studiedesign

VX-765-studie: fem månader gammal fordonsinsprutad WT (WT + vehicle; n = 18) och J20-möss (J20 + vehicle: n = 14) och VX-765-injicerade J20-möss (J20 + VX-765: n = 13) möss utvärderades longitudinellt vid fem olika tidpunkter: baslinjen före behandling (baslinje obehandlad J20 grupperades tillsammans; n = 19), Efter tre IP-injektioner per vecka av VX-765 eller vehikel (behandling 1), Efter ytterligare sex injektioner under 2 veckor (behandling 2), efter 4 veckors tvättperiod (WO) och efter ytterligare tre injektioner på 1 vecka (behandling 3) (Fig. 1a). Alla testade djur inkluderades i analyserna såvida inte (a) djuret dog under experimentet eller (b) djuret inte svarade beteendemässigt. Totalt 25 kullar, spridda över fyra olika kohorter och testade vid olika tidpunkter, användes. Tre av dessa kohorter genomgick nor och open field testing, medan kohort 4 användes för Barnes maze. Efter att djur testades vid baslinjen för att bekräfta att J20-djur hade beteendeunderskott, tilldelades J20-djur slumpmässigt till antingen vehikel-eller VX-765-behandling oberoende av beteendeprestanda. Av alla använda djur visade fyra J20-möss inga beteendeunderskott i början av experimentet och användes inte. Två J20 + fordonsmöss rörde sig inte alls under experimentet och deras beteendedata utesluts; dessa djur hölls dock och användes fortfarande för analys efter slakt.

casp1-valideringsstudie: för att validera Casp1-specifika effekter av VX-765 genererades J20− möss på en Casp1−/ – bakgrund. Sjuttiotre möss användes (n = 12-13 per genotyp, sex olika genotyper), som alla föddes genom in vitro fertilisering (IVF) från 35 donatorkvinnor. Avelsdetaljer beskrivs i avsnittet djurstudier nedan. Alla möss utvärderades beteendemässigt mellan 7 och 8 månaders ålder, och inga djur uteslöts från denna studie.

alla möss offrades och bearbetades vid 8 månaders ålder. Beteendemässig poäng blindades för musgenotyp och behandling, och alla djur tilldelades slumpmässigt för antingen biokemisk eller histologisk analys och analyserades blint.

VX-765, VRT-043198 IC50-analyser på rekombinanta kaspaser

djurstudier

alla djurförfaranden följde Canadian Council on Animal Care guidelines och godkändes av McGill University Animal Care committee. Den transgena muslinjen J20 (Jax lager nr. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) uttrycker den svenska (670/671KM GHz NL) och Indiana (717V f) humana appmutationer under PDGF-. Manliga J20-möss användes som uppfödare och deras spermier användes för IVF-koloniutvidgning.

genotyper bestämdes genom svansbiopsi och RT-PCR. Möss grupperades (2-4 djur per bur) i vanliga makrolonburar under en 12-h omvänd ljus/mörk cykel och kontrollerade miljöförhållanden. Mat och vatten var tillgängliga Ad libitum.

VX-765 (Adooq Bioscience, Irvine, CA) löstes i 20% cremophor i dH2O (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada) och administrerades intraperitonealt. Fordonsbehandlade J20-och WT-möss fick endast cremophor.

blod–hjärnbarriärpermeabilitetsanalys

fem månader gamla J20-och WT-möss bedövades med isofluran och den högra halspulsådern separerades. Ett litet snitt gjordes längs karotidväggen och en mikrokateter infördes i ingången till den inre halspulsådern. Katetern fästes på plats med suturgänga. VX-765 (50 mg kg−1) infunderades vid 50 oc min−1 (90-120 oc total volym). Mikrokatetern lämnades ytterligare 5 minuter för att möjliggöra diffusion, varefter blod uppsamlades genom intrakardiell punktering. Musen var transkardiellt perfuserad med iskall saltlösning och hippocampus och cortex dissekerades ut. Prover skickades till Biopharmacy-plattformen (Universitjätte de Montreal) för vätskekromatografi och tandemmasspektrometrianalys.

beteendeanalys

öppna fält: lokomotorisk aktivitet mättes med hjälp av ett hvs2100 automatiserat spårningssystem (HVS Image, Hamptom, UK). Möss placerades i den öppna fältkammaren (40 40 cm 40 cm plexiglaslåda, inget tak och vitt golv) och fick utforska i 5 minuter.

Novel object recognition( NOR): möss exponerades för två identiska föremål i den öppna fältkammaren i 5 minuter. Två timmar efter förexponering placerades möss tillbaka i kammaren och exponerades för ett välbekant objekt och ett nytt objekt i 5 minuter. Möss exponerades för ett specifikt objekt endast en gång över olika testsessioner, och ny objektplacering motverkades inom varje behandlingsgrupp. Procentuella beröringar av det nya objektet under testfasen och diskrimineringsindex ((# berör roman − # berör bekant)/totala beröringar) bedömdes.

Barnes maze: Barnes maze-plattformen (91 cm i diameter, förhöjd 90 cm från golvet) bestod av 20 hål (vardera 5 cm i diameter). Alla hål var blockerade förutom ett målhål som ledde till en infälld flyktlåda. Rumsliga signaler, starkt ljus och vitt brus användes för att motivera mössen att hitta flykten under varje session. För anpassningsfasen utforskade varje mus plattformen i 60 s. varje mus som inte hittade flyktboxen styrdes till den och stannade där i 90 s. för förvärvsfasen följde varje försök samma protokoll, med målet att träna varje mus för att hitta målet och gå in i flyktboxen inom 180 s. möss förblev i lådan i ytterligare 60 s.fyra försök per dag, ungefär 15 min från varandra, utfördes i 4 dagar i rad. I sondtestet (dag 5) utförde varje mus en 90 s-försök. Målet var fortfarande beläget i samma position, men flyktboxen var blockerad. Latensen och felen för att nå målet, plus antalet muspakar till var och en av hålen (målpreferens) mättes. Y-labyrinten var sammansatt av en symmetrisk Y-formad labyrint med tre armar 120 kcal från varandra, betecknade A, B och C. djur placerades vid den distala änden av arm A och fick utforska labyrinten i 5 minuter. Totala armposter och spontan växling, definierad som på varandra följande poster i tre olika armar, registrerades. Procentuell växling bestämdes.

vävnadsbehandling

för immunhistokemi anestetiserades möss (n = 4-6 per grupp) med isofluoran och transkardiellt perfuserades med iskall saltlösning följt av iskall 4% paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) i 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning. Hjärnor fixerades i 10% neutralt buffrat formalin (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Kanada) i 16 timmar och överfördes till 70% etanol. Hjärnor var paraffin inbäddad och sektionerad vid 4 occurm.

för western blot och ELISA (n = 4-8 per grupp), bedövades möss cervicalt, hippocampus och cortex dissekerades ut och frystes omedelbart på torris. Proteiner extraherades i 5 kg volym/vikt med radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,25% Na-deoxicholate, 1 mm EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 kg ml−1 av Proteases Inhibitors Cocktail (Sigma-Aldrich)) på is med en vävnadshomogenisator (OMNI International, Kennesaw, GA, USA). Proverna centrifugerades (20 000 kg, 4 C) i 20 minuter, supernatanten återvanns och proteinet kvantifierades med BCA-metoden. Den RIPA-olösliga pelleten extraherades ytterligare i 70% myrsyra i dH2O, indunstades och resolubiliserades i 200 mM Tris-HCl, pH 7.5.

Immunohistologisk färgning

epitoper demaskerades i antingen citrat (10 mM Tris-Na Citrat, pH 6,0) eller EDTA (10 mM Tris-bas, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9.0) antigenhämtningsbuffert och immunostained med Dako Autostainer Plus automatiserad glidprocessor och EnVision Flex-system (Dako, Burlington, ON, Kanada). Efter deparaffinisering och rehydrering behandlades sektionerna peroxidas, blockerades i serumfritt proteinblock och immunosupphölls med följande antikroppar utspädda i EnVision Flex Antikroppsutspädningsmedel: 1:2000 rabbit anti-Iba1 (Wako 019-19741, Richmond, VA, USA), 1:8000 rabbit anti-GFAP (Dako Z-0334), 1:2000 rabbit anti-a Ukrainian1-40 (F25276, laboratorium utvecklat) och 1:xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx: 1000 mus antisynaptofysin (Sigma-Aldrich s5768). Sektioner behandlades med den medföljande lämpliga mus-eller kanin HRP-konjugerade sekundära antikroppen och visualiserades med DAB. Sektioner var hematoxylin motfärgad, uttorkad och täckt med Permount (Fisher Scientific). Sektioner skannades digitalt med MIRAX SCAN för analys (Zeiss, Don Mills, ON, Kanada). Efter deparaffinisering och rehydrering färgades diabilder med filtrerad 1% vattenhaltig Tioflavin-S (Sigma-Aldrich).

kvantitativ immunhistologisk analys

Iba1-positiva celler i cortex och främre delen av CA1-regionen i hippocampus kvantifierades med användning av en modifierad version av arealräkningsramen 48. Kortfattat kvantifierades varje femte bild (vilket resulterade i fyra sektioner per hjärna). Flera 80 bilder togs med MIRAX-skanningen inom intresseområdet och antalet Iba1-positiva celler räknades manuellt. Den numeriska densiteten (antal celler mm−3) i den främre CA1-regionen och cortex uppskattades. Ett minimum antal 150 träffar per område behövdes för att göra en tillförlitlig uppskattning. Ytterligare avsnitt räknades om vi inte kunde nå vårt minsta antal. Kvantifiering utfördes blindad för behandling och genotyp. ImageJ-programvara (NIH, Bethesda, MD, USA) användes för att mäta en ackumulation av Macau, GFAP och synaptofysin immunopositiv färgning i CA1-regionen och cortex. Fyra sektioner per hjärna analyserades och flera bilder togs inom varje sektion för att täcka CA1-regionen och cortex. Tröskeln justerades lika över alla hjärnor för att markera det färgade området, och partiklar analyserades för att bestämma det totala området för färgning. Resultaten uttrycks som total yta färgad per analyserad total yta (2 mm−2). Representativa bilder har bara beskärts för att överensstämma med storleksbegränsningar och har inte genomgått någon efterbehandling.

Western blotting

Musproteinprover (25-100 oc) framställdes i Laemmli (5% 2-oc-merkaptoetanol, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 oc ml−1 av Proteases Inhibitors Cocktail (Sigma-Aldrich)), kokades i 5 min och separerades med polyakrylamidgelelektrofores (sida). Proverna undersöktes med följande primära antikroppar, utspädda i antingen 5% icke-fet torrmjölk i Tris-buffrad saltlösning och 0,1% Tween – 20 eller PBS-blockerande buffert (Termovetenskaplig): 1:1000 mus anti-human a 6B1-16 (6E10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, USA), 1:2000 kanin anti-APP C-terminal (Sigma-Aldrich A8717), 1:1000 kanin anti-neprilysin (Abcam ab79423), 1:500 kanin anti-IDE (Abcam ab32216), 1:1000 kanin anti-Caspase-3 (cellsignalering 9665), 1:1000 mus antiaktiv Caspase-8 (cellsignalering 8592), 1:1000 kanin anti-Caspase-9 (cellsignalering 9504), och 1:5000 mus Anti-Bisexuell-aktin (Sigma-Aldrich a5441). Blottar detekterades med 1:5000 HRP-länkad anti-mus (GE Amersham NA9310, Montreal, QC, CA) eller 1: 5000 anti-kanin (Dako P0217) sekundär antikropp följt av ECL (GE Amersham). Immunoreaktiva band visualiserades med hjälp av ImageQuant LAS 4000 bildsystem (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA) och densitometriska analyser utfördes med Bildmätare analysprogramvara (Fujifilm USA). Ljusstyrka / kontrast av råa blottar justerades lika över hela bilden med Adobe Photoshop CS5-programvara (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) för att generera representativa bilder. Ingen ytterligare ändring gjordes. CanvasTM X software (Acd system, Plantation, FL, USA) användes för att skapa slutliga siffror. Raw blots för western blots finns i kompletterande Figur 11.

ELISA

Pro – och antiinflammatoriska cytokiner och A-nivåer i mushjärnan bestämdes med användning av elektrokemiluminescensimmunanalyssatser från Meso Scale Discovery (Rockville, MD, USA). Standarder och prover bereddes enligt tillverkarens protokoll och kördes i två exemplar. De tio-plex mus proinflammatorisk panel användes för mus hippocampal och kortikal och prover. Ett enda IL-1-kit för att mäta musplasma användes. Den fyra-plex mänskliga proinflammatoriska panelen användes för HPN-prover (se nedan). Fyra-panel human a 6e10 Kit användes för mus hippocampus och cortex, och HPN prover.

RNA-extraktion och cDNA-syntes

totalt RNA extraherades från mus hippocampus och cortex (n = 3 per grupp) med Qiazol (Qiagen, Valencia, CA, USA) följt av homogenisering med en 20-gauge nål. MiRNeasy mini kit, inklusive på-kolonn DNase behandlingssteg, användes för att rena total RNA (Qiagen). RNA-kvalitet och kvantitet bestämdes med användning av en spektrofotometer (DS-11 FX+, Denovix, Wilmington, DE, USA). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). Produkterna visualiserades på RedSafe (FroggaBio, North York, ON, Kanada) färgade 2% agarosgeler. Realtids-PCR-experiment utfördes med SYBR Green Taq Mastermix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA) på en Applied Biosystems 7500 Fast realtids-PCR-systemmaskin (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genförstärkning utfördes med följande primers: (18s) 5 ’- GTAACCCGTTGAACCCAT-3 ’och 5′ – CCATCCAATCGGTAGCG-3’; (IDE) 5 ’- ACTAACCTGGTGGTGAAG-3 ’och 5′ – GGTCTGGTATGGGAAATG-3′; (Neprilysin) 5′- TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC-3′ och 5′- CTCCCCACAGCATTCTCCAT-3’. Resultaten uttrycks som vik-induktionsvärden normaliserade för att betyda HPRT-och 18S-referensgener med Pfaffls metod.

mus synaptisk plasticitet RT2-Profiler PCR array

musen synaptisk plasticitet RT2 Profiler PCR Array (PAMM-126Z, Qiagen) profilerar uttrycket av 84 gener som är involverade i synaptiska förändringar under inlärning och minne och fem hushållningsgener (sackaros-aktin; sackaros-2-mikroglobulin; glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas, GAPDH;; Värmechockprotein 90 alfa (cytosolic), Hsp90ab1) med realtids-PCR. Totalt RNA (465 ng för varje prov) transkriberades omvänd (vilket inkluderade ett genomiskt DNA-elimineringssteg) efter tillverkarens protokoll (First Strand cDNA Synthesis Kit, Qiagen). PCR-reaktionen i realtid utfördes i en realtidscykler ABI 7500 (Fast Block) (Applied Biosystems) med användning av RT2 SYBR Green/ROX PCR master mix (Qiagen). Cykelförhållandena var som följer: 2 min vid 50 kg C, 10 min vid 95 kg C, 40 cykler, 15 s vardera vid 95 kg C och 1 min vid 60 kg C. Tröskel och baslinje ställdes in manuellt enligt tillverkarens instruktioner. Data normaliserades till det geometriska medelvärdet av de fem hushållningsgenerna och analyserades med den jämförande Ct-metoden (2−UCC).

Neuronal cellkultur och axonal degenerationsanalys

tolv till sexton veckor gammal fosterkortikal vävnad erhölls från Födelsedefektforskningslaboratoriet (University of Washington, Seattle, USA) i enlighet med ett godkänt protokoll av McGill institutional review board. HPN odlades från hjärnor som dissocierades med trypsin, behandlades med deoxiribonukleas I, och filtrerades genom 130, 70, och 30 occurm nylon mesh21. Dissocierade celler centrifugerades i 10 minuter vid 300 kg och resuspenderades i minimalt essentiellt medium (MEM) med Earles salter och kompletterades med 5% dekompletterad BCS, 1 kg Penicillin-Streptomycin, 1 mM natriumpyruvat och 2 mM l-glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler såddes vid en densitet av 3 106 cellers106 ml−1 på 5 occurg mL−1 poly-l-lysinbelagda sexbrunnsvävnadsodlingsplattor (Sigma-Aldrich). MEM-medium ändrades var 2: e dag och astrocytproliferation begränsades med fluorodeoxyuridince (FdU) antimitotisk behandling (1 mM, Sigma) under de första 4 dagarna. Neuronala kulturer odlades 7-10 dagar före experiment. Fyra olika neuronpreparat vid olika tidpunkter testades. En av neuronpreparaten var inte stabil och kulturen, inklusive Serum + – kontrollen som inte fick något läkemedel, dog i mitten av experimentet. Därför användes tre olika neuronpreparat från tre genetiskt olika givare.

VX-765 toxicitet bedömdes med 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl) – 2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT). Neuroner behandlades med 25-200 occurm VX-765 eller 0.1% DMSO (högsta DMSO−koncentration som används) för 72 h. neuroner inkuberades sedan med 0.5 occurg ml-1 MTT (Sigma-Aldrich) för 4 h vid 37 occur C (5% CO2). Formazankristallerna löstes i 100 oc DMSO för 30 min. Absorbansen mättes vid 560 och 670 nm med hjälp av Synergy H4-plattläsaren.

Axonal degeneration inducerades antingen genom APPWT-transfektion eller serumberövningsstress. VX-765 administrerades antingen som en förbehandlingsstrategi (1 timme före stressor) eller som en behandlingsstrategi efter beading (48 timmar efter stressor). Neuroner transfekterades av Genpistol (BioRad, Mississauga, ON, Kanada) med guldpärlor belagda med pBudCE41-eGFP för fluorescensvisualisering. Neuroner som var APPWT stressade transfekterades med pBudCE41-eGFP/APPWT. I korthet behandlades neuroner med medium kompletterat med 25 eller 50 occurm VX-765, 5 occurm Casp1-hämmare Z-YVAD-fmk eller DMSO. Fluorescensbilder togs var 24: e timme (upp till 72 timmar efter behandling) med ett Nikon Eclipse Ti-mikroskop (Nikon, Mississauga, ON, CA) och Photometrics coolSNAP HQ2 CCD-kamera (Photometrics, Tucson, AZ, USA) med NIS Elements AR 3.10-programvara (Nikon). Procentuell neuronal beading mättes genom att räkna antalet beaded eGFP-positiva neuroner över det totala antalet eGFP-positiva neuroner vid varje tidpunkt. Minst 150 eGFP-positiva neuroner räknades för varje tillstånd. Konditionerat medium samplades (kompletterat med 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 oc ml−1 av Proteases Inhibitors Cocktail (Sigma-Aldrich)) och neuroner skördades i celllysbuffert (50 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 0,1 mM EDTA) för analys.

statistiska analyser

antalet djur eller oberoende experiment och statistisk analys som används (ANOVA och post-hoc jämförelser) anges alla i figurlegenderna. Alla värden uttrycks som medelvärdet av S.e.m., med F-och p-värden som anges i figuren legends. Alla statistiska analyser utfördes med hjälp av GraphPad Prism 7-programvara (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).