttrycker aktiveringsmarkörer i sekundära lymfoida och perifera organ som följer den. Därför utvärderade vi NKG2D-och PD-1-uttryck på CD8 + CD44highCD25neg TE/EM-och TCM-celler över alla organ i vilande och IT-behandlade möss. I kontrollmöss, både NKG2D (Fig. 5a) och PD-1 (Fig. 5C) uttrycktes med en högre frekvens på te / EM-delmängden av CD8 + CD44highCD25-populationen. Den totala frekvensen av te / EM-populationen bland CD8 + T-celler i vilande möss är emellertid relativt låg jämfört med TCM (cirkeldiagram Fig. 5a) är därför övergripande uttrycket för både PD-1 och NKG2D övervägande lågt (Fig. 4) som TCM utgör majoriteten av CD8+ T-celler i vila. I de immunterapibehandlade mössen ökades både NKG2D-och PD-1-uttrycket över alla organ (Fig. 4). Återigen, både NKG2D (Fig. 5b) och PD-1 (Fig. 5D) uttrycktes högre på TE / EM CD8 + T-celler än TCM CD8+ T-celler. I lymfoidorganen, där te/EM-populationen expanderade jämfört med kontroll, var den fortfarande betydligt mindre än CD8+ TCM-celler (cirkeldiagram, Fig. 5b) vilket resulterar i mindre betydande utvidgningar på dessa platser. I motsats till lymfoida organ utgjorde CD8+ TE/EM-celler majoriteten av de perifera organen som analyserades (cirkeldiagram, Fig. 5b) vilket gör det övergripande uttrycket av NKG2D och PD-1 betydligt högre på dessa platser. Återigen är det viktigt att notera att i lymfoidorganen hos immunterapibehandlade möss var det övergripande uttrycket för båda aktiveringsmarkörerna signifikant lägre än i de perifera organen på grund av TCM-skevningen i lymfatikerna över periferin i CD8-populationen. Uttrycksnivåerna varierade inte mycket mellan TE / EM från olika organ (det fanns inga signifikanta skillnader mellan lymfoida och perifera organ) inom samma behandlingsgrupper men ökade generellt i det behandlade jämfört med kontroll, en trend som var mer signifikant uttalad med NKG2D än PD-1 (Fig. 5). Däremot förblev TCM-aktiveringsmarköruttryck relativt konstant inte bara bland organ från möss inom en behandlingsgrupp utan också mellan kontroll-och IT-behandlade grupper (Fig. 5a-b). Sammantaget tyder dessa data på att sammansättningen av minnet/aktiverad pool (TCM vs TE/EM) väger tungt på fenotypen hos den aktiverade T-cellpopulationen, särskilt med CD8 T-celler eftersom deras konstitution varierar mycket mellan lymfoida och icke-lymfoida organ.

bedömning av T-celler från patienter som får högdos systemisk immunstimulerande terapi

nästa ville vi bedöma om dessa resultat översattes till mänskliga patienter som fick immunstimulerande terapier för cancer. Det finns för närvarande inga studier som bedömer kombinationsagonistisk Anti-CD40 med rekombinant human IL-2 men vi har rutinmässigt jämfört vår kombinationsbehandling med andra systemiska immunstimulerande behandlingar inklusive högdos TLR-agonister och högdos systemiska cytokinterapier och visat liknande fenotypiska och funktionella förändringar i T-celler som observeras i vår prekliniska modell . För att bedöma om patienter i kliniken visade liknande förändringar i ytmarköruttryck, samlade vi mononukleära celler i perifert blod (Pbmc) från metastatiska melanompatienter som genomgick systemisk högdos IL-2-behandling. Patienterna fick 6×10^5 IE/Kg var 8: e timme för en planerad totalt 14 doser. Pbmc-prover samlades in en dag före behandlingsstart (baslinjen) eller på dag 8 i den första behandlingscykeln (dag 8) för att bedöma t-cellfenotyp. Jämförelse av baslinje-och dag 8-prover var en signifikant ökning av PD-1+ – minnesfenotyp (CD45RO+) celler i både CD4-och CD8-T-cellundergrupper efter högdos IL-2-terapi (Fig. 6a-c). När denna population ytterligare delades upp i centralt minne (CD62L+) och effektor/effektor minne (CD62L-) vid dag 8 tidpunkt, effektor/effektor minne delmängd uttryckt signifikant högre PD-1 uttryck än det centrala minnet delmängd (Fig. 6d-e). Tillsammans korrelerar dessa data med vad som observerades i murina studier som tyder på att dessa data är tillämpliga på mänskliga studier och kan vara en indikator på vad som sker lokalt.