2. Reglering av Cysteinkatepsinaktivitet

zymogenaktivering är ett av de viktigaste sätten att reglera katepsinaktivitet. Alla katepsinerna syntetiseras nämligen som inaktiva zymogener och aktiveras i den sura miljön i de endolysosomala vesiklarna. Den molekylära mekanismen för deras aktivering var förbryllande under lång tid. Den kritiska informationen kom från kombinationen av strukturella studier av prokathepsiner B, K och L, som visade att propeptiden löper genom det aktiva stället för katepsiner i motsatt riktning av substratet, vilket utesluter klyvningen av propeptiden i molekylen utan enorma och energiskt ogynnsamma strukturella rörelser av propeptiden , varigenom den unimolekylära mekanismen initialt föreslogs och detaljerade kinetiska studier, som tydligt visade att aktiveringen av katepsin B är en bimolekylär process . Den nuvarande modellen, som mestadels baseras på cathepsin B-studierna, antyder att propeptiden i cathepsin zymogen växlar mellan två konformationer, den så kallade ”stängda” och ”öppna.”I den” stängda ” konformationen, gynnad vid neutralt till svagt surt pH, blockerar propeptiden det aktiva stället och förhindrar substrathydrolys, medan propeptiden i den ”öppna” formen gynnas vid surt pH under pH 5,0 avlägsnas från den aktiva sidoklyftan, vilket resulterar i en låg katalytisk aktivitet hos zymogenen. Denna aktivitet är tillräcklig för att aktivera en annan cathepsin zymogen i ett eller flera steg och därigenom starta kedjereaktionen, där sådan fullt aktiv mogen cathepsin B bearbetar majoriteten av zymogenmolekylerna .

de andra stora regulatorerna av cysteinkatepsiner är makromolekylära hämmare som binder till det aktiva stället och därigenom förhindrar associering av peptidas med dess substrat. De tillhör flera olika familjer inklusive cystatinerna, tyropinerna och serpinerna som, förutom serinproteaser, också kan hämma flera katepsiner .

3. Glykosaminoglykaner som Huvudregulatorer för Cysteinkatepsinaktivitet

glykosaminoglykaner (GAGs) är heteropolysackarider som består av upprepande disackaridenheter med hög negativ laddning. Detta är ett resultat av närvaron av flera karboxylgrupper och sulfatsubstitutioner. De flesta GAGs är sulfaterade, inklusive kondroitinsulfater (CS), keratansulfat (KS), dermatansulfat (DS), heparansulfat (HS) och heparin, medan hyaluronan (HA) är den enda icke-sulfaterade GAG. Under de senaste åren har GAGs dykt upp som viktiga regulatorer av cysteinkatepsiner med olika effekter på deras mål. Traditionellt hade cysteinkatepsiner betraktats som lysosomala proteaser och, liksom andra lysosomala enzymer, hade varit kända för att hämmas av intralysosomala GAGs i vilande lysosom . Idag etableras emellertid cysteinkatepsiner som huvudaktörer i extracellulär proteolys . Deras verkan i den glykosaminoglykanrika extracellulära miljön väckte frågor om samspelet mellan cysteinkatepsiner och GAGs utanför lysosomen. De två grupperna av endogena humana cysteinkatepsiner som oftast är associerade med extracellulär proteolys är cathepsin L-liknande proteaser (cathepsins K, L, S och V hos människor) och cathepsin B . Data som samlats under de senaste två decennierna visar att samspelet mellan dessa peptidaser och GAGs går åt båda hållen; cysteinkatepsiner kan klyva proteoglykankärnproteiner och därmed frigöra GAGs från deras stöd, medan GAGs i sin tur påverkar både aktiviteten och stabiliteten hos cysteinkatepsiner i det extracellulära utrymmet.

regleringen av papainliknande cysteinpeptidaser med GAGs beskrevs först för cathepsin L . I dessa tidiga verk fann man att GAGs och olika negativt laddade ytor väsentligt accelererar aktiveringen av cathepsin L zymogen i den mogna formen, inklusive vid pH nära neutralen, såsom också finns i den extracellulära miljön vid olika sjukdomstillstånd. Detta har bekräftats för flera andra cathepsins, den viktigaste är cathepsins B och S, och även för en T. kongolens parasit homolog kongopain, vilket tyder på att GAGs och andra negativt laddade ytor kan spela en viktig roll i extracellulär katepsinaktivering vid sjukdom. Nya fynd med cathepsin S vid hög GAG-koncentration tyder dock på att detta enzym kan bete sig något annorlunda under sådana förhållanden med kondroitin-4-sulfat (C4S) till och med uppvisar en retarderande effekt . Icke desto mindre blev underlättande av autokatalytisk aktivering av katepsiner genom det negativt laddade polysackariddextransulfatet också en rutinmetod vid framställning av rekombinanta katepsiner .

majoriteten av informationen om den molekylära mekanismen för GAG-assisterad cathepsinaktivering kom från en studie av Cagli Ukrainian et al. använda human cathepsin B som modell . Som visat verkar GAGs bidra till bearbetningen på två sätt. Först, vid bindning verkar de omvandla cathepsin zymogen till ett bättre substrat. För det andra gynnar bindning av GAGs uppenbarligen den öppna konformationen av zymogenen, vilket främjar aktivering inte bara vid surt pH utan också vid pH-värden närmare neutralt. Detta verkar vara fallet för de flesta GAGs och beror inte kritiskt på laddningstätheten hos GAGs, eftersom HA också kunde påskynda aktiveringen, men i lägre utsträckning, vilket är ovanligt för en protein-GAG-interaktion. Dessutom var redan en tetrasackarid tillräcklig för en framträdande acceleration av katepsin B-autoaktivering, vilket är väsentligt mindre än vad som hittades för ett antal andra GAG-medierade reaktioner . Interaktionen förmedlas av joniska interaktioner; det verkar emellertid inte finnas någon konserverad GAG-bindande yta på zymogenerna, eftersom helt orelaterade rester i prokathepsiner L och B, som till stor del var belägna på prodomänerna, befanns styra interaktionen .

GAGs andra viktiga roll i regleringen av katepsinaktivitet kom från studierna på papain, familjens arketypiska representant . Detta regleringssätt fick snabbt mer uppmärksamhet med upptäckten att kondroitinsulfat från brosk framträdande ökade den kollagenolytiska aktiviteten hos cathepsin K. Detta speciella peptidas hade upptäckts några år tidigare som det enda proteaset som är ansvarigt för kollagennedbrytning vid benremodellering och omedelbart erkänt som en potentiell läkemedelskandidat för behandling av metaboliska bensjukdomar, såsom osteoporos . Interaktionen mellan cathepsin K och kondroitinsulfat och andra glykosaminoglykaner undersöktes senare i detalj från både strukturella och funktionella perspektiv och glykosaminoglykaner har erkänts som de första kända allosteriska regulatorerna för ett cysteinkathepsinpeptidas , såsom beskrivs i detalj i följande avsnitt. Parallellt har funktionellt relevanta interaktioner med glykosaminoglykaner också dokumenterats för andra medlemmar av cysteinkatepsinfamiljen. Sammantaget har glykosaminoglykaner visat sig påverka både aktiviteten och stabiliteten hos cysteinkatepsiner. Kinetiska profiler överensstämmer vanligtvis med hyperboliska mekanismer, vilket indikerar interaktioner med enzymer utanför det aktiva stället, eventuellt via allosteriska mekanismer. Den stabiliserande effekten är viktig särskilt på grund av den relativa instabiliteten hos cysteinkatepsiner vid neutralt pH som finns i den extracellulära matrisen.

4. Reglering av Cathepsin K-aktivitet och stabilitet

av alla papainliknande peptidaser har cathepsin K fastställts som det cathepsin som är mest tätt kopplat till glykosaminoglykaner. Det identifierades ursprungligen som ett proteas uttryckt främst i osteoklaster och dess försämrade aktivitet visade sig resultera i allvarliga benstörningar . Cathepsin K är ett kollagenas med unik aktivitet bland däggdjurspeptidaser, som specifikt moduleras av glykosaminoglykaner via allosteriska mekanismer . På grund av sin centrala roll i benomsättningen anses cathepsin K för närvarande vara ett av de mest lovande målen för behandling av osteoporos . Förutom benremodellering är cathepsin K involverad i olika fysiologiska och patologiska processer (för en ny granskning se ). Det kan klyva ett antal extracellulära substrat, inklusive proteoglykaner , för att frigöra aktiva glykosaminoglykaner, som i sin tur modulerar dess aktivitet. I brosk bryter katepsin K både typ i och typ II kollagener och bidrar därmed till utvecklingen av olika inflammatoriska ledsjukdomar . Dessutom har cathepsin K associerats med hjärt-kärlsjukdomar, fetma, schizofreni och cancer .

interaktionen mellan cathepsin K och olika glykosaminoglykaner har varit föremål för fördjupad undersökning. Även om flera aspekter av dessa interaktioner förblir svårfångade, tyder ackumulerade data på att interaktionerna är heterogena och olika och förmodligen involverar flera bindningsställen på enzymet. Kondroitin-4-sulfat (C4S) identifierades ursprungligen som GAG med den mest dramatiska effekten på cathepsin K medan effekterna av kondroitin-6-sulfat (C6S), dermatansulfat (DS) och hyaluronan (HA) var svagare. Alla testade GAGs ökade stabiliteten hos cathepsin K över ett brett pH-område. C4S hade den mest framträdande effekten på nedbrytningen av typ i-och II-kollagener av cathepsin K , medan dess effekt på hydrolysen av ett syntetiskt substrat var praktiskt taget identiskt med C6S och DS och resulterade i en dubbel ökning av värdena för specificitetskonstanten . I en senare studie befanns keratansulfat (KS) och C6S ha en stimulerande effekt på cathepsin K liknande den för C4S, medan heparin och HS hade en begränsad effekt på den kollagenolytiska aktiviteten hos cathepsin K . Tidiga experiment har också föreslagit att komplex bildning med CS är nödvändig för den kollagenolytiska aktiviteten hos cathepsin K ; emellertid har nya fynd visat att kollagen av typ i också effektivt kan brytas ned i frånvaro av glykosaminoglykaner . Icke desto mindre har Benbaserade GAGs visat sig förstärka den kollagenolytiska aktiviteten hos cathepsin K och endogena GAG-koncentrationer i ben var tillräckliga för en maximal effekt på cathepsin K-aktivitet .

den kinetiska mekanismen för effekten av CS, DS och heparin (HP) på cathepsin K undersöktes också i detalj vid fysiologiskt plasma-pH på 7,4. Under dessa betingelser karakteriserades CS och DS som icke-väsentliga aktivatorer med en övervägande effekt på affiniteten för substratet . DS var effektivare än CS, vilket tillskrevs dess större flexibilitet på grund av färre intramolekylära vätebindningar . Intrinsisk fluorescens indikerade att bindning av GAGs påverkar konformationen av cathepsin K. I motsats till experiment utförda vid pH 5,5 fungerade CS och DS som hämmare av kollagennedbrytning vid fysiologiskt plasma pH. däremot var den kinetiska mekanismen för heparin bifasisk, vilket indikerar interaktion med två distinkta ställen på enzymet. Sammantaget var heparin en stark aktivator av cathepsin K vid fysiologiskt plasma pH, vilket ökade både dess kollagenolytiska och elastinolytiska aktiviteter. Dessutom hade heparin en stark stabiliserande effekt på cathepsin K under dessa förhållanden, vilket resulterade i en mer än 5-faldig ökning av enzymets halveringstid .

5. Strukturell grund för interaktionen mellan Cathepsin K och GAGs

kristallstrukturen hos cathepsin K och C4S avslöjade den strukturella grunden för interaktionen . Bindningsstället ligger på baksidan av cathepsin K och interagerar med tre disackaridenheter av CS i kristallstrukturen (Figur 2(a)). Som vanligt förmedlas glykosaminoglykan/proteininteraktionen mestadels av elektrostatiska interaktioner mellan den negativt laddade GAG-kedjan och positivt laddade rester på enzymet. Bindning av kondroitinsulfat orsakar inte signifikanta konformationsförändringar i cathepsin K jämfört med CS-fri cathepsin K. omvänt böjs CS-kedjan vid bindning till cathepsin K (Figur 2(B)). Huvuddelen av konformationsförändringen kan hänföras till interaktionen med en kort spiralformad region Arg8-Lys9-Lys10 som interagerar med fyra negativt laddade grupper på CS (Figur 2(c)). Ytterligare nära kontakter inkluderar Asp6, Ile171, Gln172, Asn190, Lys191 och Leu195 och några ytterligare vattenmedierade kontakter .

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 2

Interactions between human cathepsin K and GAGs. (a) Crystal structure of the cathepsin K/chondroitin-4-sulfate (C4S) complex. Proteinet visas i tecknad representation och C4S visas som pinnar. (b) Konformationsförändring i C4S vid bindning till cathepsin K. (c) detaljerad representation av interaktionen i panel (a). C4S visas som pinnar. Ryggraden i cathepsin K visas som band och rester som interagerar med C4S visas som pinnar. (d) placering av det förutsagda andra heparinbindningsstället i cathepsin K. positivt laddade rester som föreslås interagera med heparin visas som blå pinnar. För orientering visas C4S bundna vid det första bindningsstället som pinnar. Positionen för den aktiva platsen är markerad med en pil. Koordinaterna för cathepsin K / C4S-komplexet hämtades från Proteindatabanken under anslutningskod 3C9E. lösningsstrukturen för C4S modellerades med hjälp av data från . Alla bilder skapades med PyMOL.

det kinetiska beteendet hos DS var analogt med CS: det föreslogs därför att det interagerar med cathepsin K på samma sätt som CS . Heparin, å andra sidan, föreslogs att binda till två ställen på cathepsin K enligt dess kinetiska profil. Medan det första bindningsstället föreslogs vara identiskt med det för CS/DS, förutspåddes det andra bindningsstället på botten av molekylen genom kemiska tvärbindningsexperiment och beräkningsmodellering . Ur ett strukturellt perspektiv är det förutsagda bindningsstället en fortsättning på CD / DS-bindningsstället och består av flera basiska rester (Lys10, Lys40, Lys41, Arg108, Arg111, Arg127 och Lys214) organiserade i en ringformad struktur (Figur 2(d)). Kinetiska experiment har bekräftat att heparin kan bindas till båda platserna samtidigt . Det återstår emellertid att avgöra om detta kräver en HP-kedja som interagerar med båda platserna samtidigt eller två separata HP-kedjor. Detta är varken klart för interaktionen mellan andra GAGs med den andra HP-bindande platsen.

6. Interaktioner av GAGs med Cathepsins S och B

förutom cathepsin K har två andra humana papainliknande peptidaser, cathepsins S och B, visat sig regleras av glykosaminoglykaner i deras mogna former . Cathepsin S, närmaste släkting till cathepsin K, är ovanligt bland cysteinkathepsiner för att vara stabila vid neutralt pH . Cathepsin S har stora fysiologiska roller i antigenpresenterande celler som det viktigaste proteaset vid antigenbehandling och befanns nyligen regleras av C4S . I motsats till den aktiveringseffekt som observerades med cathepsin K, fungerade C4S som en hämmare av kollagennedbrytning av typ IV genom cathepsin S. inhibering observerades också med HS, medan HP, DS, C6S och HA ökade den proteolytiska aktiviteten hos cathepsin S med användning av typ IV-kollagen som substrat. C4S, C6S och HS inhiberade också hydrolysen av Z-Phe-Arg-AMC via en partiell, blandad mekanism. I likhet med cathepsin K observerades subtila konformationsförändringar i cathepsin S vid C4S-bindning genom inneboende fluorescensspektroskopi. Tre bindningsställen för C4S förutspåddes på cathepsin S genom molekylär dockning(Figur 3 (a)). En av de föreslagna platserna är den aktiva platsen, som emellertid inte överensstämmer med den observerade blandade inhiberingsprofilen för C4S; den andra är belägen på den nedre högra sidan av molekylen och motsvarar den nyligen identifierade allosteriska platsen i cathepsin K , medan den tredje är belägen vid botten av molekylen och motsvarar ungefär det sekundära heparinbindningsstället som identifierats i cathepsin K .

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 3

Predicted GAG-binding sites in papain-like peptidases. (a) Three predicted CS-binding sites in cathepsin S. (b) Two predicted HS/HP-binding sites in cathepsin B. (c) The conserved GAG-binding motif in papain. Förutsagda platser visas i cirklar och positivt laddade rester på varje plats visas som blå pinnar och märks. Positionen för den aktiva platsen är markerad med en pil. Alla koordinater erhölls från Proteindatabanken (anslutningskoder: 1nqc för cathepsin S, 3AI8 för cathepsin B och 1ppn för papain, resp.). Alla bilder skapades med PyMOL.

Cathepsin B är unik bland cysteinkatepsiner för att vara både ett endopeptidas och ett peptidyldipeptidas, beroende på konformationen av den ockluderande slingan, en cathepsin B-specifik struktur som ger en pH-specifik växling mellan båda aktiviteterna . I lysosomen begränsar det låga pH-värdet proteaset till en sluten exopeptidas-konformation, medan det nära neutrala pH-värdet i den extracellulära miljön främjar endopeptidas-aktiviteten hos cathepsin B. Extracellulär cathepsin B är oftast associerad med cancer och olika typer av artrit . Proteaset lokaliserades till cellytan i flera studier och befanns vara involverat i cellmigration under både fysiologiska och patologiska förhållanden . På molekylär nivå visades det att klyva ett antal extracellulära substrat, inklusive laminin, typ IV-kollagen och fibronektin . Nyligen har cathepsin B också föreslagits att vara ett bronkialsekretas som producerar amyloid-peptider i sekretoriska vesiklar av neuronala kromaffinceller . Det har emellertid också visat sig försämra amyloidavlagringar i en djurmodell och det totala resultatet har föreslagits bestämmas av balansen mellan cathepsin B och dess endogena hämmare cystatin C .

bindning av HP eller HS har visat sig öka stabiliteten hos det annars instabila enzymet vid alkaliskt pH (8,0), samtidigt som enzymets aktivitet minskar något längs hela enzymets pH-profil . Beräkningssimuleringar har förutsagt att heparin stabiliserar molekylens konformation under dessa förhållanden och har förutsagt två förmodade GAG-bindningsställen (Figur 3(b)), en på vardera sidan av enzymet . Den förmodade bindningsstället i L-domänen består av fem basrester (Arg85, Lys86, Lys130, Lys141 och Lys144), medan den i r-domänen endast innehåller två (Lys158 och Arg235). Författarna har föreslagit att bindningsstället i r-domänen har högre affinitet för kortare GAG-fragment, såsom heparindisackariden som används i deras dockningssimuleringar, medan den i L-domänen sannolikt är mer relevant för bindningen av längre GAG-fragment .

7. Interaktioner av GAGs med andra Papainliknande peptidaser

intressant har papain också visat sig interagera med GAGs. Trots att de inte har någon fysiologisk relevans pekar dessa interaktioner på evolutionärt bevarade regleringsmekanismer inom familjen. HP hämmade papain av en hyperbolisk blandad mekanism och påverkade dess konformation . En klassisk heparinbindande konsensussekvens identifierades i papain, i form av sekvensen 187-Ile-Arg-Ile-Lys-Arg-Gly-192. Strukturellt är denna sekvens belägen på höger sida av molekylen(Figur 3 (C)) i en region som ligger mellan båda allosteriska ställen som är kända i cathepsin K.

dessutom har några exempel på proteaser från protozoa parasiter beskrivits som interagerar med GAGs, vilket tyder på möjligheten av deras inflytande på värd-parasitinteraktioner. Cathepsin l homolog brucipain, en avgörande virulensfaktor för protozoan parasit Trypanosoma brucei, har visat sig vara allosteriskt modulerad av HS. Effekten av HS i denna studie var subtil och den hade förmågan att vända substrathämning av ett litet dipeptidsubstrat (Z-Phe-Arg-AMC) . En starkare effekt av HS observerades för cruzipain från den relaterade parasiten Trypanosoma cruzi. I detta fall var HS en aktivator av peptidas som orsakade en signifikant (upp till 6-faldig) ökning av peptidasaktiviteten mätt med ett syntetiskt substrat. Dessutom ökade HS frisättningen av kinin från kininogen med hög molekylvikt genom cruzipain in vitro såväl som genom levande trypomastigoter och reducerade de hämmande egenskaperna hos kininogen mot cruzipain . På samma sätt har HP nyligen visat sig modulera aktiviteten hos cathepsin L-liknande peptidas rCPB2.8 från Leishmania mexicana . I detta fall hämmade HP och HS, men inte CS eller DS, hydrolysen av Z-Phe-Arg-AMC genom en hyperbolisk blandad mekanism och påverkade proteinets konformation . Sammantaget visar dessa exempel att interaktioner med GAGs inte är begränsade till endogena cysteinkatepsiner men kan också spela olika roller i värdpatogeninteraktioner och kan fungera antingen som en del av kroppens försvar mot invaderande patogener eller som faktorer som bidrar till patogenens invasiva mekanismer.

8. Farmakologisk inriktning

Cathepsin K representerar för närvarande det mest attraktiva läkemedelsmålet bland katepsinerna, även om cathepsin S också är ett relevant mål vid sjukdomar associerade med förhöjt immunsvar, såsom bronkialastma och psoriasis . Flera cathepsin K-hämmare är för närvarande under utveckling, som riktar sig mot enzymets aktiva plats (samlas in ). För närvarande är den mest lovande hämmaren odanacatib (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), en nitril warhead-innehållande hämmare, mycket selektiv för cathepsin K . Fas III kliniska prövningar för odanacatib har avslutats framgångsrikt och ansökningar om godkännande förväntas lämnas in snart. Om det godkänns kommer läkemedlet att positionera sig på marknaden mot andra nya generationens läkemedel, såsom anti-RANK-ligand-antikroppen denosumab (Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA, USA) och teriparatiden, en rekombinant form av parathyroidhormon (Eli Lilly och Company, Indianapolis, IN, USA), liksom de väletablerade bisfosfonaterna . Inriktning på cathepsin K/kondroitin-sulfat-interaktionen skulle representera ett alternativ till dessa behandlingar. Endogent kondroitinsulfat är tillräckligt för att uppvisa en maximal aktiveringseffekt på cathepsin K och dess matsmältning minskar aktiviteten hos cathepsin K med 40% . En minskning av benomsättningen av denna storlek skulle sannolikt räcka för behandling av patienter med mindre allvarlig minskning av bentätheten. En extra fördel skulle vara att cathepsin K-aktivitet i sig såväl som livskraften och cellantalet för osteoklaster och osteoblaster skulle förbli ostörda.

intressekonflikt

författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av detta dokument.

bekräftelse

arbetet har fått stöd av bidrag från Slovenska forskningsbyrån (P1-0140 och J1-3602) till Boris Turk.