TEXT

behandling för meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) har komplicerats av ökande antibiotikaresistens. MRSA-stammar uttrycker penicillinbindande protein 2a (PBP2a), kodat av mecA, vilket ger resistens mot bronkialaktamer genom att skydda den reaktiva serin i en smal, otillgänglig klyfta, vilket gör att cellväggssyntes kan fortsätta i närvaro av antibiotikum (1, 2). Ceftobiprol och ceftarolin är anti-MRSA-cefalosporiner som hämmar PBP2a vid terapeutiskt användbara koncentrationer. R2-gruppen av ceftobiprol sträcker sig in i den smala klyftan av PBP2a för att komma åt det aktiva stället, medan ceftarolinbindning orsakar en allosterisk förändring i PBP2a, vilket avslöjar det aktiva stället för bindning av en andra molekyl (3, 4). Ceftobiprol har utvärderats i kliniska prövningar och ceftarolin är FDA-godkänt för behandling av hud-och hudstrukturinfektioner, inklusive de som orsakas av MRSA (5-10).

tidigare studier från vår grupp har visat att passage av KOLSTAMMEN i ceftobiprol väljer för resistenta mutanter med mutationer i PBP2a (11). Denna studie undersöker om ceftarolinpassage också väljer för liknande mutationer. Passageexperiment utfördes med två olika MRSA-bakgrunder: COL, ett arkaiskt homogent resistent isolat från 1961 och SF8300, en heterogent resistent samtida USA300 MRSA-stam. COLnex och SF8300ex, mecA-negativa derivatstammar av COLn och SF8300, erhölls genom (12) excision av kromosomal stafylokockkassettkromosom mec (SCCmec) (13). Vildtypsmeka återinfördes på plasmid pYK20 (härledd från plasmid pAW8 och innehållande vildtypsmeka klonad från kol ) till COLnex och SF8300ex för passage studier. Om mecA medierade resistens, bör antingen härdning av en resistent mutant av plasmid eller införande av den i en mottaglig bakgrund resultera i förlust eller vinst av fenotyp, vilket möjliggör bestämning av Mecas bidrag till resistens. Stammar och plasmider som används i denna studie listas i tabellerna 1 och 2. COLnex (pYK20) och SF8300ex(pYK20) passerades seriellt i tryptisk sojabuljong innehållande ökande koncentrationer av ceftarolin (Skogslaboratorier) som tidigare beskrivits (11).

Efter 28 dagar gav COLnex(pYK20) och SF8300ex(pYK20) som passerade i ceftarolin två mutanter, COLnexpT(pYK20COLT*) och sf8300expt(pyk208300t*) (en asterisk indikerar en plasmid genererad under ceftobiprol-eller ceftarolinval i en kol-eller sf8300-bakgrund) (tabell 1). Mikrofonerna till ceftarolin, ceftobiprol och andra laktamer (Sigma-Aldrich) bestämdes med buljongutspädningsmetoden enligt CLSI-standarder (tabell 3) (15). COLnexpT (pYK20COLT*) uttryckte högnivåresistens mot både ceftarolin och ceftobiprol, med mikrofoner på 64 kg/ml respektive 32 kg/ml. SF8300expT (pYK208300T*) uttryckte lågnivåresistens vid passage dag 4, med en MIC på 4 occurg/ml, som förblev oförändrad trots 24 fler passager (tabell 3 och Fig. 1). Den tidigare beskrivna ceftobiprolpasserade mutanten av COLnex (pYK20) (11), COLnexpB (pYK20COLB*), visade hög resistans mot både ceftobiprol och ceftarolin, med en MIC på 64 UKG/ml till vardera.

Plasmidmeca sekvenserades för mutationer i passagerade stammar. Eftersom PBP: er är målet för avsugningslaktamer sekvenserades även pbp1, -2, -3 och -4. Slutligen sekvenserades gdpP och acrB, eftersom mutationer i dessa gener hade identifierats i en mecA-negativ ceftobiprolresistent mutant av COL (16). Plasmid pYK208300T* (pYK20 från SF8300ex passerade i ceftarolin), hade en enda punktmutation (G till A vid kodande sekvensposition 1339) i mecA, vilket resulterade i en icke-synonym aminosyraförändring, E447K. inga mutationer fanns i andra PBP-gener, acrB eller gdpP (Tabell 4).

Plasmid pYK20COLT* (pYK20 från COLnex passaged i ceftarolin) hade inga mutationer i Meca. En punktmutation (C till T vid CDS-position 1327) som introducerade h443y-mutationen i GdpP, en punktmutation (G till A vid CDS-position 466) som introducerade d156n-mutationen i PBP2 och två punktmutationer (A till G vid CDS-position 601 och C till G vid CDS-position 723) som introducerade t201a-och F241L-mutationer i PBP4 hittades (Tabell 4). Observera att ceftarolinpassage av kol innehållande mecA i dess naturliga kromosomala läge också resulterade i en mutant med hög nivåresistens men saknade mutationer i mecA (data visas inte). Sekvensanalys av den passerade mutanten avslöjade en punktmutation i pbp2 (G till A vid CDS-position 1891), vilket resulterade i aminosyraförändringen G631S och en i pbp4 (T till A vid CDS-position 414), införande av en n138k-mutation. Dessa data indikerar att även i närvaro av mecA kan ceftarolin välja för mutationer i andra gener, vilket resulterar i resistens.

härdning av COLnexpB(pYK20COLB*) och SF8300expT (pYK208300T*) av deras plasmider, som var och en hade Meca-mutationer, minskade mikrofonerna för alla testade tuberkulo-laktamer (Tabell 5 och 6). Härdning av COLnexpT (pYK20COLT*) av dess plasmid, som saknade mecA-mutationer, hade ingen effekt på Mikrofoner (Tabell 5). Transformering av pYK20COLB*, som innehåller 6 substitutionsmutationer i mecA, till den mottagliga COLnex-föräldern, vilket gav transformanten COLnex(pYK20COLB*), resulterade i hög nivå ceftarolin och ceftobiprolresistens. Transformering av pYK208300T*, som innehåller den enda mutationen E447K i mecA, till COLnex, vilket gav transformanten COLnex (pYK208300T*), resulterade i hög nivåresistens mot ceftobiprol (MIC på 64 kg/ml) men endast låg nivåresistens mot ceftarolin (MIC på 4 kg/ml) (Tabell 5). Transformering av pYK20COLB * till SF8300ex, vilket gav transformanten SF8300ex (pYK20COLB*), resulterade i hög nivå resistens mot ceftarolin och ceftobiprol (MIC på 32 micg/ml till vardera) (Tabell 6). Flera försök att omvandla SF8300ex med pYK208300T * misslyckades.

en enda aminosyraförändring vid E447 i mecA verkar spela en viktig roll för alla nyckelroll i motstånd. Det är närvarande i ceftobiprol-passaged COL (bland andra mutationer) (11), Det är den enda mecA-mutationen i ceftarolin-passaged SF8300, och det har rapporterats i kliniska isolat (17, 18). Strukturellt ligger E447 i den penicillinbindande domänen för PBP2a och interagerar med R2-gruppen av ceftobiprol och andra XXL-laktamer (3, 19). E447K gav hög nivå ceftobiprolresistens och låg nivå ceftarolinresistens i COLnex-bakgrunden, troligen på grund av strukturella skillnader mellan de två föreningarna. Flera mutationer i mecA ger hög resistens mot båda antibiotika (20). Den genetiska bakgrunden spelar också en roll. Heterogen SF8300 passaged i ceftarolin utvecklade lågnivåresistens mot ceftobiprol och ceftarolin med E447K (MIC 4 occolg/ml). Denna mutation har associerats med låg nivå resistens mot ceftarolin i kliniska isolat (17).

Sammanfattningsvis väljer passage i antingen ceftarolin eller ceftobiprol för en e447k-mutation i PBP2a, en mutation som finns i ceftarolinresistenta kliniska isolat, vilket understryker dess betydelse för att förmedla resistensfenotypen (17, 18). Även om helgenomsekvensering inte utfördes, vilket är en begränsning av denna studie, spelar andra gener än mecA en roll eftersom resistensnivån skilde sig mellan KOL-och SF8300-bakgrunder vid introduktion av e447k-mutationen och den mycket resistenta passagerade COL-mutanten hade inga mecA-mutationer. Även om det sannolikt finns andra, verkar mutationer i gener som kodar för PBP4 och GdpP vara särskilt viktiga, eftersom dessa upprepade gånger har identifierats i ceftobiprol – och ceftarolinpasserade mutanter. Rollen av dessa gener och andra är under aktiv undersökning.