Abstrakt

bakgrund. Uttryck av human CD133 (human prominin-1) i cancerceller har postulerats för att vara en markör för stamhet och betraktas som en förmodad markör för cancerstamceller (CSC). Vi utformade en studie för att beskriva uttrycksmönstret för CD133 i normal hud och i epiteliala kutana neoplasmer. Sätt. Det immunohistokemiska uttrycket CD133 av fyrtiotre eccrine-och apokrina tumörer jämfördes med det som observerades i andra epiteltumörer i huden. Dessutom användes flödescytometri för att detektera CD133-uttrycket av fyra epitelhudneoplasmer, inklusive ett porokarcinom. Resultat. CD133-immunreaktivitet vid apikalen eller vid den apikolaterala ytan av celler som bildade glandulära strukturer observerades. Celler från fasta områden av godartade eller maligna tumörer färgades inte. De porokarcinom-härledda odlingscellerna visade 22% av CD133-positiva celler med flödescytometri, medan skivepitelcellkarcinomkulturer innehöll mindre än 0,1%. Slutsats. Dessa observationer indikerar att CD133 är en specifik markör för körteldifferentiering som kan inkluderas i diagnospanelen av kutana tumörer med möjlig ekkrin eller apokrin differentiering. Användningen av CD133-uttryck som markör för CSC bör dock tolkas med försiktighet vid hudförsök.

1. Introduktion

under de senaste åren har en växande mängd bevis rapporterats som stöder uppfattningen att förmågan att upprätthålla tumörbildning och tillväxt uteslutande ligger i en liten population av celler som kallas cancerstamceller (CSC). Sökning av markörer som visar stamcellsliknande fenotyp av dessa tumörinitierande celler är ett aktivt undersökningsområde, och flera stamcellsmarkörer har nyligen beskrivits i hudtumörer .

CD133 är den mänskliga homologen av mus prominin-1, ett glykoprotein med fem transmembrandomänceller som har fått anmärkningsvärd uppmärksamhet på grund av dess uttryck begränsat till olika somatiska stamcellsubpopulationer . Detta ytantigen upptäcktes som ett mål för en monoklonal antikropp definierad som Mab AC133, en markör uttryckt av en subpopulation av CD34-positiva hematopoietiska stamceller härledda från human fosterlever och benmärg . Därefter detekterades CD133 i olika humana normala vävnader, inklusive njure, prostata, hjärna och bukspottkörtel, och befanns vara specifikt associerade med mikrovilli och andra plasmamembranutsprång . Dessutom har detta antigen också identifierats i hematologiska maligniteter och i flera fasta humana neoplasmer, inklusive glialtumörer, prostatakarcinom, njurkarcinom, hepatokarcinom, kolorektalt karcinom och malignt melanom . Syftet med många av dessa studier var att bestämma förekomsten av CSC, definierad som en liten grupp cancerceller som har kapacitet för självförnyelse, tumörinitiering och underhåll av tumörtillväxt. Antikroppar som rutinmässigt används för rening av AC133-positiva celler riktar sig mot dåligt karakteriserade glykosylerade epitoper av osäker specificitet. Även om den funktionella aktiviteten hos CD133 fortfarande är kontroversiell och dess fysiologiska funktion ännu inte är bestämd , blir det tydligt att detta cellytprotein är en unik markör för både plasmamembranutsprång och membranmikrodomäner . Det har föreslagits att CD133 på denna cellulära plats kan fungera som en regulator för membranlipidkomposition eller det kan delta i mekanismerna för cellpolaritet och migration .

i tidigare studier som rapporterar CD133 immunohistokemisk färgning av human glandulär epitel, såsom spottkörtlar, lacrimala körtlar, bukspottkörtelkanaler, endocervikala körtlar och svettkörtlar, har ett märkligt mönster av CD133-uttryck beskrivits . I dessa epitel har CD133 visat sig vara lokaliserad till plasmamembranutsprång vid de apikala områdena i polariserade celler. Ett liknande CD133 apikalt cytoplasmiskt färgningsmönster av celler som omger en lumen har också observerats i karcinom från äggstock, kolon eller bukspottkörtel .

upptäckten av CD133-antikroppsfärgnings svettkörtelceller fick oss att utforma en studie som vi nu rapporterar för att utvärdera uttrycket av CD133 i hud-ekkrina och apokrina tumörer.

2. Material och metoder

2.1. Fall

en retrospektiv sökning hämtade 43 tidigare diagnostiserade hud eccrine och apokrina adnexala tumörer från filerna vid Institutionen för patologi vid Albacete Universitetssjukhus. Glasskivor, paraffinblock och histopatologiska rapporter från alla fall erhölls. Slides were reviewed and adnexal skin tumors were diagnosed according to the criteria of the World Health Organization (WHO) classification , including eccrine spiradenoma (), nodular hidradenoma (), eccrine hidrocystoma (), poroma (), porocarcinoma (), syringocystadenoma papilliferum (), chondroid syringoma (), syringoma (), cylindroma (), hidradenoma papilliferum (), apocrine hidrocystoma (), microcystic adnexal carcinoma (), and apocrine carcinoma (). Fall av basalcellkarcinom () och skivepitelcancer () inkluderades också i denna studie för att jämföra resultaten erhållna i dessa neoplasmer med de som erhållits i svettkörteltumörer. För att utvärdera CD133-uttrycket i normal hud analyserade vi hud från olika områden erhållna från marginalerna på sex kirurgiskt resekterade tumörer i huden och från tre obduktioner.

för odling av hudcancerceller erhölls sju prover från humana hudtumörer som motsvarade ett eccrine porokarcinom och sex skivepitelcancer. Färsk vävnad från dessa fall ingick i Dulbeccos modifierade Eagle ’ s medium (DMEM), kompletterat med penicillin/streptomycin och fungizon, omedelbart efter kirurgisk resektion.

2.2. Immunohistokemi

Formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssektioner 4 kg breda skars, deparaffiniserades i xylen och rehydrerades i en graderad serie etanol. Endogen peroxidasaktivitet blockerades med 3% H2O2 i 5 minuter. Diabilder behandlades med värmeinducerad epitop hämtning och immunostained med tre olika anti-CD133 monoklonala antikroppar: Ac133 monoklonal antikropp, 293c3 monoklonal antikropp och ac141 monoklonal antikropp (alla från Miltenyi Biotec, Tyskland). Antikroppar testades vid olika utspädningar och inkubationstider. CD133-detektering utfördes med hjälp av EnVision-systemet-HRP (Dako, Glostrup, Danmark) i en DakoCytomation Autostainer-plattform, enligt tillverkarens instruktioner. Diaminobenzidin (DAB substrate system, Dako, Glostrup, Danmark) användes som kromogen. Från de tre olika anti-CD133-antikropparna som testades arbetade endast en, ac133 monoklonal antikropp, i paraffin. De andra två testade antikropparna misslyckades eftersom sektioner inkuberade med dessa antikroppar inte visade någon färgning eller eftersom den immunfärgning som observerades när höga koncentrationer av antikropparna användes ansågs ospecifik (liknande färgning observerades i negativa kontroller). Den monoklonala antikroppen AC133 gav tillförlitliga resultat på de testade paraffininbäddade sektionerna. Vi etablerar för denna antikropp en 1: 10 utspädning och 40 minuters inkubation vid rumstemperatur som de föredragna arbetsförhållandena. Därefter utfördes alla experiment under dessa förhållanden.

delar av huden med normala svettkörtlar användes som positiva kontroller. Dessutom användes normala svettkörtlar från huden intill neoplasmerna som interna positiva kontroller när de var närvarande i sektionerna. Negativa kontroller utfördes genom att utelämna Anti-CD133-antikroppen under den primära antikroppsinkubationen. immunohistokemisk färgning av fasta områden och av acinära eller duktala strukturer från tumörerna utvärderades separat. CD133-färgning graderades med användning av en semikvantitativ skala. Acinar-eller duktala strukturer utvärderades enligt följande: ( – ) ingen färgning; ( + ) färgning av sekretoriskt material i lumen av isolerade kanaler eller acini och/eller svag färgning av den apikala eller luminala gränsen för få kanaler eller acini; ( ++ ) tydlig färgning av den apikala eller luminala gränsen för de flesta kanaler eller acini närvarande i tumören; ( + + + ) färgning av den apikala eller luminala gränsen för alla kanaler eller acini närvarande i tumören. CD133-uttryck utvärderades av två senior patologer (EP och SYNC) på ett blindat sätt utan kunskap om klinisk och patologisk information. I fall av avvikande bedömningar omvärderades diabilder av båda patologerna under ett flerhuvudesmikroskop och ett avtal erhölls.

2.3. Odling av cancerceller från hudtumörer

Tumörfragment disaggregerades mekaniskt och enzymatiskt genom digestion med kollagenas typ IA (2 mg/mL) (Gibco, Invitrogen) i Hank: s balanserade saltlösning (HBSS) vid 37 kg C under 2 timmar. Celler filtrerades genom en 40 occurm nylonnät och dissocierades ytterligare genom seriell passage genom serologiska pipetter. Digererad vävnad centrifugerades vid 1000 kcal g i 10 minuter och pelleten tvättades flera gånger för att erhålla en enda cellsuspension. Isolerade celler pläterades i kulturkolvar och odlades vid 37 kg C i DMEM/F12-media innehållande 10% fetalt bovint serum och kompletterades med penicillin/streptomycin och fungizon.

2.4. Flödescytometrianalys

alla experiment utfördes på cellsuspensioner beredda vid första passage av primärkultur från tumörer. Celler lossades med användning av 0,02% EDTA i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 15 minuter vid 37 kcal C och tvättades med PBS före färgning. Cellsuspensioner justerades till celler / mL och inkuberades med den rekommenderade antikroppsutspädningen (1/10) i 20 minuter i mörkret (4 msk C). Prover utan primär antikropp användes som negativa kontroller. Antikroppen som användes var anti-CD133 / 1 (AC133)-APC (Miltenyi Biotec). Obundna antikroppar avlägsnades genom tvättning med PBS, och celler resuspenderades i en lämplig buffertvolym. Analys utfördes på en lsrii-flödescytometer (BD Biosciences). Data analyserades med hjälp av Summit V5. 0.1. 5170 programvara (Dako).

3. Resultat

3.1. Kliniska fynd

patientkohorten bestod av 29 män och 23 kvinnor, i åldern 24 till 90 år (median, 49 år). Presentationsplatsen var variabel, de flesta lokaliserade på huvud-och nackregionen. Kliniska data sammanfattas i Tabell 1. Alla patienter genomgick excisional hudbiopsi.

3.2. Immunhistokemiska fynd

från de tre olika monoklonala antikropparna testade på formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssektioner , och i enlighet med tidigare rapporter gav endast AC133 känsliga och tillförlitliga resultat. Det övergripande immunhistokemiska färgningsmönstret som observerades med denna antikropp var nära besläktat med vävnadsarkitektur. Färgningen lokaliserades huvudsakligen till den apikala ytan av celler som bildade duktala eller glandulära strukturer. Immunhistokemiska fynd som observerats i dessa strukturer med anti-CD133-antikroppen sammanfattas i Tabell 1 och beskrivs nedan. Fasta områden från någon av de undersökta adnexala tumörerna eller från de testade basalcells-och skivepitelcancer misslyckades med att visa CD133-positivitet.

3.2.1. Normal vävnad

CD133-uttryck observerades vid endoluminal eller apikal yta av cellerna i acini-och terminalkanalerna i normala eccrinkörtlar (Figur 1(A)). Intercellulära canaliculi bildade vid det laterala membranet av eccrine celler belägna i den sekretoriska delen av normala svettkörtlar var tydligt färgade (Figur 1(b)), såväl som utsöndringen som finns i lumen av eccrine kanaler. Färgning av normala apokrina körtlar vid terminalkanalerna observerades vid cellernas apikala gräns, men med en fläckig fördelning. I acinära områden av dessa körtlar, där den apokrina halshuggningssekretionen var uppenbar, visade CD133 endast en svag eller negativ färgning.

(a)

(b)

(a)
(b)

figur 1

CD133 i normala ekkrina körtlar fläckar cellernas endoluminala yta och svettkörtelns utsöndring (a). Intercellulära canaliculi vid sidmembranet hos eccrine-celler observeras också (b).

3.2.2. Tumörer

CD133 uttrycktes inte i något av de testade skivepitel-eller basalcellkarcinom. Med hjälp av ac133-antikroppen visade de adnexala tumörerna som analyserades i detta arbete följande färgningsmönster (sammanfattat i Tabell 1).

godartade tumörer med Eccrine eller apokrin differentiering. Alla eccrine spiradenomfall presenterade CD133-immunreaktivitet vid det apikala membranet i de kanalliknande strukturerna som finns i tumörknutorna. Den luminala ytan av epitelcellerna som bildar de unilokulära cysterna i alla de analyserade eccrine hidrocystomfallen var också positiva. Kanaler och små cyster närvarande i tre av de sex eccrine poroma-fallen visade intensiv färgning av det inre cellskiktet från de prolifererade tubulerna, och denna färgning var belägen vid cellernas endoluminala gräns. De andra tre analyserade poromfallen visade samma färgningsmönster i de flesta tubuler, men med ett (++) eller (+) färgningsmönster av CD133-positivitet. Kanalliknande strukturer, närvarande i de fyra cylindroma fallen, visade också immunreaktivitet vid epitelcellernas apikala membran. Färgningen av de fyra kondroidsyringomerna var framträdande, och alla närvarande kanaler, som bildade tillfälliga förgreningsstrukturer, visade intensiv positivitet vid det apikala membranet (Figur 2). De dilaterade och slingrande kanalerna, som leder in i cystiska utrymmen i alla syringocystoadenoma papilliferumfall, visade immunreaktivitet vid den apikala delen av epitelcellerna eller vid cystens luminala yta, med en intensitet som varierade från (++) till (+++) (Figur 3). De fem fall som diagnostiserades som nodulärt hidradenom visade isolerade kanalliknande strukturer som var positiva för CD133 med en apikal färgning av cellerna som bildade tubulerna (Figur 4) som varierade i intensitet från (++) till (+++). De två hidradenoma papilliferum-fallen visade också uttryck av CD133 vid den apikala delen av körtelstrukturerna. Endast två av de sex testade syringomfallen visade konsekvent färgning vid den luminala ytan av de små kanalerna som bildade tumörerna, som vanligtvis fodrades av två lager av kubiska epitelceller. De apokrina hidrocystomfallen visade inte någon positiv immunreaktivitet.

Figur 2

CD133 positivitet vid den inre ytan av kondroid syringom förgreningsrör. Ingen färgning av stromalcellerna eller av yttre epitelceller noteras.

Figur 3

papillära projektioner av syringocystadenoma papilliferum fodrade med pseudostratifierat kolumnarepitel är CD133 positiva. Positiviteten är mycket intensiv vid endoluminalytan.

Figur 4

linjär CD133-färgning av kolumnceller som fodrar tubuler i ett hidradenomfall. Endast celler som ligger på tubulans inre yta är färgade.

maligna tumörer med ekkrin eller apokrin differentiering. Ingen immunreaktivitet kunde påvisas vid den luminala ytan av cystorna i fallet diagnostiserat som apokrin karcinom. De två mikrocystiska adnexala karcinomerna som analyserades i denna studie visade stark CD133-positivitet vid den apikala ytan av celler som bildade den lilla och stora lumina i de rörformiga strukturerna. CD133-immunfärgning kunde demonstreras vid de mycket atypiska cellerna som omringade de rörformiga strukturerna i porokarcinomfallet (Figur 5).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 5

Ductal structures of porocarcinoma seen in H&E sections (a) are CD133 positive (b).

3.3. Karakterisering av primära kulturer från humana hudtumörer och Flödescytometrianalys

sju prover härledda från humana hudtumörer behandlades med målet att erhålla singelcellsuspensioner. På grund av ett otillräckligt antal celler erhållna från tumörerna eller till svamp-eller bakteriekontaminering odlades endast fyra prover framgångsrikt och analyserades för cellytan CD133/1 epitoputtryck. Dessa framgångsrikt odlade biopsier inkluderar ett eccrine porokarcinom och tre skivepitelcancer. Mikroskopisk undersökning av de odlade cellerna avslöjade olika morfologier som varierade konsekvent till den histologiska tumörtypen. Celler från skivepitelcancer visade epitelioid eller spindelcell utseende medan eccrine porokarcinom härledda celler hade mer rundad form och grupperas tillsammans i Öar av små och atypiska celler. Närvaron av epitelceller i dessa kulturer bekräftades genom E-cadherin och EpCam positivt uttryck som epitelmarkörer.

för att bestämma om hudtumörcellkulturer innehöll en population av CD133-positiva celler, använde vi flödescytometri för att undersöka uttrycket av CD133/1 ytmarkör med AC133-antikroppen. Alla prover från skivepitelcancer innehöll mindre än 0,1% av positiva celler, medan nästan 22% av positiva celler detekterades i eccrine porokarcinom. Figur 6 visar representativa histogram från de två utvärderade hudtumörtyperna.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 6

CD133 expression profiles in human skin primary tumour cells. Analysis of CD133/1 expression in samples from eccrine porocarcinoma (b) and from squamous cell carcinoma (a). Flow cytometry of porocarcinoma derived cell cultures show a 22% of CD133/1 epitope positive cells and CD133 immunostaining. Skivepitelcancer visar negativ färgning för CD133 och 0% positiva CD133-celler på flödescytometri.

4. Diskussion

framsteg i kutan stamcellsbiologi och i karcinogenesförståelse beror starkt på tillgängligheten av markörer som är specifika för distinkta stamcellspopulationer . Kända markörer för hudstamceller eller stamceller som har identifierats i andra organ eller tumörer kan användas för detektion av kutan CSC. En av dessa markörer som kan testas i huden är CD133-proteinet (prominin-1). De första data som rapporterade CD133-uttryck med användning av den monoklonala antikroppen AC133, producerad mot ett nytt stamcellsglykoproteinantigen, visade att CD133 selektivt uttrycktes på CD34 hematopoietiska stam-och stamceller härledda från human fosterlever och benmärg, såväl som från blod . Sedan dess har flera rapporter visat att prominin – 1 kan användas för att identifiera och isolera mänskliga stamceller från olika källor, inklusive det hematopoietiska systemet , prostata , bukspottkörteln eller njurarna . Dessutom har monoklonala antikroppar mot CD133 använts för identifiering och isolering av en förmodad population av tumörinitierande celler eller CSC i ett antal humana karcinom och i malignt melanom . I gliom har det ökade antalet CD133-positiva cancerceller, liksom närvaron av kluster av dessa celler, föreslagits som en signifikant prognostisk faktor, oberoende av andra faktorer som tumörkvalitet . Andra studier, som använder olika och nya anti-CD133-kloner, har dock föreslagit att uttrycket av CD133 inte är begränsat till stam-och stamceller och verkar uttryckas i vuxna epitelceller i mus och mänskliga vävnader . Till exempel, med hjälp av en CD133-klon, kallad 13a4, härledd från mus prominin-1, Weigmann et al. demonstrerade uttryck av prominin – 1 vid den apikala ytan av neuroepiteliala celler och vuxna njure proximala tubuli, och Karbanov Avsugningar et al. , med användning av en monoklonal antikropp (80b258) genererad mot en human prominin-1-polypeptid, observerad immunreaktivitet i vuxna mänskliga vävnader, särskilt i glandulär epitel. Dessa resultat indikerar behovet av ytterligare studier för att klargöra huruvida AC133-antigenet, som tidigare hittades i flödescytometri för att begränsas till CD34-positiva stamceller, uttrycks i vuxna epitelceller . Det har föreslagits att det observerade variabla CD133-uttrycket är relaterat till differentiell affinitet hos de olika antikropparna till olika glykosylerade former av CD133 . Den monoklonala antikroppen AC133 känner igen en glykosylerad epitop av prominin-1, och intressant kan glykosyleringen av detta protein förändras beroende på tillståndet för cellulär differentiering, eller det kan förändras under processen med malign transformation . I vår studie om mänskliga hudtumörer har vi observerat att CD133-uttryck är starkt beroende av bildandet av svettkörtelkanaler och svettkörtelsekretion. CD133-immunreaktivitet sågs huvudsakligen på den apikala / endoluminala ytan av kanalliknande strukturer eller cyster hos de flesta godartade och maligna ekkrina tumörer. Ingen av de studerade tumörerna, varken godartade eller maligna, presenterade isolerade eller små kluster av CD133-positiva neoplastiska celler i fasta områden. Liknande CD133-färgningsmönster av det apikala cellmembranet i sekretoriska celler har tidigare rapporterats i normala rörformiga strukturer såsom njurproximala tubuler eller i tumörkörtlar av kolorektal cancer . CD133-färgning hittades också vid den apikala/endoluminala ytan av celler som bildade en lumen i ovariekarcinom . I dessa fall har den apikala platsen för CD133 varit inblandad i en möjlig sekretorisk funktion av denna molekyl. Den morfologiska fördelningen av CD133-färgningen visar en korrelation med välkända sekretoriska strukturer av normala vävnader och körtlar, vilket tyder på en funktionell relation av CD133 med utsöndring. Faktum är att i vår studie visade tumörer som misstänks ha sitt ursprung i svettkörtens duktala områden, som syringom, ett mindre intensivt färgningsmönster än de som härstammar från de acinära delarna.

CD133-uttrycket på cellytan hos differentierade tumörceller är ett argument mot CD133 som en specifik cancerstamcellsmarkör i huden. Förekomsten av en liten CD133+ CSC-population kan emellertid inte helt uteslutas, eftersom det har visats i andra organ, där CD133 uttrycks på cellytan hos både CSC och differentierade tumörceller .

sammantaget visar våra resultat ett specifikt immunhistokemiskt uttryck av ac133-antikroppen vid sekretorisk yta av differentierade normala och neoplastiska celler i ekkrina körtlar. Experiment som använder denna antikropp som markör för CSC i huden bör tolkas med försiktighet. Ac133-antikroppen är en känslig och specifik markör för kutan glandulär differentiering, användbar för diagnos av tumörer med möjlig eccrine eller apokrin differentiering.

erkännanden

författarna är tacksamma för Pedro Javier Benito Castellanos och Laura Abenda Exceptiono för teknisk support.