diskussion

den aktuella studien har avslöjat en roll för SR luminal Ca-bindande protein, CSQ2 vid reglering av excitationskontraktionskoppling och CICR i hjärtat. Specifikt visar vi att Ad-medierad överuttryck av CSQ2 dramatiskt ökade storleken på båda cellgenomsnittliga Ica-inducerade Ca-transienter och spontana ca-gnistor i isolerade hjärtceller. Analys av den stigande fasen och förändringshastigheten för dessa ca-signaler indikerade att deras förstärkta storlek berodde på långsam avslutning av underliggande ca-frisättningsflöden från SR. förutom att förlänga aktiv Ca-frisättning saktades dynamiken i funktionell laddning av SR Ca-butiker också i celler med förhöjda csq2-proteinnivåer, vilket indikeras av långsam återhämtningstid för repetitiva ca-gnistor. Vi fick i huvudsak motsatta resultat i myocyter, där CSQ2-nivåer reducerades genom Ad-medierad antisensomvandling. Dessa myocyter visade kortare Ca-frisättning men påskyndade återställandet av ca-frisättningsställen. Vidare orsakade applicering av isoproterenol i periodiskt stimulerade myocyter med minskade CSQ2-nivåer arytmogena svängningar av intracellulära . Dessa resultat visar att CSQ2 är en nyckeldeterminant för SR Ca-frisättningsfunktionen som verkar genom att reglera Ca-frisättningsvaraktighet och frisättningsplats refraktoritet. Mot bakgrund av de observerade isoproterenolberoende störningarna i rytmisk ca-cykling i myocyter underuttryckande CSQ2, våra resultat är relevanta för att förstå de cellulära mekanismerna för katekolamininducerade arytmier kopplade till mutationer av csq2-genen.

molekylära mekanismer för CSQ2-verkan. Vi tillskriver de observerade effekterna av CSQ2 på SR Ca-frisättning till förmågan hos detta protein att fungera som en molekylär buffert som styr det fria i SR-luminalutrymmet (se föreslaget schema i Fig. 5). Det är känt från lipid dubbelskiktsstudier att bindning av Ca till den luminala aspekten av RyR-komplexet (dvs luminal Ca-sensor) ökar kanalaktiviteten, medan vid sänkt luminal reduceras kanalaktiviteten (EC50 1 mm, ref. 26). Eftersom många Ryr skulle vara i ett aktiverat tillstånd vid normala vilande luminal Ca-nivåer (1 mm), skulle sänkning av luminal under frigöringsprocessen därför minska den totala kanalaktiviteten (en process som kallas luminal Ca-beroende deaktivering; ref. 3). Våra resultat tyder på att genom att stabilisera den lokala fria luminalen i närheten av RyRs under frisättningsprocessen saktar CSQ2 den luminala Ca-beroende stängningen av RyR-kanalen, vilket ökar mängden Ca som frigörs från SR till cytosolen. CSQ2 kontrollerar också återhämtningsdynamiken för fri intra-SR under Ca-återupptag genom att fungera som ett handfat för Ca i SR-lumen. Således förstärker CSQ2 inte bara SR Ca-utflödet utan stabiliserar också CICR genom att modulera den funktionella restitutionen eller beredskapen för Ca-frisättningsställen efter varje frisättning. Nyligen åberopade vi en liknande mekanism för att förklara effekterna av ca-kelatorer med låg affinitet (organiska salter) laddade i SR vid ca-frisättning (3). Betydelsen av våra nuvarande fynd är att de visar hur frisättningsprocessen styrs av ett endogent, SR-bosatt Ca-bindande protein, CSQ2. De avslöjar också de patologiska konsekvenserna av reducerade csq2-mängder i SR av hjärtceller.

det har föreslagits att CSQ2 kan påverka Ca-release-kanalfunktionen genom direkta interaktioner med proteiner som innefattar ca-release-kanalkomplexet (dvs. RyR, junctin och/eller triadin) (ref. 13; för granskning, se ref. 9). Våra studier har inte visat några signifikanta skillnader i parametrarna för SR Ca-frisättning mellan celler som innehåller ungefär 3-faldigt förhöjda nivåer av CSQ2-protein och celler där organiska buffertar laddades in i SR (3). Således är den enklaste förklaringen till våra resultat att de dominerande effekterna av CSQ2 på SR Ca-frisättning beror på buffertverkan av detta protein inuti SR. belysning av den detaljerade mekanismen genom vilken CSQ2 och associerade proteiner såsom junctin och triadin reglerar ca-frisättning måste vänta på studier som involverar manipulation av nivåer och uttryck av mutanta former av dessa proteiner med förändrade förmågor att interagera med varandra och RyR.

den maximala hastigheten för ca-frisättning från stimulerade myocyter var likartad oavsett mängden CSQ2 uttryckt i Sr (Fig. 2B och 3D). Dessa resultat stöder uppfattningen att CSQ2 kontrollerar avslutningen av frisättningsprocessen, men dessa resultat är inte vad man nödvändigtvis skulle förutsäga baserat på de förväntade bufferteffekterna av detta protein i SR. faktum är att den maximala frisättningshastigheten förväntas vara högre i celler med ökad luminal Ca-buffertstyrka orsakad av långsam minskning av den fria intra-SR, eftersom i dessa celler förväntas den fördröjda minskningen i Ca-gradienten över SR-membranet göra större Ca-flödesintensiteter. Flera möjliga skäl förklarar varför detta inte observerades. En möjlighet är att den initiala fria intra-SR kan vara lägre i CSQ2-överuttryckande än i CSQ2-underuttryckande celler. Även om det fria i ett slutet fack som SR vid steady state inte bör påverkas av antalet Ca-bindningsställen (detta bör endast påverka kinetiken vid vilken steady state intra-SR uppnås), är det möjligt att ett verkligt steady state inte uppnåddes i våra experiment (dvs. myocyter som genomgår lågfrekvensstimulering). En annan möjlighet är att närvaron av förhöjda nivåer av csq2-protein saktar diffusionen av Ca i det luminala utrymmet och därigenom saktar utvandringen av Ca genom de öppna kanalerna. Klart mer forskning, både experimentell och teoretisk, behövs för att lösa denna fråga.

uppsägning av CICR. Hur CICR, en process med en inneboende benägenhet till självregenerering, avslutas har varit föremål för intensiv forskning, först genom att använda mätningar av globala Ca-transienter och nyligen genom att undersöka ca-gnistor (3, 27-30). En möjlighet som har beaktats är att RyR-kanalerna genomgår Ca-beroende inaktivering eller anpassning som ett resultat av ökningen av på den cytosoliska sidan av kanalen (27-29). En annan möjlighet är att nedgången i intra-SR ger en aktiv signal för stängning av Ryr efter att de öppnats (3, 30-32). Vi har nyligen funnit direkta experimentella bevis för en roll av luminal Ca-inducerade förändringar i RyR-aktivitet (dvs luminal Ca-beroende deaktivering) vid uppsägning av SR Ca-frisättning genom att klämma fast nivåerna av intra-SR med Lågaffinitets ca-buffertar laddade i SR-cisternae (3). Med hjälp av dessa buffertar förlängde vi dramatiskt varaktigheten av aktiv Ca-frisättning som ligger bakom både fokala och globala Ca-transienter i myocyter. I överensstämmelse med dessa resultat visar våra nuvarande resultat att ökning av nivåerna av SR luminal ca-buffert med hög kapacitet csq2 förlänger ca-frisättningsvaraktigheten, medan minskande mängder av denna endogena buffert förkortade frisättningsvaraktighet, tydligen genom att sakta eller accelerera luminal Ca-beroende stängning av Ryr, respektive. Tillsammans ger dessa resultat övertygande bevis för rollen som luminal Ca-beroende deaktivering av RyRs vid uppsägning av CICR. Även om vi visar vikten av förändringar i luminal Ca vid uppsägning av SR Ca-frisättning, utesluter våra resultat inte nödvändigtvis möjligheten att ytterligare mekanismer, såsom RyR-inaktivering eller anpassning vid cytosoliska ca-regleringsställen också kan påverka ca-release-uppsägning.

även om tydliga bevis finns för en roll för förändringar i luminal Ca i uppsägning av hjärt gnistor (ref. 3; tidigare studier visade att ca gnistor i skelettmuskulaturen inte kan åtföljas av betydande utarmning av SR . Lacampagne et al. (33) använd kinetisk analys av ca-gnistinspelningar med hög tidsmässig upplösning för att föreslå att ca-frisättningsflödet som ligger bakom ca-gnistan är konstant i amfibiemuskelfibrer. Eftersom SR Ca-flöde måste minska när SR faller, kan detta resultat innebära att luminala Ca-nivåer förblir stabila under ca-gnistorna. Således finns möjligheten att de grundläggande mekanismerna som är ansvariga för gnistavslutning är olika i hjärt-och skelettmuskulaturen. Utförandet av kompletterande studier i dessa två celltyper (dvs. modulering av CSQ-proteinnivåer i skelettmuskelfibrer och snabba ca-gnistkinetikmätningar i hjärtmyocyter) bör bidra till att klargöra denna fråga.

relevans för CPVT. En av de viktigaste aspekterna av våra resultat är att de visar hur reducerade csq2-nivåer kan orsaka hjärtarytmier på cellulär nivå. CPVT är en arytmogen sjukdom som kännetecknas av synkope och plötslig död inducerbar genom träning och katekolamininfusion (34). Hittills har fyra mutationer kopplats till CPVT. Tre av dessa mutationer verkar resultera i minskat CSQ2-uttryck (17), och en mutation har föreslagits leda till störd bindning av Ca (16). Våra resultat tyder på att den bakomliggande orsaken till CPVT kan vara relaterad till onormal återställning av ca-frisättningsmekanismen orsakad av reducerade csq2-nivåer (Fig. 5). På grund av den lägre koncentrationen av ca-bindningsställen i SR av celler som underuttrycker CSQ2 sker påfyllning av Ca-butiken av SERCA-pumpen snabbare än i normala celler. Butiksuppladdning blir ännu snabbare när aktiviteten av SERCA stimuleras av proteinkinas A, vilket potentiellt står för beroendet av kliniska episoder av CPVT på katekolaminer. I myocyter med minskade CSQ2-nivåer ledde för tidig återhämtning av Ca-frisättningskanaler från ett luminal Ca-beroende eldfast tillstånd till spontana extrasystoliska utsläpp av SR Ca-butiker. Det är känt att spontan ca-frisättning kan inducera inre strömmar och svängningar i membranpotentialen, vilket resulterar i utlöst arytmi (4-7). Därför kan de observerade störningarna i ca-hantering förklara, åtminstone delvis, patogenesen av CPVT associerad med genetiska defekter som resulterar i antingen minskad Ca-bindande aktivitet (16) eller reducerade expressionsnivåer av CSQ2 (17).

jämförelse med tidigare studier på transgena möss. Våra resultat skiljer sig från tidigare resultat erhållna i transgena möss som överuttrycker CSQ2 (14, 15). I dessa studier ökade ett 10 – till 20-faldigt överuttryck av CSQ2 SR Ca-lagringskapacitet för isolerade hjärtmyocyter; emellertid var luminal Ca inte tillgänglig för frisättning, vilket ledde till deprimerade globala och lokala ca-frisättningssignaler. Dessa förändringar i ca-hantering åtföljdes av flera strukturella, funktionella och biokemiska förändringar vid cellulära och subcellulära nivåer och utveckling av hjärthypertrofi och misslyckande. Å andra sidan upprätthåller den aktuella studien csq2-proteinnivåer närmare fysiologiska nivåer under akuta snarare än kroniska tillstånd; således kommer dessa data sannolikt att mer exakt återspegla de direkta fysiologiska konsekvenserna av förändringar i CSQ2-proteinnivåer på intracellulär Ca-hantering. Dessa resultat belyser de potentiella problemen vid tolkning av effekterna av konstitutivt högnivåuttryck av proteiner i transgena djurmodeller och värdet av kompletterande studier i mer akuta miljöer.

slutsats. Sammanfattningsvis har vi funnit att CSQ2 är en väsentlig determinant för SR: s förmåga att lagra och släppa Ca i hjärtmuskeln. CSQ2 verkar fungera som en reservoar för Ca som är lättillgänglig för CICR och även som en aktiv Ca-buffert som modulerar lokal luminal Ca-beroende stängning av Ryr. Samtidigt stabiliserar CSQ2 CICR-mekanismen genom att bromsa den funktionella laddningen av SR Ca-butiker. Onormalt reprimerande beteende hos ca-frisättningskanaler kan redogöra för eller bidra till ventrikulära arytmier associerade med mutationer i csq2-genen.