inhibitori ALDH1A1 au fost descriși recent30. Inhibitorii LDHA au fost descriși anterior în Rai și colab.29. Inhibitorii IDH1 au fost descriși anterior în Urban și colab. și Davis și colab.24,36. Alți compuși utilizați în studiu au fost metotrexatul (MedChem Express, HY-14519), Panobinostatul (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MedChem Express HY-18690), Izofagomina (Toronto Research Chemicals #I816010), Lumacaftor (BioVision #2857) și LY2857785 (Medchem Express, HY12293). Pentru qHTS, compușii din placa de interogare a mecanismului (MIPE) au fost testați în 11 puncte (intraplate, factor de diluare 1:3). Colecția de inhibitori de kinază care conține 977 inhibitori de kinază a fost testată în doze de 7 puncte (interplate, factor de diluare 1:5). În toate cazurile, DMSO a fost utilizat ca vehicul.

clonarea

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Cadrele de citire deschise (ORFs) ale genelor de interes au fost clonate în coloanele vertebrale acceptoare folosind situsurile BamHI/EcoRI (n-terminal) sau NheI/BamHI (C-terminal) prin amplificarea PCR a regiunii de codificare cu oligonucleotide compatibile cu perfuzia, definite în detaliu în tabelul suplimentar S1. Construcțiile IDH1, LDHA, DHFR, GC și ALDH1A1 au fost preparate prin sinteza genei GeneArt (Termofisher) în pcDNA3.1 (+). Pentru clonarea Gateway-ului (numai construcțiile IDH2), un vector de destinație care conține eticheta 86b a fost creat prin înlocuirea etichetei V5 în pcDNA3.2-V5/DEST. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ‘scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes „LPTFLYKVVDLEGPR” prior to the 86b tag.

culturi celulare

HEK293T, LN18, OV-90, HeLa, 22rv1, MDA-MB-468 și HT-29 celulele au fost obținute din ATCC (CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132 și, respectiv, HTB-38). HuCC-T1 și CC-LP-1 au fost un cadou amabil al Dr.N. Bardeesy (Massachusetts General Hospital, Boston). Celulele HEK293T au fost cultivate în DMEM (4,5 g/L glucoză) cu ser fetal bovin 10% (FBS), L-glutamină 6 mM, piruvat de sodiu 1 mM, penicilină 50 U/mL și streptomicină 50 hectolitri / mL. Celulele LN18, HT-29, CC-LP-1 și hela au fost cultivate în mediul de mai sus, fără piruvat de sodiu. Celulele OV-90 au fost cultivate într-un amestec 1: 1 de mediu MCDB 105 (Cell Applications Inc.) și mediu M199 (HyClone, GE), suplimentat cu 15% FBS, 1% penicilină-streptomicină (tehnologii de viață) și o concentrație finală de 1,85 g/l bicarbonat de sodiu (HyClone, GE). Celulele 22RV1, HuCC-T1 și MDA-MB-468 au fost cultivate în RPMI 1640 suplimentate cu 10% FBS, 6 mM L-glutamină, 100 Unități/mL penicilină, 100 hectogg/ml streptomicină. Toate celulele au fost crescute la 37 C într-un incubator umidificat menținut la 5% CO2 și au fost testate negativ pentru mycoplasma folosind un kit de detectare MycoAlert (Lonza).

producerea și purificarea proteinelor recombinante și peptide

proteinele 11S și 86B au fost produse de GenScript. Pentru fragmentul recombinant 11S, secvența ADN de codificare a fost fuzionată cu o etichetă 6x His pentru a facilita purificarea în aval și secvența a fost subclonată într-un vector de Expresie E. coli. Celulele stelare BL21 (de3) au fost transformate cu plasmide recombinante și o singură colonie a fost inoculată în mediu LB conținând IPTG pentru inducerea expresiei proteinelor. Analiza SDS-PAGE și Western blot au fost utilizate pentru a monitoriza expresia și a selecta calendarul optim de recoltare. Celulele au fost recoltate prin centrifugare și pelete au fost lizate prin Sonicare. După purificarea his-tag, fracțiile au fost sterilizate printr-un filtru de 0,22 mm. Proteinele au fost analizate prin SDS-PAGE și Western blot folosind protocoale standard și un mouse-anti-His mAb (GenScript, Cat.No.A00186). concentrația proteinei purificate a fost determinată utilizând un test de proteine Bradford cu BSA ca standard. Proteina a fost stocată în 1x PBS, 10% glicerol, pH 7,4, iar puritatea a fost de aproximativ 90%, așa cum se estimează prin analiza densitometrică a gelului SDS-PAGE colorat cu albastru Coomassie în condiții de reducere. Peptida de 15 aminoacizi 86B a fost stocată în dH2O ultrapură și a fost 99,9% pură de HPLC.

testul de completare CETSA cu debit redus (plăci sau benzi PCR cu 96 de godeuri)

celulele au fost transfectate în vase cu 6 godeuri folosind o procedură de transfecție inversă, unde 1,25 ml de complexe (6,25 XL Lipofectamină 2000 și 3 XlX ADN per godeu) au fost combinate cu 1,25 ml suspensie celulară HEK293T (1 xlx106 / mL, 1,25 xlx106 celule în total). Pentru CDK9, s-au folosit 2 hectolitri de ADN per godeu. După 24 h (48 h pentru CDK9), celulele au fost recoltate prin tripsinizare și omogenizate la 1 106 celule/ml (dacă nu se indică altfel) în tampon CETSA conținând DPBS (cu CaCl2 și MgCl2) plus 1 g/L glucoză, 1x cocktail inhibitor de protează Halt (Termofisher) și 0,5% DMSO (DMSO nu a fost adăugat pentru experimentele care au primit tratament ulterior compus și vehicul). Pentru experimentele cu interval de temperatură (fără compus sau doză unică), probele au fost alicotate în benzi PCR la 30 unkticli pe tub. Compusul a fost adăugat și celulele au fost incubate la 37 C pentru 1 h. probele au fost apoi încălzite pentru 3.5 min folosind un ciclor termic preîncălzit, lăsat să se echilibreze la temperatura camerei și 6 ecqutl de 6% NP40 s-a adăugat la fiecare godeu. Pentru experimentele de îngheț-dezgheț, tuburile au fost plasate într-un bloc PCR din aluminiu pe o baie de gheață uscată/etanol timp de 3 min, urmată de incubarea la 37 centimetric C timp de 3 min, vortexing timp de 3 sec și repetarea acestor pași de trei ori în plus. S-au adăugat 11S (GenScript) și substratul de furimazină (din Sistemul de testare Nano-Glo luciferază, Promega), la concentrații finale de 100 nM și 0.5x, respectiv, și eșantioanele au fost analizate pentru intensitatea luminiscenței folosind un imager CCD ViewLux de mare viteză (Perkin Elmer) echipat cu filtre clare.

384-bine CETSA test

celulele au fost transfectate în flacoane T75 folosind o procedură de transfecție inversă, în cazul în care 9 mL de complexe (45 unktil Lipofectamina 2000 și 22,5 ADN-ul hectolitri) a fost combinat cu 10 mL de suspensie de celule HEK293T (1 106 celule / mL, 10 milioane de celule în total). După 24 de ore, celulele au fost recoltate prin tripsinizare, omogenizate la 1% 106 celule/ml conform descrierii de mai sus și distribuite (15% celule/godeu) în plăci PCR cu 384 godeuri (Roche) folosind un Combi Multidrop (ThermoFisher). Compușii (63 nL) sau DMSO vehicle control (63 nL) au fost ulterior fixați cu ajutorul unei scule cu știft (GNF) și incubați timp de 1 h la 37 C. plăcile au fost sigilate și încălzite la temperatura indicată timp de 3,5 min și răcite la 25 C cu ajutorul mașinii AB qPCR (Roche) folosind viteza rampei de 1,5 c/sec pentru faza de încălzire și viteza maximă a rampei pentru faza de răcire. S-au adăugat trei unqql de 6% NP40 per godeu și s-au incubat timp de 30 min pentru a permite liza celulară urmată de adăugarea de 11S și substrat de furimazină (la concentrații finale de 100 nM și, respectiv, 0,5 X). Probele au fost analizate pentru intensitatea luminiscenței folosind un cititor ViewLux.

1536-bine CETSA test

celulele au fost transfectate și recoltate ca mai sus (protocolul 384-bine). Celulele au fost distribuite (5 celule de unqql/puț) în plăci albe de 1.536 de puțuri (Aurora, polimer ciclic de olefină, cat# ewb041000a) folosind un Combi Multidrop. Compușii (23 nL) au fost ulterior fixați cu ajutorul unui instrument cu știft (Wako Automation) și incubați timp de 1 oră la 37 C. plăcile au fost încălzite la temperatura și timpul indicate cu ajutorul unui bloc de încălzire (vezi mai jos) și răcite la 25 C. s-a adăugat un xilt de 6% NP40 pe godeu și plăcile au fost incubate timp de 30 min pentru a permite liza celulară urmată de adăugarea a 3 xilt 11S (concentrație finală 100 nM) și a substratului de furimazină. Plăcile au fost centrifugate și analizate pentru intensitatea luminiscenței folosind un cititor ViewLux. Pentru ecranele LDHA și CDK9, o concentrație finală de 0,5 x și 0.25x furimazină a fost utilizat, respectiv. Controalele de normalizare includ DMSO și gsk2837808a-probe tratate sau probe neîncălzite pentru ldha și, respectiv, CDK9. Counterscreen-ul CDK9 a fost realizat ca mai sus, cu următoarele diferențe: 5 unktql de celule hek293t netransfectate (1 oktq 106/mL în tampon CETSA) au fost distribuite în plăci de 1.536 de sonde urmate de adăugarea compusului, 37 de etape de incubare, încălzire și liză ca mai sus. Ulterior, în godeuri s-au adăugat 500 pM (final) de 86b, urmată de adăugarea a 100 nM 11S și 0,25 x substrat de furimazină (final).

blocul de aluminiu pentru încălzirea unei plăci de 1.536 de puțuri a fost proiectat prin măsurarea unei plăci pentru a determina dimensiunile zonei mărginite de nervuri de armare turnate în X și Y, iar fața puțului inferior și fața flanșei inferioare în Z. apoi a fost turnat un bloc care urmează să fie prelucrat din placa de aluminiu 6061 T6, care ar fi o potrivire liberă cu un spațiu liber de aproximativ 0,5 mm pentru placă în toate axele. Blocul a fost prelucrat folosind o mașină de frezat verticală manuală, mori de capăt și o moară de față. Pentru experimentele de încălzire a cuptorului, plăcile au fost plasate în raftul mijlociu al cuptorului de laborator cu convecție (Termofisher) și acoperite cu capace metalice pentru a minimiza evaporarea.

CETSA în lizații celulari

celulele au fost colectate în tampon CETSA la 1,0 106 celule / mL (așa cum s-a subliniat mai sus) și NP40 a fost adăugat la o concentrație finală de 0,4%. După rotirea probelor end-over-end timp de 30 min (Temperatura camerei), lizații au fost clarificați prin centrifugare la 20.000 xqtg timp de 10 min (4 oC). Cofactor (de exemplu, NAD+) a fost adăugat la lizatul clarificat. Pentru experimentele de răspuns la temperatură, 25 ecql de lizat au fost transferate în tuburi PCR și încălzite timp de 3,5 min la diferite temperaturi. Pentru experimentele izoterme doză-răspuns, 5 unqql de lizat clarificat a fost distribuit pe plăci cu 1536 de puțuri folosind o stație de lucru BioRAPTR FRD și probele au fost încălzite pe un bloc de aluminiu. Probele au fost lăsate să se echilibreze la temperatura camerei și s-a adăugat substrat (concentrație finală: 100 nM 11S, 0,5 x furimazină). Luminescența a fost capturată folosind un imager ViewLux așa cum s-a subliniat mai sus.

Western blots

probele au fost prelucrate conform descrierii din secțiunea test de completare cu debit redus, folosind cicluri de îngheț-dezgheț pentru liză. Lizele au fost centrifugate la 15.200 de centi g timp de 20 min la 4 centi C. probele au fost rulate pe un gel de NuPAGE bis-Tris de 4-12% (Termofisher) folosind tampon de mopuri și transferate într-o membrană PVDF folosind un sistem de transfer iBlot 2 la 25 V Timp de 7 min. Membranele au fost blocate cu o soluție de lapte 5% (50 mM Tris HCl, pH6; 150 mM NaCl; 0,1% Tween-20) și anticorpii primari au fost incubați peste noapte la 4 centicc în soluție de blocare. Anticorpii au fost: anti-IDH1 (, semnalizare celulară # 8137, 1:500), anti-IDH1(R132H) (Millipore #MABC171, 1:500), anti-LDHA (, semnalizare celulară #3582, 1: 1000). Anti-iepure / șoarece-HRP (iepure = semnalizare celulară 7074; șoarece = semnalizare celulară # 7076) a fost adăugat la 1:2500 și incubat timp de 1 oră la temperatura camerei. Un semnal chemiluminescent a fost generat cu Supersignal West dura solution (Termofisher) și capturat folosind un Biorad Chemidoc sistem. Analiza densitometrică a fost efectuată utilizând software-ul Photoshop (Adobe).

2-Hg test

celulele HEK293T invers transfectate în 24 feluri de mâncare bine prin adăugarea 2.5 105 celule pe complecși de transfecție (0,75 ADN plasmidicg, 1,5 lect Lipofectamină 2000 pe godeu). Mediul de cultură celulară a fost colectat după 72 h și 15 ecql a fost transferat pe o placă opacă de 384 de godeuri. În fiecare godeu s-au adăugat 1,5 unqql de 660 mm HCl și probele au fost incubate la temperatura camerei timp de 10 min. La fiecare godeu s-a adăugat 1,5 unqql de bază Tris-HCl de 720 mM. Apoi, 52 oqql de soluție de detecție 2-HG (HEPES 100 mM (pH 8,0), 100 oqqm NAD + , 1 oqqg / mL recombinant activ D-2-Hidroxiglutarat dehidrogenază (D2hgdh; Biovision, Cat: P1001), 5 oqqm resazurin, 0,03 mg/mL diaforază (Sigma, Cat: D5540) a fost adăugat și placa a fost incubată la temperatura camerei. O curbă standard de 2 HG a fost pregătită în HEPES de 100 mM (pH 8,0). Fluorescența a fost măsurată pe un cititor ViewLux folosind filtre Ex: 525, Em: 598/25.

analize biochimice

testul biochimic LDHA a fost efectuat conform descrierii anterioare29. Pe scurt, 3 unqql de lactat dehidrogenază umană 5 (2 nM final) (nr. A38558H, Meridian Life Science, Inc.) în tamponul de testare LDH (200 mm Tris HCl, pH 7,4, 100 EDTA și 0,01% între-20) a fost adăugat la o placă de testare cu fund solid negru 1536-well (Greiner Bio-One). În urma transferului de pini compus (23 nL), pentru inițierea reacției s-a distribuit 1 ilqq de soluție de substrat conținând NADH (0,06 mm final) și piruvat de sodiu (0,2 mM final) (Sigma-Aldrich) în tamponul de testare LDH. După 5 minute de incubare la temperatura camerei, în fiecare godeu s-a adăugat 1 unql de reactiv de detecție. Plăcile au fost transferate imediat la un cititor ViewLux și orice fluorescență resorufină rezultată a fost măsurată (ex 540 nm, em 590 nm) la 0 și 10 min. Fluorescența a fost normalizată folosind puțuri de control fără enzime și tratate cu DMSO pe fiecare placă.

analiza biochimică ALDH1A1 utilizând proteine netichetate a fost efectuată conform descrierii anterioare31,37. Pe scurt, 3 unqql de 20 Nm ALDH1A1 uman purificat în tampon de testare (100 mm HEPES pH 7,5 cu 0,01% între 20) au fost distribuite într-o placă neagră cu fund solid de 1.536 godeuri (Greiner Bio One). Douăzeci și trei nL de compuși sau Bay de control 11-7085 au fost transferate prin intermediul pin tool (Wako Automation). Probele au fost incubate (la temperatura camerei, protejate de lumină) timp de 15 min, urmate de un adaos de substrat de 1 ilqq de nad + și Propionaldehidă (concentrații finale de 1 mM și, respectiv, 80 ilqqm). Plăcile au fost centrifugate și citite în modul cinetic pe un imager ViewLux echipat cu excitație de 340 nm, filtre de emisie de 450 nm timp de 5 min. Modificarea intensității fluorescenței pe parcursul celor 5 minute a fost normalizată folosind puțuri de control fără enzime și tratate cu DMSO pe fiecare placă.

testul de legare a kinazei TR-FRET Lanthascreen Eu pentru CDK9 / cyclin K a fost achiziționat de la ThermoFisher și efectuat conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, 4 unqql dintr-un amestec master care conține 4 nM CDK9/Cyclin K (Invitrogen #PV4335), 2 Nm Biotin Anti-His Ab, 2 nM eu-Streptavidin și 10 nM Kinase Tracer 236 soluție în tampon de kinază 1X au fost distribuite în plăci de legare medii albe Greiner 1,536-well folosind o stație de lucru BioRAPTR FRD. Douăzeci și trei de nl de compus și elemente de control (DMSO și LY2857785 la o concentrație finală de 6 MMC) au fost livrate imediat pe plăcile de testare prin transferul sculei cu știft. Plăcile au fost lăsate să se incubeze timp de 1 oră la temperatura camerei, iar fluorescența TR-FRET a fost măsurată ulterior cu un cititor de plăci Multilabel PerkinElmer EnVision (Ex: 317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; timp de întârziere 100 oktc; timp de integrare 200 oktc).

testul producției de lactat

celulele HEK293T au fost cultivate conform descrierii de mai sus. Celulele au fost clătite cu PBS, tripsinizate și resuspendate în DMEM liber roșu fenol (Life Technologies) fără suplimente. Celulele au fost imediat placate la 1536-plăci de fund clare negre (Corning) la 250 de celule pe godeu în volum de 4 unqql. Controlul compusului sau al vehiculului a fost adăugat în puțuri prin transferul sculei cu știft și celulele au fost incubate la 37 centicc timp de 1 oră. în fiecare godeu s-au adăugat două centicli de amestec de reacție la lactat (Biovision K607-100) și plăcile au fost acoperite și incubate la temperatura camerei timp de 30 min. Fluorescența a fost măsurată cu ajutorul unui microplacă ViewLux echipat cu filtre Ex / Em 528/598 nm.

testul Aldefluor

pentru determinarea inițială a activității ALDH1A1 marcate cu 86B, celulele au fost transfectate utilizând o procedură de transfecție inversă, în care 1 mL de complexe (6 ilft Lipofectamină 2000 și 3 ilft ADN) au fost combinate cu 1 mL de suspensie de celule LN18 (5 ilft 105/mL) și 100 ilft / godeu de amestec au fost distribuite în plăci negre, cu fund transparent, cu 96 de godeuri (Corning). După 24 de ore, mediul a fost îndepărtat și înlocuit cu 100 unqql/godeu de tampon Aldefluor (tehnologii STEMCELL) conținând substrat BAAA și Hoechst 33342 (Termofisher, concentrații finale de 500 nM și, respectiv, 0,5 nM). Ulterior s-a adăugat DMSO sau DEAB pentru vehicule (1 xqtm final), iar plăcile au fost incubate timp de 30 min la 37 XTC pentru a permite conversia BAAA în BAA. Celulele au fost spălate și 100 de centicli/godeu de tampon Aldefluor au fost distribuite înainte de imagistica pe o celulă IN 2200 (GE Healthcare). Pentru testele cu debit mare, celulele LN18 au fost transfectate în baloane T75 folosind o procedură de transfecție inversă așa cum este descris mai sus pentru testele CETSA HEK293T cu debit mare. După 16 ore, celulele au fost recoltate și placate (1.000 celule / puț / 5 ILQ) în fund negru, de calitate optică, plăci TC tratate cu 1.536 de puțuri (microplăci Aurora) folosind un dozator combinat Multidrop și incubate peste noapte la 37 ILC C. testul Aldefluor cu conținut ridicat a fost ulterior efectuat pe celule ln18 transfectate sau ov-90 netransfectate așa cum s-a descris anterior31. Imaginile au fost analizate folosind algoritmul de analiză multi-țintă conservat (GE Healthcare) al software-ului de analiză In Cell Investigator v1.6.2, așa cum este descris.

test de integritate termică a membranei

30000 celule HEK293T au fost preparate în 30 unqql cetsa tampon conținând 1x cocktail inhibitor de protează (Termofisher) suplimentat cu 0,5% DMSO (1,5% DMSO total). Pentru experimentul de toleranță DMSO, DMSO a fost adăugat la DPBS la 0, 1, 2 sau 3%. Suspensiile celulare au fost încălzite timp de 3,5 min la 42 până la 74 de centimetrii C, folosind intervale de 4 grade, apoi îndepărtate într-un bloc de aluminiu pe gheață umedă. Suspensiile celulare au fost amestecate cu părți egale Albastru Trypan (LONZA) ( = 0,2% albastru trypan) și numărate imediat folosind un hemocitometru cu cip C (iNCyto, Coreea). S-au numărat Trypan pozitiv (permeabilizat) și negativ (intact), cu N = 2 la fiecare temperatură. Pentru linii celulare suplimentare, un milion de celule au fost preparate în 100 ecql de DMEM liber roșu-fenol conținând 1% DMSO. Celulele au fost încălzite timp de 3 minute peste 42 până la 90 de centimetrii C la intervale de 4 grade, apoi îndepărtate într-un bloc de aluminiu pe gheață umedă. Integritatea membranei a fost evaluată conform descrierii de mai sus.

PAMPA

metoda de amestecare dublu-chiuveta PAMPA patentat de pION Inc. (Billerica, MA) a fost utilizat pentru a măsura permeabilitatea compusului, așa cum s-a descris anterior38. Compușii au fost diluați în soluții donoare și acceptoare tamponate la pH7.4, iar concentrația DMSO a fost de 0,5%. Calculele de permeabilitate au fost efectuate folosind Pion Inc. software-ul.

analiza qHTS

datele din fiecare test au fost normalizate în funcție de placă la controalele corespunzătoare, așa cum s-a descris anterior39. Aceleași controale au fost, de asemenea, utilizate pentru calcularea factorului Z’ pentru fiecare test. Activitatea procentuală a fost derivată folosind software-ul intern (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Toate curbele concentrație-răspuns au fost montate și AC50 au fost calculate cu software – ul Graphpad Prism; curbele au fost clasificate așa cum au fost descrise anterior27. Aria de sub curbă (ASC) a fost calculată folosind regula trapezoidală pentru a aproxima aria dintre curba de răspuns și axa x în intervalul de concentrație. Au fost utilizate intervale de concentrație echivalente pentru toți compușii din cadrul unui experiment. Pentru clasificarea compușilor activi s-a utilizat o limită de eficacitate de 3% față de media (a controlului vehiculului).