resultat och diskussion

i däggdjurssystem har Cdc42-aktivitet visat sig vara viktig för att reglera differentiering av hudstamceller/stamceller i hårsäckceller, kontrollera neuroepitelial stam/stamfader polaritet och hjärnhemisfärisk bifurcation och reglera cellnummer och tillväxt under den perinatala utvecklingsperioden (6-9). Intressant nog visar en undersökning av Cdc42-aktivitet hos WT-vuxna möss i olika åldrar att den relativa Cdc42-GTP-nivån hos äldre djur är signifikant högre än hos yngre i olika vävnader, inklusive hjärta, hjärna, lunga, lever, benmärg, mjälte och njure (Fig. 1 A och data visas inte), vilket ökar möjligheten att ökad Cdc42-aktivitet är involverad i den normala åldringsprocessen.

för att avgöra om den ökade Cdc42-aktiviteten i samband med naturligt åldrande kan ha fysiologisk relevans undersökte vi Cdc42-negativa regulatorn, Cdc42GAP, i geninriktade möss efter att de har nått vuxen ålder. Tidigare studier av homozygota cdc42gap knockout möss under den perinatala perioden indikerade att olika vävnader / celler innehöll förhöjd Cdc42-GTP, och embryon/nyfödda valpar av Cdc42GAP −/− genotyp visade minskad organ/organismstorlek som är relaterade till ökad spontan apoptos i olika celltyper (6). Hos vuxna Cdc42GAP – / – möss var Cdc42-aktiviteten konstitutivt högre i flera vävnads- / celltyper än hos de matchande WT-mössen, medan nivån av RhoA-GTP eller Rac1-GTP förblev liknande den för WT (Fig. 1 B; data som inte visas), vilket tyder på en specifik förstärkning av Cdc42-aktivitet hos vuxna djur som liknar den under den perinatala perioden. Majoriteten av Cdc42GAP – / – möss dog under neonatalperioden på grund av deras mindre storlek och svaga kroppsbyggnad (6). En del av dem (7% av dem i 2 år) kunde dock överleva den nyfödda perioden under fosterhem av icke-närstående kvinnor. Trots regelbundet mjölkintag och normala serumglukos− och insulinkoncentrationer som hittades i de homozygota mössen i postnatalperioden , började viktökning av Cdc42GAP−/ – möss att avta vid 3 månaders ålder vid 3 månaders ålder jämfört med 5 månaders ålder vid 5 månaders ålder för WT eller heterozygota Möss, och de mogna homozygoterna reducerades 30% i kroppsvikt på grund av en minskning av den totala cellulariteten (Fig. 1 C och data som inte visas). Medianlivslängden för Cdc42GAP – / – – mössen var 12 månader i 12 månader, medan kontrollmössen (WT eller heterozygota) förblev viktiga fram till en medianålder på 27 månader i 27 månader (Fig. 1 D). Överlevnadskurvan för de homozygota mössen skiljer sig något från den typiska Gompertz-kurvan men liknar dem som rapporterats för bubr1 (en mitotisk kontrollpunktsregulator) knockout (10) eller p44 (en kort isoform av p53 tumörsuppressor) transgena (11) djur. Kyphos och brist på kraft i Cdc42GAP−/− möss blev uppenbara vid en ålder av 12 månader (Fig. 1 E). Skinned Cdc42GAP – / – möss vid 15 månaders ålder visade en tydlig minskning av kroppsmassa, en väsentlig förlust av subdermal fettvävnad, svår lordokyphos och muskelatrofi (data visas inte). En röntgenskanning visade en signifikant kyphosfenotyp och minskad benmineraltäthet (BMD) i Cdc42GAP−/− möss vid 15 års ålder (Fig. 1 F). Ytterligare kvantifiering av de dissekerade benen hos Cdc42GAP – / – möss avslöjade 3-och 2,6-faldiga minskningar av BMD i skenbenet respektive lårbenet (SI Fig. 7). Dessutom förlorade både manliga och kvinnliga Cdc42GAP−/− möss fertilitet vid en tidigare ålder jämfört med WT. Vid parning mellan Cdc42GAP – / – honor och WT-män blev homozygoterna infertila vid 26 veckor gamla jämfört med 48 veckor gamla för WT (Fig. 1 G). Dessa observationer indikerar att Cdc42GAP-brist resulterar i konstitutivt förhöjd Cdc42-GTP-nivå, minskad kroppsstorlek, tidig kyphos, minskad BMD, förkortad fertilitetsperiod och minskad livslängd hos vuxna möss.

h&e färgade sektioner genom den 8 månader gamla kvinnliga musens ryggkropp visade att Cdc42GAP- / -mössen hade en tunnare, böjd cortex och tunnare trabeculae jämfört med WT − möss (Fig. 2 A). På liknande sätt visade longitudsektionerna i lårbenet hos de homozygota mössen en minskning av kortikal bentjocklek jämfört med den hos WT-möss (data visas inte). Dessa observationer överensstämmer med det grova utseendet och de kliniska egenskaperna hos osteoporos. Mjälten, levern och njurarna hos vuxna Cdc42GAP−/− möss reducerades i massa på grund av en minskning av den totala cellulariteten, vilket var uppenbart i H&e-färgade delar av mjälten, och de T-och B-cellinnehållande vita massaregionerna hos 12 månader gamla Cdc42GAP-/− mjälte reducerades markant jämfört med de hos åldersmatchade WT− möss (Fig. 2 B och data som inte visas), vilket tyder på uttalad lymfoid atrofi i homozygoterna. I överensstämmelse med den uppenbara minskningen av subdermal fettvävnad avslöjade histologisk analys av tvärsnitten av dorsal hud en nästan fullständig frånvaro av s.c. fettceller i 9 månader gamla Cdc42GAP- / -möss (Fig. 2 C). En förlust i muskelmassa och muskelatrofi bekräftades också genom undersökningen av H&e-färgade skelettmuskelsektioner från 12 månader gamla Cdc42GAP-/-Möss och de åldersmatchade WT− mössen (Fig. 2 C). Cdc42GAP – / – – mössen visade också markant minskning av hårregenerering efter avlägsnande av rygghåret genom rakning, medan den ålders – och könsmatchade WT visade robust hårväxt (SI Fig. 8). Förmågan att tolerera spänningar, såsom sårläkning, en åldringsassocierad aktivitet (12) hos Cdc42GAP-/−− mössen, reducerades signifikant jämfört med WT (Fig. 2 D). Histopatologisk analys av sårsektionerna visade liten reepitelialisering i sårkanten på Cdc42GAP−/− – mössen, medan fullständig reepitelialisering av WT-möss var uppenbar 4 dagar efter att såret infördes (Fig. 2 E). Förutom dessa observationer överensstämde ett antal hematopoietiska fenotyper av de homozygota mössen, inklusive anemi, minskad mjälte och benmärgscellulariteter, defekter av hematopoietisk stamcellsingraftment till benmärgen och ökad känslighet hos hematopoietiska stamceller till inducerad mobilisering (13, 14) med tidig åldrande i det hematopoietiska systemet. Det är viktigt att en undersökning av unga homozygota möss (<4 månader gammal) före manifestationen av uppenbara fenotyper avslöjade inga större avvikelser i ben, hud och mjälte (SI Fig. 9 A och B och data som inte visas), vilket tyder på att de åldrande fenotyperna hos Cdc42GAP-/− möss inte beror på en tidig utvecklingsstörning. Vidare kunde ett antal fenotyper av de homozygota mössen, inklusive minskad kortikal bentjocklek, kyfos och förlust av muskelmassa och epidermala vävnader, hittas i de gamla (>2, 5 år gamla) WT-möss (SI Fig. 9 C och D och data som inte visas). Som sammanfattas i Si-Tabell 1, sammantaget ger dessa resultat starka bevis för att Cdc42GAP-brist orsakar för tidigt åldrande-liknande fenotyper hos djuren.

färgning av vävnaderna hos 9 månader gamla vuxna, inklusive lever, njure och mjälte, för senescensassocierat Bisexuell-galaktosidas (sa-Bisexuell-gal) avslöjade en stark aktivitet av denna senescensmarkör i de homozygota mössen som inte kunde detekteras i vävnaderna hos ålders-och könsmatchade WT – möss (Fig. 3 A och Si Fig. 10), vilket indikerar att Cdc42GAP – / – vuxna vävnader kan genomgå för tidig åldrande. Intressant nog ökade apoptos av homozygota vävnader som observerats under den perinatala perioden var frånvarande i de vuxna homozygoter när den förhöjda sa-AA-gal aktivitet var uppenbar (ref. 6 och data som inte visas). Cdc42GAP- / -mus embryonala fibroblastceller (MEF), som innehåller 3 gånger högre Cdc42-GTP men normalt Rac1-GTP-eller RhoA-GTP-innehåll jämfört med WT MEF-celler (6), uppvisade signifikant ökad sa-Tubi-gal-aktivitet och ackumulerade en utplattad och förstorad senescent morfologi som började vid passage 6 när WT MEF-celler var negativa för SA-Tubi-gal-aktivitet och var avtalsenliga i morfologi (Fig. 3 B och Si Fig. 11). Cdc42GAP – / – MEF-cellerna började bromsa i tillväxt vid passager 5-7 när de matchade WT MEF-cellerna växte exponentiellt (Fig. 3 C) (6), och de genomgick massiv replikativ senescens efter passage 7, medan de flesta WT MEF-celler inte nådde senescens förrän passage 13 (SI Fig. 11 och data som inte visas). Dessutom bildade en signifikant högre andel Cdc42GAP−/− MEF-celler vid passage 7 större foci i kärnan än WT-celler (SI Fig. 12). Dessa resultat indikerar att Cdc42GAP-brist inducerar tidig vävnad / cell senescens.

en välkänd bidragande faktor till däggdjurs för tidigt åldrande och cell senescens är ökad genomisk instabilitet (15). Metafasspridningsanalys visade att >30% primära splenocyter från 8 månader gamla homozygota möss var aneuploida, medan ålders-och könsmatchade WT-splenocyter inte hade någon detekterbar aneuploidi (Fig. 3 D), vilket indikerar att Cdc42GAP−/− vävnaden drabbades av genomisk instabilitet. Till stöd för detta resultat visade Cdc42GAP−/− MEF-celler en signifikant ökning av dubbla kärnceller under DAPI-färgning jämfört med WT-celler vid passage 7 (SI Fig. 12). Karyotypanalys av de senare passagerna av MEF-celler (passage 6-7) avslöjade vidare att även om de flesta kromosomer från WT− celler (80% av 80%) förblev intakta, innehöll 42% av Cdc42GAP−/ – celler åtminstone en kromosomavvikelse, 20% innehöll två eller flera avvikelser och 14% innehöll tre eller flera avvikelser (Fig. 3 E). Procentandelen och graden av aneuploidi ökade också signifikant i Cdc42GAP – / – MEF-celler, med >32% av cellerna som visar onormala kromosomtal från 72 till 102, medan de flesta WT-celler var diploida (Fig. 3 E och SI Fig. 13). Karyotypanalys av kromosomskador indikerar att avvikelserna hos de homozygota MEF-cellerna var olika, inklusive kromatidbrott, för tidig systerkromatidseparation (ett kännetecken för en defekt spindelmonteringskontroll), translokation, kromosombrott, dicentrisk kromosom och kromosomfragmentering (Fig. 3 F och SI Tabell 2), vilket tyder på att DNA− skadereparationsmaskinen äventyras i Cdc42GAP−/ – celler. Immunofluorescensfärgning av fosfo-H2 AX i cellkärnan, en DNA− skaderesponsmarkör (16), visar att även om 10% av passage 7 Cdc42GAP−/ – MEF-celler var positiva för DNA-skademarkören, <1% av WT-cellerna var positiva (Fig. 3 G). Korrelationen mellan uppkomsten och progressionen av de åldrande fenotyperna hos Cdc42GAP-/− Möss och den observerade graden och svårighetsgraden av de genomiska avvikelserna i Cdc42GAP− / − celler stöder en roll av Cdc42 i utvecklingen av progeroidfunktionerna.

för att bestämma den möjliga mekanismen för de ackumulerade DNA-skadorna i Cdc42GAP – / – celler jämförde vi den endogena reaktiva syrearten (ROS) nivån hos de homozygota cellerna med den hos WT-celler, eftersom Rac1 och Rac2, två närbesläktade Rho Gtpaser, är kända regulatorer av cellulär ROS (17). SI Fig. 14 visar att Cdc42GAP – / – celler visade en ROS-aktivitet som liknar den hos WT-celler, vilket indikerar att Cdc42GAP reglerar genomisk stabilitet genom en endogen ROS-oberoende mekanism. På grund av likheterna mellan flera Cdc42GAP−/− musfenotyper till de hos ett antal geninriktade musmodeller av DNA−skadereparationsmolekyler, inklusive Brca1−/− p53+/−, Ku80−/−och Mtr−/− Wrn− musmodeller (12, 18, 19), undersökte vi vidare responsen hos de tidiga passagerade Cdc42GAP – / – cellerna till olika DNA-skademedel. I DNA-skaderesponstillväxtanalys visade Cdc42GAP-deficientcellerna en bred defekt av DNA-skadereparationsaktivitet (Fig. 4), som manifesterade sig som signifikant högre procentandelar av celldöd bland de homozygota cellerna jämfört med WT-celler efter behandling genom att öka doserna av H 2O2, joniserande bestrålning, camptotecin, metyl− metansulfonat eller mitomycin C. Således kan de ackumulerade olika genomiska abnormiteterna som finns i de senare passagerna av Cdc42GAP−/ – celler tillskrivas, åtminstone delvis, till nedsatt DNA-skada reparationsaktiviteter.

en följd av ihållande genomisk skada i cellerna är induktion av flera DNA-skador-respons och/eller senescensgener (20, 21). Uttrycken av p53, p21Cip1, p16Ink4a och fosfo-p53 (Ser-15) i Cdc42GAP−/− MEF-celler var signifikant högre än de för WT MEF-celler efter liknande passager, medan p19ARF i de homozygota cellerna visade en liknande trend av ökning med passager, som WT-cellerna (Fig. 5 A). Proteinnivåerna av p53, p21Cip1, p16Ink4a, fosfo-p53 (Ser-15) och DNA-skadamarkören fosfo− H2 AX i Cdc42GAP−/-vävnader från 8 månader gamla möss var också signifikant högre än de i motsvarande vävnader hos matchade WT-möss (Fig. 5 B). Dessa resultat ger bevis för att aktivering av den p53-reglerade vägen, särskilt p21Cip1 och p16Ink4a, är associerad med Cdc42GAP-brist-inducerad tidig senescens. För att undersöka frågan om förhöjd Cdc42-aktivitet i Cdc42GAP-deficientcellerna är tillräcklig för att redogöra för den tidiga senescensfenotypen, uttryckte vi en aktiverande mutant av Cdc42, Cdc42F28L, i primära WT MEF-celler och analyserades för cellernas sa-Kazaki-gal-aktivitet i jämförelse med den för matchande EGFP-Uttryckande celler vid olika passager. Cdc42F28L-expression orsakade en signifikant ökning av SA-sacki-gal-positiv cellpopulation (35% i Cdc42F28L-celler jämfört med 7% i EGFP-Uttryckande celler) i tidiga passagerade MEF-celler (Fig. 5 C), vilket indikerar att Cdc42-aktivering är tillräcklig för induktion av tidig cell senescens.

för att ytterligare undersöka möjligheten att senescensfenotypen av Cdc42GAP−/− celler kan räddas av en p53−defekt, genererade vi Cdc42GAP+/− p53+/ – Möss och försökte förbereda MEF-celler från det korsade. Av 44 embryon erhölls sex med Cdc42GAP−/−p53+/−genotyp och ingen av Cdc42GAP−/−p53−/− genotypen. Cdc42GAP – / – p53 + / – MEF-cellerna växte med en hastighet mellan den för p53 + / – och WT-celler och visade en basal senescent population jämförbar med den för p53+/− eller WT− celler vid passage 7, medan p53−/− och Cdc42GAP−/-MEF-cellerna prolifererade med en linjär kurva och en böj-population fördubblingskurva och var senescensresistent och senescensbenägen vid liknande passager (Fig. 5 D och E). Dessa resultat indikerar att Cdc42-aktiveringsinducerad för tidig senescens beror på p53.

den begränsade livslängden för celler och djur kan bero på replikativ senescens som svar på olika påfrestningar, inklusive DNA-skada (22), telomererosion (23), ROS (24) och/eller olämpligt aktiverade onkogener (25). Cdc42GAP – / – – mössen presenterar en djurmodell för förstärkning av Cdc42-aktivitet som efterliknar mitogen signalinducerad Cdc42-aktivering (6) och möjliggör en bedömning av de möjliga effekterna av Cdc42-aktivering på djur-och cellfysiologi. Vi visar att Cdc42GAP-brist orsakar tidig senescens i celler och för tidig åldrande-liknande fenotyper i djuret. I synnerhet inducerar Cdc42GAP-geninriktning en global ökning av Cdc42-aktivitet och främjar cellgenomisk instabilitet med reducerad DNA-skadereparationsförmåga, som i sin tur kan aktivera p53 och p16 Ink4a, vilket leder till tidig senescens (Fig. 5 F). Tidigare har Cdc42 visat sig aktiveras i senescenta celler för att modulera morfologisk justering (26). Det har också föreslagits att vara involverat i p53-reglerad cell morfologisk förändring, apoptos och proliferation (27-29) och i c-Jun N-terminal kinasstyrd apoptos (30, 31), händelser som har associerats med cellulär senescens och djuråldring (32, 33). Våra resultat att Cdc42-aktivering är associerad med naturlig åldrande och att Cdc42GAP-brist orsakar en DNA-skada reparationsfel för att tillåta celler att ackumulera genomiska abnormiteter som leder till tidig senescens föreslår ytterligare en funktionell länk mellan Cdc42-aktivitet och åldrande av däggdjur.

aktivering av p53-vägen eller störningen av gener som är involverade i reparation av DNA-skador eller genomisk stabilitetsreglering har visat sig inducera tidigt åldrande hos möss (11, 12, 33, 34). I överensstämmelse med tidigare observationer att Cdc42 kanske inte är involverad i reglering av cellulära superoxidaktiviteter (17) fann vi att den ackumulerade DNA− skadan i Cdc42GAP−/ – celler inte är associerad med ROS-aktiviteten eftersom homozygota celler inte visar ökad ROS-aktivitet. Cdc42GAP-radering orsakar en markant minskning av förmågan att reparera DNA-skador i ett brett spektrum, inklusive svar på DNA-tvärbindningsmedlet och induceraren för dubbelsträngbrott eller enkelsträngbrott, vilket tyder på att långvarig aktivering av Cdc42 kan dämpa förmågan att reparera DNA-skador. Mångfalden av den genomiska skadan som finns i Cdc42GAP−/− cellerna överensstämmer också med en inverkan från en global DNA-skadereparationsfel. De viktiga frågor som återstår att ta itu med är vilka specifika molekylära determinanter som är involverade i Cdc42GAP-reglerad DNA-skadereparation och vilka uppströmssignaler som orsakar ökad Cdc42-GTP under den normala åldringsprocessen.