resultat

karakterisering av Plasmacytoid dendritiska celler i tunntarmen.

vi tillämpade standardprocedurer för att isolera immunceller som finns i epitelet (intraepitelial, IE) och LP från tarmen. I båda cellpreparaten fann vi en distinkt population av CD11c+B220+Ly6C+ celler som stod för upp till 1% av alla celler. Till skillnad från pDC var myeloid (m)DC (CD11c+mhcii+CD3−B220−Ly6C−) endast närvarande vid mycket låga tal i IE-preparatet (Fig. 1 A). Både pDC för lp och IE-beredningen visade låga nivåer av ytmhc-klass II-uttryck (Fig. 1 A). Ytterligare analys avslöjade att CD11c + B220 + Ly6C + – celler i båda preparaten uttrycker enhetligt PDC-markörerna PDCA1 såväl som 120g8 (Fig. 1 B). Cytospiner från sorterade pDC (CD11c + B220 + Ly6C+) och myeloid DC (mDC) av IE-preparatet avslöjade en rund och slät, plasmacellliknande morfologi av pDC, medan mDC visade de karakteristiska dendriterna (Fig. 1 C). För att ytterligare karakterisera lokaliseringen av pDC i tarmen tillämpade vi anti-B220, anti-120g8 och anti-CD3 mAb i immunhistologi. Mikrografer togs slumpmässigt från sektioner och, såsom avbildas i Fig. 1 D, positioneringen av 120G8+B220+CD3− celler bestämdes i förhållande till epitelceller med hjälp av bildanalys (analys; Olympus, Hamburg, Tyskland). Utvärdering av positioneringen av 150 PDC i 6,9% av dessa celler var tydligt belägna i epitelcellskiktet medan ytterligare 6,7% var belägna inom ett avstånd av 5-10 m från epitelcellernas apikala spets (Fig. 1 D). Dessa data visar att en viss mängd av pDC lokaliseras inom eller nära tarmepitelet, medan >80% av de analyserade cellerna placerades på avstånd >15 occurm, vilket gör dem till LP-celler (Fig. 1 D). Eftersom liknande antal pDC var närvarande i IE-och LP-preparatet efter standardisoleringsprocedurer är det för närvarande oklart om pDC i LP förorenar IE-preparatet eller om pDC som lokaliserar till epitelet isoleras mer effektivt. Eftersom vi knappast hittar någon mDC inom IE-förberedelsen gynnar vi den senare möjligheten. Ändå återstår att avgöra om båda populationerna tjänar olika funktioner eller tillhör en gemensam cellpopulation. Eftersom PDC av IE-preparatet, i motsats till pDC av LP-preparatet, kan isoleras genom ganska skonsamma förfaranden, användes uteslutande PDC av IE-preparatet för funktionella analyser i denna studie.

Ccr9-uttryck på Intestinal pDC.

för att identifiera de molekylära mekanismerna som tillåter migrering av pDC till tarmen analyserade vi uttrycket av homingmolekyler. Även om det är väl etablerat att integrin aE (CD103) förmedlar lymfocytadhesion till epitelceller i tarmen, misslyckades vi med att identifiera uttryck för detta integrin på intestinal pDC. På samma sätt CCR7 (Fig. 1 E), väsentligen involverad i homing av lymfocyter i perifera lymfoida organ uttrycks inte av PDC i tarmen. I kontrast, vi observerade höga nivåer av CD18 (aug.2-integrin) och mellanliggande nivåer av ug. 4 ug. 7 medan ug. 50% av PDC express p-selectin ligander (Fig. 1 E). Av intresse uttryckte den stora majoriteten av intestinala pDC höga mängder av kemokinreceptorn CCR9 (Fig. 1 E), medan mDC för LP uttryckte nej eller låga nivåer av CCR9 .

CCR9 uttryck av pDC isolerat från olika lymfoida organ.

Med tanke på det enhetliga uttrycket av CCR9 på intestinal pDC analyserade vi uttryck av CCR9 på pDC isolerad från sekundära lymfoida organ inklusive mjälte, huddränerande LN, mesenterisk LN och Peyers fläckar (PP; Fig. 2 A) och används CD4 + CD8 + tymocyter, kända för att uttrycka höga nivåer av CCR9, som en positiv kontroll (11); Fig. 2 B). Intressant är att endast en bråkdel av pDC närvarande i något av dessa organ uttryckte CCR9 (Fig. 2 A), medan 95% av den pDC som isolerades från BM genomdrev denna receptor (Fig. 2 C). De flesta BM PDC uttrycker också CCR5 och CXCR3 medan CCR2 är närvarande på endast ungefär 25% av cellerna. CXCR4, känd för att behålla celler till BM, uttrycks endast mycket svagt (Fig. 2 C). Tillsammans visar dessa data att pDC är utrustade med olika kemokinreceptorer innan de frigörs från BM. Denna funktion möjliggör förmodligen homing inte bara till inflammationsplatser utan också till den icke-inflammatoriska tarmen.

Kemotaxisanalys av Flt3L-expanderad pDC.

baserat på det starka uttrycket av CCR9 på BM och intestinal pDC jämförde vi migrationskapaciteten hos pDC och mDC mot kemokin CCL25/TECK, som är den enda kända liganden för denna receptor (12). Frekvensen av pDC varierar mellan olika musstammar och det är välkänt att till exempel C57BL/6 (B6) möss har mycket mindre pDC än 129sv-möss (13). Oavsett den genetiska bakgrunden är dock antalet pDC som kan isoleras från musvävnader otillräckligt för att utföra standard in vitro-kemotaxisanalyser. För att övervinna denna begränsning utvidgade vi DC-populationen in vivo genom att implantera en Flt3-L-utsöndrande tumörcellinje (B16-FL) i B6-möss i 14 dagar (14).

under denna tidsperiod ökade andelen CD11c+ – celler i mjälten från 3% till 30-35% (data visas inte). Åttio procent av den in vivo expanderade PDC uttryckte CCR9, med nivåer som mycket liknar de som finns på BM pDC (Fig. 2 C och Fig. 4 C) medan in vivo expanderad mDC uttryckte endast små mängder av denna receptor (SI Fig. 6B). Mjälten PDC berikades av CD11c+ MACS-sortering, vilket resulterade i 95% renhet för CD11c+ celler som innehöll 15% ly6c+B220+ PDC i enlighet med den tidigare versionen av PDC. In vitro transwellmigrationsanalyser avslöjade starkt kemotaktiskt svar av pDC till CCL25, såväl som till CXCL9, en ligand för CXCR3 och till CXCL12, vilket är en ligand för CXCR4. Endast ett svagt svar observerades mot CCL19, som fungerar som en ligand för CCR7. mDC visade lite kemotaktiskt svar mot CCL25 och CXCL9 och måttligt svar mot CXCL12 och CCL19 (Fig. 3 A).

minskat antal pDC i tunntarmen hos CCR9-bristfälliga möss.

baserat på dessa observationer karakteriserade vi fördelningen av pDC i ccr9-bristfälliga möss. Vi hittade liknande procentsatser av pDC i lunga och lever (SI Fig. 7) såväl som i inguinala och mesenteriska lymfkörtlar medan antalet mjälten pDC ökade något i CCR9−/− möss. Däremot observerade vi en >90% minskning av tarmen och en 50% minskning av PP pDC (Fig. 3 B).

PDC migrerar företrädesvis till tunntarmen.

baserat på de resultat som hittills beskrivits verkade det troligt att pDC kräver CCR9 för homing till tunntarmen. För att bevisa denna hypotes överförde vi adoptivt celler från B6− och CCR9−/-givare som bar en Flt3-L-utsöndrande tumör i 14 dagar. Under påverkan av Flt3L expanderade pDC i liknande utsträckning i B6 och CCR9−/− möss (Fig. 4 A och Si Fig. 8) och var oskiljbara när det gäller uttrycket av CCR2, CCR5 och CXCR3 medan CCR9 endast detekterades på pDC härledd från B6 men inte CCR9-bristfälliga givare (Fig. 4 C). Utan ytterligare rening märktes splenocyter av dessa givare med 5 (6)-karboxifluoresceindiacetat N-succinimidylester(CFSE) respektive 5 (6)-karboxitetrametylrhodamin N-succinimidylester (TAMRA). En blandning av WT-och CCR9-bristfälliga celler, justerade för att innehålla lika många pDC, överfördes IV i B6-mottagare. Efter 18 h överföring analyserade vi först sammansättningen av adoptivt överförda WT-celler närvarande i IE såväl som LP-preparatet och märkte att 54% och 25% av alla celler som återhämtades från IE respektive LP-fraktionen var pDC (Fig. 4 B). Dessa fynd visar att bland de olika cellpopulationerna överförde pDC Hem mest effektivt till tarmen. Dessa konkurrenskraftiga överföringar avslöjade också att CCR9-bristfällig pDC till stor del försämras i sin förmåga att hem till tarmen, vilket återspeglas av det låga migrationsförhållandet mellan CCR9-bristfällig vs. WT pDC som finns i IE-och LP-beredningen (Fig. 4 D). Däremot migrerade CCR9-brist och B6 pDC med liknande effektivitet som perifera och mesenteriska lymfkörtlar (Fig. 4 D). Cellmärkningens natur hade ingen inverkan på dessa experiment eftersom byte av färgämnen mellan B6 och CCR9−/− celler gav identiska resultat (data visas inte). Även om dessa data tydligt visar att pDC kräver CCR9 för effektiv homing till tarmen, bör det nämnas att trafficking egenskaper pDC från Flt3-ligand behandlade möss kan skilja sig från de som finns i fysiologiska situationer.

PDC rekryteras till inflammerad tarm.

eftersom det är känt att pDC spelar en viktig roll i antiviral immunitet (4, 10) spekulerade vi att pDC kan rekryteras till tarmen under inflammatoriska processer för att stärka första linjens försvar. Kolera toxin (CT) är känt för att inducera tarminflammation när det administreras oralt och det har rapporterats att inom 2 timmar efter oral applicering ökar antalet mDC som tillfälligt rekryteras till tarmen 4 gånger (15). Vi observerade att, förutom mDC, ökade PDC-nummer också 3-faldigt när man matade B6-möss med 10 Baccarat CT (Fig. 4 E). Av intresse resulterade Den identiska experimentella inställningen aldrig i någon ökning av pDC varken i IE eller LP-beredningen av ccr9-bristfälliga möss efter 1, 2 eller 3 h CT-behandling (Fig. 4 E och data som inte visas). Det specifika kravet på CCR9 på pDC för deras rekrytering till tarmen under inflammatoriska processer bekräftades genom adoptivöverföring av WT och CCR9-bristfällig pDC till ccr9-bristfälliga mottagare följt av applicering av CT som beskrivits ovan. Medan adoptivt överförd WT pDC var rikligt närvarande i IE-och LP-beredningen, var CCR9-bristfällig pDC nästan helt utesluten från dessa fack (Fig. 4 F). Tillsammans visar dessa resultat att under inflammatoriska händelser kan pDC rekryteras till tarmslemhinnan och att denna mekanism förlitar sig i stor utsträckning på CCR9.

en roll för Intestinal pDC för snabb mobilisering av LP Myeloid DC.

det har nyligen visats att oral applicering av TLR7 / 8 ligand resiquimod (R848) resulterar i snabb mobilisering av LP DC och att TNFa, eventuellt släppt av pDC, är involverad i denna process (16). Vi spekulerade således att intestinal pDC kan vara källan till TNFa som potentiellt utlöser mobiliseringen av närliggande mDC. För att testa denna hypotes stimulerade vi in vitro B6 pDC av IE-och LP-beredningen för 16 h med R848. Faktum är att pDC utsöndrade avsevärda mängder TNFa men misslyckades med att producera några detekterbara mängder IL-2, IL-4, IL-5 eller IFNy (Fig. 5 A). Vi analyserade sedan mobiliseringen av LP mDC in vivo efter oral applicering av R848. Medan obehandlade B6− och CCR9−/ – möss inte skilde sig åt avseende närvaron av intestinal mDC (Fig. 5 B), inom 2 h oral R848 inducerade mobiliseringen av 60% av MDC i WT men endast 10, 8% i CCR9−/− möss. Viktigt är att en gång CCR9-bristande möss i. v. fick mjält pDC av Flt3L-behandlade WT-givare 16 h tidigare oral applicering av R848, kunde denna brist i intestinal mDC-mobilisering helt räddas (Fig. 5 C). Dessa experiment visar att en CCR9-beroende homing av pDC till tarmen är involverad i snabb mobilisering av intestinal mDC efter oral applicering av en TLR7/8-ligand. Eftersom det har visats av andra i råttmodellen att tillämpningen av LPS också inducerar mobilisering av LP mDC (17), tillämpade vi 50 occurg av LPS IP till WT och CCR9-bristfälliga djur. Av intresse, under dessa experimentella förhållanden misslyckades vi med att observera någon skillnad mellan WT och CCR9-bristfälliga djur angående mobilisering av LP mDC (SI Fig. 9).