introduktion

de fullständiga genomsekvenserna av olika organismer, inklusive däggdjur, har nyligen blivit tillgängliga som en följd av snabba framsteg inom DNA-sekvenseringsteknik. Men särskilt hos däggdjur spelar analysen av transkript fortfarande en nyckelroll för att överbrygga klyftan mellan genomet och proteomen. Detta beror främst på att vi för närvarande inte kan exakt förutsäga strukturerna för transkript härledda från en viss gen från den genomiska informationen ensam. Således, som en metod för analys av transkript, är cDNA-bibliotekskonstruktion avgörande, även i post-genom-sekvenseringstiden. Även om cDNA-kloning av gener av intresse av PCR har tillhandahållit en förenklad alternativ väg för att analysera transkriptstrukturer utan cDNA-bibliotekskonstruktion, konstruktionen av ett cDNA-bibliotek är valet när ett stort antal cDNA från en enda mRNA-källa ska analyseras. Hittills har en stor insats gjorts för att utveckla en metod för beredning av högkvalitativa cDNA-bibliotek (1-4). Däremot har frågan om hur man förbereder ett högkvalitativt cDNA-bibliotek från en liten pool av RNA inte tagits upp så aktivt. Detta har emellertid blivit ett högt prioriterat mål eftersom forskare ofta är intresserade av hypotetiska gener som förutspås endast uttryckas i vissa typer av celler eller vävnader under särskilda förhållanden, såsom de som ses i patologiska prover.

det har förekommit ett antal rapporter som beskriver användningen av små mängder källrna för generering av förstärkt cDNA eller cRNA, från vilka mål för mikroarrayanalys kan framställas (5-15). Deras slutliga mål är att få full längd, icke-population-partisk RNA som är mycket representativt för det ursprungliga mRNA. För att utföra detta antar dessa metoder vanligtvis PCR eller in vitro-transkription av T7 RNA-polymeras för att förstärka det ursprungliga mRNA i form av cDNA respektive cRNA. Även om jämförelsen av uttrycksprofiler är en av de mest effektiva metoderna för att undersöka skillnader i de fysiologiska tillstånden hos celler eller vävnader, kan strukturell karakterisering av transkript (t.ex. identifiering av alternativa skarvningsmönster, transkriptionsstartplats och transkriptionstermineringsplats) inte göras genom en sådan mikroarrayanalys. Sekvenseringsanalys av varje transkript är oundviklig i dessa fall.

Vi utvecklade en metod som tillåter en liten mängd startande RNA att användas för att konstruera ett cDNA-bibliotek som är lämpligt för genkloning och omfattande sekvenseringsanalys. Metoden taggar 3′ och 5 ’ ändarna av första omgången cDNA med T7 och SP6 fagpromotorsekvenser, respektive, för att minimera storleksförskjutningseffekter under förstärkningen. Efter två-runda cRNA-förstärkning konverterade vi de förstärkta Crna till cDNA, klonade dessa produkter till en plasmid och utvärderade sedan det resulterande cDNA-biblioteket i jämförelse med det som konstruerades med en konventionell metod (4,16,17).

material och metoder

cRNA-amplifiering

sekvenserna av oligonukleotider som används i denna studie visas i Tabell 1. För att upprätta protokollet använde vi 1 uscug totalt RNA framställt från ICR mouse brain (8 veckor gamla hanmöss) som en mall. En blandning(10 oc) av 1 oc Total RNA och 100 pmol T7-Not-(dT)18 primer inkuberades vid 70 oc C i 10 min och snäppkyldes sedan på is. Dubbelsträngad cDNA-syntes och adapterligering utfördes efter protokollen från det SUPERSCRIPT-plasmidsystemet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) (4,16,17), med mindre modifieringar. Kortfattat, för det första-strand cDNA-syntes, 4 µL 5× första-strand-buffert (Invitrogen), 1 µL 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 µL 10 mM dntp, 1 µL (40 U) RNaseOUT™ (Invitrogen), och 1 µL vatten har lagts till denaturerad RNA/T7-Inte-(dT)18 primer mixure och inkuberas vid 37°C i 3 minuter för att glödga primers. Därefter tillsattes 2 accusl (400 U) SUPERSCRIPT III RNAs H-omvänd transkriptas (Invitrogen) till reaktionsblandningen och temperaturen justerades till 50 ccusk C för att starta cDNA-syntesen i första strängen. Efter 1 h, den andra-strand cDNA-syntes genomfördes som tidigare beskrivits av Gubler och Hoffman (18), till den första strand cDNA blandning, 91 µL vatten, 30 µL 5× andra strand buffert (Invitrogen), 3 µL 10 mM dntp, 1 µL (10 U) Escherichia coli DNA ligase, 4 ĩl (40 U) E. coli-DNA-polymeras och 1 µL (2 U) E. coli RNase H tillkom, och blandningen inkuberas vid 16°C under 2 h. cDNA termini var sedan slutet av polerad med 10 U T4 DNA-polymeras (Invitrogen) vid 16°C i 5 min, och reaktionen blev stoppad av tillägg av 10 µL 0,5 M etylendiamin tetraacetic syra (EDTA). De resulterande cDNA renades genom extraktion med fenol/kloroform / isoamylalkohol (25:24:1), följt av etanolutfällning som tidigare beskrivits (17), med undantag för användning av 1 kg jästtrna istället för polyadenylsyra som bärare. Den utfällda cDNA löstes i 50 occyl TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 och 1 mM EDTA), blandades med 30 occyl av en 20% (w/v) polyetylenglykol (PEG) 6000/2, 5 M NaCl-lösning och inkuberades sedan på IS i 1 h (17). Efter inkubationen centrifugerades cDNA-blandningen vid 18,000 xnumx kg vid 4 xnumx xnumx C under 15 min. Den resulterande cDNA-pelleten sköljdes två gånger med 70% etanol, torkades och återsuspenderades sedan i 30 oc-l vatten. De renade cDNA: erna ligerades med 500 pmol SP6-adapter (Tabell 1) med användning av 5 U T4 DNA-ligas (Invitrogen) i en reaktionsvolym på 50-oc-l vid 16 oc-C över natten. Den adapterligerade blandningen späddes två gånger med vatten, och sedan renades cDNA med användning av en dnaclear-kolonn av typ (Ambion, Austin, TX, USA). Eluatet (i 16 occyl vatten) användes som en mall för cRNA-syntes. Med användning av MEGAscript exporterande tillverkare T7 kit (Ambion) syntetiserades Crna vid 37 C C över natten i en 40-occyl reaktionsvolym. Efter att Mall-cDNA degraderades med 4 U DNase I renades de syntetiserade Crna: erna med användning av ett Rneasy-Mini-Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA) och eluerades med 100 oc-l vatten. Koncentrationen av cRNA bestämdes genom ultraviolett (UV) absorption. För den andra omgången cRNA-amplifiering, 2 occurg av den syntetiserade cRNA och 100 pmol SP6 up primer (lika med den övre strängen oligonukleotid av SP6 adapter visas i Tabell 1) användes som mall och primer, respektive. CDNA-syntesen i andra omgången utfördes som i den ursprungliga omvända transkriptionen från KÄLLRNA, förutom att SP6 up-primerglödgning utfördes vid 50 kub C för 3 min. Efter rening av det erhållna dubbelsträngade cDNA genom en dnaclear-kolonn användes 0,5 occurg av cDNA som en mall för nästa SP6 RNA-polymerasassisterad cRNA-amplifiering. Med användning av MEGAscript SP6-satsen (Ambion) utfördes cRNA-syntes vid 37 2CB C under 6 h. efter att Mall-cDNA försämrades med användning av DNase i renades de syntetiserade Crna som beskrivits ovan.

Tabell 1. Nukleotidsekvenserna av primrar och adaptrar som används för Bibliotekskonstruktion

cDNA-Bibliotekskonstruktion

två mikrogram av de resulterande Crna utsattes för dubbelsträngad cDNA-syntes med användning av 100 pmol attB2-Not – (dT)18 primer (tabell 1). CDNA-syntesen, end-blunting, renings-och adapterligeringsstegen utfördes som i de tidigare cDNA-synteserna, förutom att attb1-adaptern (Tabell 1 500 pmol) ligerades till de dubbelsträngade cDNA: erna. Efter att attb1-adaptor-ligerade cDNA renades genom successiva behandlingar av fenol/kloroform/isoamylalkoholutvinning, etanolutfällning och PEG/NaCl-utfällning i denna ordning löstes de i 50 oc TE och behandlades med RNAs A (vid en slutlig koncentration av 10 oc / mL; Invitrogen) för att bryta ned förorenat RNA vid 37 oc C i 30 min. Reaktionsblandningen renades igen genom extraktion med fenol/kloroform/isoamylalkohol, följt av etanolutfällning och PEG / NaCl-utfällning. De resulterande cDNA löstes i 15 occylte, och deras mängd uppskattades från fluorescerande färgningsintensitet efter elektrofores på agarosgel (4). De attB1-ligerade cDNA: erna (36 ng) utsattes för en in vitro-rekombinationsreaktion (Gateway 250 ng Attp-pSP73 donatorvektor som tidigare beskrivits (4,16,17). I korthet, den attB1-ligated cDNA och attP-pSP73 givare vektor var blandade och inkuberas i en 10 µL reaktion volym som innehåller 2 µL 5× BP Clonase™ reaktion buffert och 2 µL BP Clonase (både från Invitrogen) vid 25°C över natten. CDNA-blandningen behandlades med 2 kg proteinas K (Invitrogen) vid 37 kg C i 10 minuter för att släcka reaktionen och extraherades med fenol/kloroform/isoamylalkohol, följt av etanolutfällning med 2 kg jästtrna som bärare. Den utfällda cDNA löstes i 10 oc-l vatten och 1 oc-l av blandningen användes för transformation av ElectroMAX oc-DH10B oc-E. coli-celler (Invitrogen). Efter titrering av det resulterande cDNA-biblioteket återvanns cDNA-plasmiderna från cirka 1 000 000 kolonier med en alkalisk natriumdodecylsulfat (SDS) – metod som tidigare beskrivits (4,19). De resulterande cDNA-klonerna var i en form av plasmidbärande attL-platser. Eftersom plasmider som bär attB-platser krävs i vissa applikationer omvandlades dessa plasmider till de som bär attB-platser som tidigare beskrivits (16). Detta cDNA-bibliotek betecknades följaktligen som MB-AL (mouse brain amplified cRNA-derived library).

på samma sätt som beskrivs för MB-AL konstruerade vi ett cDNA-bibliotek från icke-amplifierat RNA (100 usci mush Brain total RNA) och betecknade det som MB-CL (mouse brain konventionellt konstruerat bibliotek).

undersökning av Storleksförskjutningseffekt på amplifierade Crna

för att undersöka storleksförskjutningseffekten på Crna, den första omgången Crna transkriberas av T7 RNA-polymeras och den andra omgången Crna transkriberas av SP6 RNA-polymeras kördes på 1,0% agarosgel (1 ugug vardera) och blottades sedan på nylonmembran (Biodyne Jacobb Nylonmembran; PALL, East Hills, NY, USA). De hybridiserades med 32P-märkt SP6 up primer (Tabell 1) och inte-(dT)18 (5′-GCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′) oligonukleotid. Tio picomoler av varje sond märktes med ATP (cirka 3000 Ci / mmol; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) genom att använda T4 polynukleotidkinas (Takara, Kyoto Japan). Efter hybridisering över natten i GMC-buffert (20) vid 45 kcal C tvättades dessa membran i stor utsträckning i 1 kg standard saltlösning (SSC)/1% SDS-lösning tre gånger vid rumstemperatur. Analys av hybridiserade signaler utfördes på en bas 2000 Bildanalysator (Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)

utvärdering av cDNA-bibliotek

gelelektrofores. Distribution av cDNA-insatsstorlekar undersöktes genom elektrofores av Crna syntetiserade av T7 RNA-polymeras med användning av NotI-digererad MB-AL och MB-CL plasmid-cDNA som mallar. Efter rening med användning av ett Rneasy Mini-Kit elektroforerades Crna: erna på en formaldehydinnehållande agarosgel med perfekta RNA-markörer (EMD Biosciences, Madison, WI, USA). Efter färgning av gelen med SYBR bisexuell Green II (Invitrogen) analyserades fluorescerande färgningsintensitet med användning av ImageQuant (version 5.0) programvara på en FluorImager 595 (Amersham Biosciences).

Random single-pass sekvensering analys. 3 ’ – End-sekvenser av cDNA-kloner undersöktes genom DNA-sekvensering. Plasmid-DNA från 768 slumpmässigt plockade kloner renades med användning av en MFX-9600 Magniabisci (Toyobo, Osaka, Japan) och analyserades med en RISA 384-kapillär Sequencer (Shimadzu, Kyoto, Japan) (16). Efter att ha trimmat vektorsekvensen med Sequencher Bisexual Software version 4.1 (Hitachi Software, Tokyo, Japan), de erhållna cDNA-sekvenserna som var längre än 200 nukleotidrester grupperades med cDNA-poster i genbank bisexual-databasen och vår interna musdatabas. Undersökning av integriteten hos 3 ’- ändarna av cDNA-kloner utfördes genom en analys av huruvida en kanonisk polyadenyleringssignalhexamer (5 ’- AATAAA-3’) eller dess enkelbasvarianter (11 signalhexamerer) hittades inom de 50 nukleotidresterna uppströms från poly(A)-svansen av cDNA (21).

cDNA microarray. Mikroarrayanalyser utfördes för att jämföra cDNA-populationer i MB-AL-och MB-CL-biblioteken. Hemmagjorda cDNA-nylonmikroarrayer med 3534 prober bereddes och radioisotopdetektering utfördes (22). I korthet sågs cDNA-plasmider, som isolerades i vårt institut och för vilka fullständiga sekvenser eller slutsekvenser redan var kända, med användning av GeneTAC Kazakh RA1 (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI, USA) på Biodyne B nylonmembran och fixades sedan enligt tillverkarens instruktioner. Listan över cDNAs immobiliserade på denna mikroarray är tillgänglig på begäran från författarna. MB-AL-och MB-CL-mål-cDNA bereddes med användning av omvänd transkription från var och en av de 1 usci cRNA-proverna som användes för inmatningsstorleksanalysen såsom beskrivits ovan. Dessa mål syntetiseras och märkt i reaktionsblandning innehållande 1 µg varje cRNA, 100 ng slumpmässiga hexamer, 1× första strand buffert, 10 mM DTT, varje 800 µM dATP, dTTP, och dGTP, 800 nM, dCTP, 5 µL dCTP (>2500 Ci/mmol; Amersham Biosciences), och 100 U Upphöjd II RNase H – omvänd transkriptas i rumstemperatur i 10 min och sedan vid 42°C i 1 h. Efter alkalisk lys och neutralisering, märkt cDNAs renades med QIAquick® PCR purification kit (QIAGEN) och räknas. Målet cDNA utsattes för hybridisering med cDNA nylon microarray i närvaro av 1 µg polyadenylic syra och 2,5 µg Musen Barnsäng-1 DNA® (Invitrogen) i 250 µL PerfectHyb™ buffert (Toyobo) vid 68°C över natten. Efter strikt tvättning vid 68 CCB med 2 CCB SSC/1% SDS (två tvättar på 15 min vardera) och sedan med 0,1 SSC / 1% SDS (två tvättar på 30 min vardera) detekterades hybridiseringssignalerna och analyserades på en FLA-8000 (Fuji fotofilm). CDNA-fläckarna som visar starkare signaler än bakgrundskontrollen valdes och utsattes för ytterligare analys. Efter att ha utfört global normalisering erhölls scatter-tomter av signalintensiteter av cDNA-fläckar som härrör från MB-AL och MB-CL-mål.

RNA blot hybridisering. RNA blot hybridisering utfördes för att undersöka storlek-bias effekter. MB-AL-och MB-CL-Crna (vardera 1,5 USCG, syntetiserade som beskrivits ovan) elektroforesades på formaldehydinnehållande agarosgel och överfördes till Biodyne B-nylonmembran. Sondens cDNA framställdes med användning av PCR-amplifiering. Primers designades baserat på sekvenserna registrerade i GenBank-databasen eller vår interna databas; mallar var cDNA-plasmider som vi hade isolerat. Sonden av ribosomalt S6-protein var 724 bp i längd, förstärkt med 5′-CGCTCGGCTGTGTCAAGATG-3′ och 5′-GAGGACAGCCTACGTCTCTGGG-3′ primers, och sonden av värmechockprotein (hsp) 70, 940 bp i längd, förstärktes med 5′-GATGGACAAGGCGCAGATCC-3′ och 5′-CTCGATGGTGGTCCTGAGC-3′ primers. Dessa sonder märktes med dCTP (cirka 3000 Ci/mmol; Amersham Biosciences) med hjälp av RadPrime DNA-märkningssystemet (Invitrogen). Efter hybridisering över natten i PerfectHyb-buffert vid 65 CCB tvättades membranen successivt med 0,1 CCB / 1% SDS vid rumstemperatur i 5 min och i 15 min och sedan vid 65 CCB i 30 min. Hybridiseringssignalerna detekterades på en BAS 2000 bildanalysator.

resultat och diskussion

cDNA-bibliotekets konstruktionsmetod som vi utvecklade i denna studie visas i Figur 1 (nyligen införda steg markeras med en stjärna). Denna metod består av två omgångar av cRNA-förstärkningssteg, omvandling av Crna till cDNA och rekombinationskloning till en plasmid. Det viktigaste steget i denna metod är adaptern ligering att märka cDNA slutar med SP6 promotor sekvens. När vi framgångsrikt kan syntetisera cDNA i detta format blir det möjligt att specifikt omvända transkribera Crna i första omgången som innehåller SP6-promotorsekvensen vid deras 3′ – ände. Den andra omgången Crna syntetiseras med SP6 RNA-polymeras med användning av de resulterande dubbelsträngade cDNA som mallar. Efter de två omgångarna av RNA-polymerasassisterad amplifiering omvandlas de resulterande Crna: erna till dubbelsträngade cDNA genom omvänd transkription med användning av attb2-Not-(dT)18-primern. Användningen av attb2-Not-(dT)18 primer i omvänd transkription gör det möjligt för oss att konvertera endast Crna som bär sekvensen 5′-(a)18gcggccgc-3′ vid deras 3′ ändar. Eftersom dessa modifieringar endast bör tillåta förstärkning och kloning av cDNA som har korrekt taggade ändar, förväntar vi oss att denna metod kommer att minimera storleksförskjutning under RNA-polymerasassisterad förstärkning.

för att testa metodens effektivitet konstruerade vi cDNA-bibliotek med en konventionell metod (16) med användning av icke-förstärkt totalt RNA från mushjärnan (100 USCG) och med den ovan beskrivna metoden med användning av 1 USCG totalt RNA från mushjärnan. Tabell 2 sammanfattar mängderna cDNA och cRNA erhållna i varje steg, beräknat som ett genomsnitt av tre oberoende experimentella körningar av MB-AL-konstruktion. Vi fick i genomsnitt 6,4 107 oberoende cDNA-kloner som slututgång. Eftersom detta antal cDNA-kloner härrör från totalt 36 ng cDNA genererat med hjälp av amplifieringsprotokollet, beräknar vi att denna metod ger ungefär 1,2 cDNA 1011 cDNA-kloner från 1 accug totalt RNA.

Tabell 2. Mängder av cRNA och cDNA syntetiseras vid varje steg

för att undersöka storleksförskjutningseffekten under förstärkningssteg experimentellt jämförde vi nästa storleksfördelningar av den första omgången och den andra omgången cRNA med RNA blot hybridiseringsanalys. I dessa experiment hybridiserades den första omgången och den andra omgången Crna med SP6 up-primer respektive med icke-(dT)18 oligonukleotid, eftersom dessa oligonukleotidprober endast detekterar Crna korrekt transkriberade till slutet. Såsom visas i Figur 2 befanns RNA-storleken vid toppen av hybridiseringssignalen i den andra omgången cRNA vara nästan densamma som i den första omgången cRNA, men med en liten förskjutning till mindre storlek. Vi misstänker att trunkering av cRNAs troligen ägde rum under cDNA-syntesen i andra omgången med SP6 UP-primern.

för att ytterligare bedöma kvaliteten på det resulterande förstärkta cDNA-biblioteket jämförde vi också olika funktioner i cDNA-biblioteken genererade med och utan förstärkningen (MB-AL respektive MB-CL). Vi undersökte först storleksfördelningen av cDNA-insatserna, som visas i figur 3A. resultaten av fluorescensintensitetssignaler erhållna från gelfärgningsbilden indikerade att cDNA-insatsstorlekarna MB-AL och MB-CL var likartade, men topppunkten var något mindre i MB-AL (0,65 kb) jämfört med den i MB-CL (0,8 kb). Därefter analyserade vi 3 ’ – end-sekvenser av slumpmässigt samplade cDNA-kloner från varje bibliotek. Klusterresultaten för dessa uttryckta sekvenstaggar (ESTs) visas i figur 3B och antyder att komplexiteten hos MB-AL var så hög som MB-CL. Det är dock värt att notera att mycket överflödiga cDNA-kloner försvann i MB-AL. Genom en statistisk analys (Chi-test) visades att skillnaden i uppsägningar mellan MB-AL och MB-CL var signifikant (sannolikheten för att uppsägningarna i MB-AL och MB-CL liknar är <0.001). Dessutom undersökte vi integriteten hos 3’ – ändar av cDNA genom att analysera om varje EST innehöll en polyadenyleringssignalhexamer eller inte. Resultaten indikerade att 80,1% och 87,3% av cDNA-kloner i MB-AL respektive MB-CL innehöll troliga polyadenyleringssignalsekvenser (21). Minskningen av förekomsten av polyadenyleringssignalhexamerer i MB-AL indikerade förmodligen en ökning av antalet cDNA-kloner där cDNA-syntes var internt primerad på grund av två omgångar av DT-priming.

genom mikroarrayhybridisering undersökte vi cDNA-populationen av MB-AL i jämförelse med MB-CL. Figur 3C visar en scatter plot av hybridiseringssignaler av MB-AL och MB-CL mål. Resultaten indikerade en signifikant hög korrelation av hybridiseringssignaler mellan MB-AL och MB-CL-mål, vilket tyder på att det inte fanns någon skadlig effekt av amplifieringen i cDNA-populationen.slutligen utförde vi RNA blot hybridiseringsanalys för att undersöka storleksförskjutningseffekter med uppmärksamhet på hushållningsgener (figur 3D). För ribosomalt S6-protein och hsp 70 var cRNA-storlekarna både i MB-AL och MB-CL lika och jämförbara med de som förväntades från deras rapporterade nukleotidsekvenser. Hybridiseringsmönstret för hsp 70 Crna i MB-AL var dock något annorlunda än det i MB-CL, vilket indikerar att storleksförskjutningseffekten inte avlägsnades helt.

metoden för cDNA-bibliotekskonstruktion som beskrivs i denna rapport utformades för att minimera storleksfördomar under amplifieringssteg med hjälp av RNA-polymeras. En sådan RNA-polymeras-assisterad bibliotekskonstruktionsmetod från en liten RNA-pool för omfattande sekvenseringsanalys har inte studerats väl, medan cDNA / cRNA-bibliotekskonstruktionsmetoder för mikroarrayhybridisering har aktivt drivits. Även om Lukyanov et al. (23) och Piao et al. (24) rapporterade metoder som använder PCR-amplifiering för att konstruera ett cDNA-bibliotek från en submikrogrammängd totalt RNA, PCR-amplifiering har i sig nackdelar såsom svår storlek och befolkningsförspänning och låg trohet för cDNA-amplifiering. Det var därför vi försökte utveckla en cDNA-bibliotekskonstruktionsmetod baserad på RNA-polymerasassisterad förstärkning i denna studie.

För detta ändamål utarbetade vi en ny RNA-polymerasassisterad förstärkningsstrategi som visas i Figur 1 eftersom metoderna för Eberwine et al. (5), Huang et al. (10), och Lin et al. (11) har fortfarande nackdelar för framställning av en plasmidinnehållen cDNA lämplig för omfattande genstrukturanalys. I det förra görs cDNA-syntes efter cRNA-förstärkning med slumpmässiga hexamerer, och detta gör de förstärkta cDNA oundvikligen kortare än de ursprungliga (5,7). I det senare är införandet av en homopolymer svans vid cDNA-änden av den första strängen med terminal deoxynukleotidyltransferas (TdT) eller Moloney murine leukemivirus (MMLV) omvänd transkriptasaktivitet (10,11) vettigt att minimera storleksförskjutningseffekten under RNA-polymerasassisterad förstärkning som i vår metod. Den homopolymera svansmetoden är emellertid känd för att orsaka trunkering av cDNA på grund av oväntad priming av cDNA-syntes från en homopolymerisk sträcka av interna RNA-sekvenser. Eftersom adapterligeringsmetoden som beskrivs i denna studie kan ge en specifik sekvens för cDNA-priming, kan vi förvänta oss att minska omfattningen av cDNA-trunkering med vår metod.

i princip bör vår metod endast förstärka cDNAs flankerade av en inneboende poly(A) svans och SP6-adaptersekvensen, som genererades i cDNA-syntesen i första omgången. Resultaten som visas i Figur 2 och figur 3A var i huvudsak förenliga med detta, även om cDNA-populationen i det mindre storleksintervallet ökade något. Resultaten av RNA blot-analys (figur 3D) visade också att storleksförskjutningseffekten kunde minskas men inte helt avlägsnas även i vår metod. Detta berodde troligen på att trunkerade cDNA bifogade av en poly (a) svans och SP6-promotorsekvensen genererades under omvandling av cRNA till cDNA. Denna uppfattning stöddes av det faktum att förekomsten av polyadenyleringssignalsekvenserna i MB-AL var signifikant lägre än den som observerades i det konventionella cDNA-biblioteket (21). Trunkering av cDNA kan inträffa under cDNA-syntes på grund av intern priming av RNA med dT-tailed primer och SP6 primer. Eftersom homopolymera sträckor ofta förekommer i eukaryota mRNA, kan den homopolymera svansmetoden införa mer allvarlig storleksförskjutning på multipelrunda cRNA-förstärkning än vår adaptor-ligeringsmetod. Även om höjning av reaktionstemperaturen under omvänd transkription och minskning av primerkoncentrationen kan undertrycka den avvikande inre primingen i cDNA-syntes i viss utsträckning, är det känt att det är svårt att helt eliminera detta för närvarande. Således, även om vi utförde två-runda cRNA-förstärkning för demonstration av det övergripande protokollet, rekommenderar vi i praktiken att hoppa över cRNA-förstärkningen i andra omgången när tillräckligt med cRNA kan erhållas i reaktionen i första omgången.

Med tanke på dessa resultat drar vi slutsatsen att vår nya metod är användbar för cDNA-bibliotekskonstruktion från en liten mängd startande RNA. Faktum är att vi framgångsrikt och rutinmässigt har använt denna metod för konstruktion av cDNA-bibliotek när mängden totalt RNA är mindre än 1 occurg (data visas inte). Eftersom 1 ACC Total RNA kunde återvinnas från 105-106 däggdjursceller eller 1 mg däggdjursvävnader, kan cDNA-bibliotek enkelt konstrueras från celler som fraktioneras av cellsorterare eller mikrodissektion genom att använda vår metod. Eftersom vi beräknar att denna metod gör det möjligt för oss att erhålla mer än 105 cDNA-kloner från 1 pg totalt RNA, vilket är nära mängden totalt RNA i en enda cell, kan ett enda cell-härledt cDNA-bibliotek konstrueras baserat på denna adaptor-ligationsassisterad cRNA-amplifiering.