rezumat
testele de chemotaxie existente nu generează gradienți chemotactici stabili și astfel—în timp—măsoară funcțional doar mișcarea aleatorie nespecifică (chemokineză). În comparație, tehnologia microfluidică are capacitatea de a genera un micromediu strict controlat, care poate fi menținut stabil pentru perioade lungi de timp și, prin urmare, poate fi adaptat pentru testarea chemotaxiei. Descriem aici un nou dispozitiv microfluidic pentru analiza sensibilă a migrației celulare și arătăm aplicația sa pentru evaluarea chemotaxiei celulelor musculare netede într-un gradient de chemokină.
1. Introducere
migrația celulară direcționată joacă un rol critic în tulburările inflamatorii, bolile vasculare, vindecarea rănilor și metastazele tumorale . O serie de abordări in vitro au fost dezvoltate pentru a cuantifica migrația celulară, inclusiv închiderea rănilor monostrat („scratch assay”) și camera Boyden . Cu toate acestea, aceste metode actuale sunt relativ insensibile. Mai mult, astfel de abordări pot măsura de fapt doar chemokineza, adică o mișcare aleatorie crescută, mai degrabă decât migrația celulară direcționată spre chemotaxie.
într-adevăr, utilitatea testului de zgârieturi și a transvelurilor camerei Boyden este limitată de designul lor metodologic.
pentru testul zgârieturilor, o „rană” definită (zgârietură) se face într-un monostrat celular confluent; celulele de la marginile defectului completează progresiv golul, iar timpul până la confluența restabilită este cuantificat. Repararea mai rapidă a zgârieturilor a fost interpretată pentru a reflecta „chemotaxia” îmbunătățită din cauza manipulării celulare sau a naturii agenților solubili adăugați în mediu. În timp ce experimentul este conceptual simplu și ușor de realizat din punct de vedere tehnic, celulele sunt scăldate într-o concentrație uniformă de agent și nu există un gradient de concentrație chemoatractant pe parcursul întregului experiment; mișcarea care umple golul reprezintă, prin urmare, doar o „plimbare aleatorie.”Astfel,” migrația ” într-un test de zgârieturi este în mare măsură o funcție a chemokinezei crescute. Mai mult, așa cum se efectuează în mod obișnuit—în special pe parcursul mai multor ore de testare prelungită—închiderea unei „răni” de zgârieturi include, de asemenea, o componentă substanțială a proliferării celulare.
cealaltă metodă cea mai comună de măsurare a „chemotaxiei” implică utilizarea transvelurilor de cameră Boyden. Diferite concentrații de chemokine specifice sunt plasate în compartimentul inferior al dispozitivului, în timp ce celulele care urmează să fie evaluate sunt incubate în inserția superioară; o membrană microporoasă separă cele două camere și formează un suport pentru creșterea celulelor și o barieră parțială pentru migrare. Celulele care sunt numărate la fața inferioară a membranei sau care se acumulează în camera inferioară sunt de obicei evaluate la un singur punct final fix. Acest test are avantajul unei migrații aparent direcționate, adică de la camera superioară la cea inferioară, dar este încă problematică. În primul rând, nu există un „gradient” de chemokine de sus în jos, ci mai degrabă o singură funcție pas de la concentrații scăzute la concentrații ridicate. În al doilea rând, nu există nicio modalitate de a susține diferențialul de chemokină de la camerele de sus în jos . Inițial, concentrația de chemokină din compartimentul inferior este mai mare, dar în câteva minute până la ore, concentrațiile se egalizează datorită difuziei, moment în care chemotaxia specifică încetează. În schimb, măsurătorile pe termen lung reflectă mai probabil un element semnificativ al chemokinezei. Mai mult, odată ce celulele cad prin membrană și în camera inferioară, nu există nicio oportunitate pentru migrarea inversă. În cele din urmă, camera Boyden este, de asemenea, limitată, deoarece numărarea celulelor necesită încetarea experimentului; un curs de timp necesită, prin urmare, mai multe dispozitive.
Tehnologia microfluidică poate depăși aceste limitări prin generarea unui gradient stabil și controlabil pe termen lung de factori solubili care pot fi monitorizați continuu în timp . Folosind celule care au fost tratate pentru a bloca proliferarea, un astfel de dispozitiv permite o adevărată evaluare continuă a chemotaxiei față de chemokineză. Figura 1 descrie un astfel de dispozitiv în care concentrațiile sursei și chiuvetei sunt menținute prin crearea unor puțuri corespunzătoare ale căror volume sunt mari în raport cu fluxul difuziv prin canalul hidrogel de legătură . La starea de echilibru, se formează un gradient de concentrație liniară între aceste două puțuri. Deși fluxul interstițial prin regiunea hidrogelului poate perturba gradientul dacă presiunile hidrostatice din cele două puțuri nu sunt egale, gradienții de presiune sunt eliminați prin conectarea puțurilor sursă și chiuvetă cu canale și rezervoare suplimentare care servesc ca căi de rezistență scăzută pentru curgerea fluidului și echilibrarea presiunii. Gradienții pot fi astfel menținuți timp de câteva zile și utilizați pentru a studia migrația celulară într-un mod sensibil și specific cu o varietate de tipuri de celule . Lucrarea prezentată aici descrie utilizarea unor astfel de dispozitive pentru a evalua chemotaxia pentru culturile primare ale celulelor musculare netede și pentru a o compara cu tehnicile scratch și Boyden chamber pentru sensibilitate.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Device design and stability of concentration gradients as a function of time. (a) cele 3 puțuri inferioare sunt puțuri celulare și/sau sursă pentru chemokine, iar cele 3 puțuri superioare servesc drept rezervoare pentru a menține presiuni echivalente în puțurile inferioare. În funcție de designul experimental, puțurile laterale sau puțul central pot servi ca puțuri sursă; celulele dintr-un puț central pot migra către diferiți stimuli chemokinici de ambele părți sau diferite populații de celule din puțurile laterale pot migra către un stimul chemokin central. (b, c) gradienții de concentrație sunt prezentați schematic după adăugarea unui indicator de colorant fluorescent cu greutate moleculară mică la fântâna sursă și rezervorul sursei, fie la 2 ore (b), fie la 72 ore (c). (d) afișarea grafică a gradienților de concentrație de la 0 oră până la 72 h după adăugarea colorantului fluorescent la fântâna sursă și rezervor.
2. Materiale și metode
2.1. Cultura celulelor musculare netede primare (SMC)
aorta a fost recoltată de la șoareci C57 / B6 în vârstă de 8 săptămâni (Charles River, Wilmington, MA) cu foarfece sterile de disecție. Grăsimea aderentă a fost îndepărtată, iar aortele au fost incubate timp de 20 min la 37 centimetric C în mediul vulturului modificat Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) conținând 1% penicilină/streptomicină, 2% ser fetal bovin și 5 mg/mL colagenază de tip II (Invitrogen). Aorta a fost clătită în DMEM rece și adventitia a fost disecată cu grijă; apoi au fost tăiate în bucăți mici și incubate timp de 30 min la 37 centimetric C în DMEM conținând 1 mg/mL colagenază tip I (Invitrogen) și 0,125 mg/mL elastază tip III (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO). În urma pipetării repetate pentru disocierea țesutului, amestecul celular rezultat a fost suspendat în „mediu SMC” proaspăt (DMEM cu 10% ser fetal bovin, 1% penicilină/streptomicină; 2% aminoacizi neesențiali, 1% L-glutamină; toți reactivii de la Invitrogen) și crescut la 37 CTC într-un incubator de 5% CO2 pe plăci acoperite cu 1 mg/mL fibronectină timp de 30 minute. Odată ce cultura celulară este stabilită (de obicei după primul pasaj), SMC sunt cultivate pe baloane de plastic neacoperite (Corning Incorporated, Corning, NY).
SMC au fost utilizate de la pasajele 2 la 7 și au fost 99.5% pur, așa cum este evaluat prin citometrie în flux după colorare pentru mușchiul neted-actină. Pentru colorare, celulele sunt recoltate și fixate cu paraformaldehidă 1% (Sigma-Aldrich) în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). FITC-anticorp antismooth conjugat cu mușchi de actină (Sigma-Aldrich) la diluție de 1 : 100 în 10x bd Perm/tampon de spălare (bd Pharmingen, San Jose, California) a fost aplicat timp de 10 minute la temperatura camerei. Celulele sunt spălate de două ori cu 1% ser fetal bovin în PBS și o dată cu 1% ser fetal bovin în PBS conținând 1% formaldehidă și analizate imediat prin citometrie în flux (FACScalibur, bd Biosciences, San Jose, CA). Izotipul IgG1 de șoarece conjugat FITC (bd Pharmingen) este utilizat ca control al izotipului. Celulele pentru testele chemotactice au fost recoltate când au atins confluența.
2.2. Tratamentul cu mitomicină-c
celulele au fost tripsinizate (0,25% tripsină-EDTA; Invitrogen) timp de 2 min la 37 centimetric c, spălate cu mediu SMC și apoi incubate sub formă de suspensie monocelulară în 40 centimetric / mL mitomicină-C (MMC; Sigma-Aldrich) în mediu SMC timp de 30 min la 37 C. După două spălări suplimentare în PBS, celulele au fost evaluate pentru viabilitate, proliferare sau capacitate de migrare. Pentru testul de vindecare a rănilor (scratch), tratamentul MMC a fost efectuat după placarea SMC și când celulele au fost 100% confluente; celulele au fost incubate în 40 MMC/mL în mediu SMC timp de 30 min la 37 C și apoi spălate de două ori în PBS înainte de testare.
2.3. Testul de inhibare a proliferării SMC
după tratamentul MMC sau incubarea de control în mediu SMC, SMC au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri (Corning Incorporated). Celulele au fost recuperate după 1 h, 24 h sau 48 h prin tripsinizare, iar numărul de celule și viabilitatea au fost evaluate prin numărare folosind un hemocitometru și excluderea albastră de trypan.
2.4. Vindecarea rănilor/testul de zgârieturi
SMC au fost cultivate în plăci cu 12 puțuri (Corning Incorporated) până la confluent și apoi tratate cu MMC. După spălare, s-a adăugat un mediu SMC proaspăt și monostratul celular a fost zgâriat într-un mod reproductibil folosind un vârf steril de pipetă de 200 ilqql. Concentrații diferite ale factorului de creștere derivat din trombocite (PDGF; R&sisteme D, Minneapolis, MN) în medii SMC au fost adăugate la fiecare godeu. Distanța dintre marginile defectului de zgârietură a fost măsurată și medie de la cinci puncte separate la 3, 6 și 9 ore sau până când defectul plăgii s-a închis.
2.5. Boyden Chamber Transwell Assay
100 oktl de suspensii SMC la 1,0–1,5 oktl 105 celule/mL (1,0–1,5 oktl 104 celule totale) au fost încărcate în inserțiile transwell superioare (Costar, Corning Incorporated) și 600 oktl de medii SMC care conțin concentrații diferite de PDGF au fost plasate în compartimentul inferior. După 6 ore, 12 ore sau 24 de ore de incubație, membrana transwell a fost colorată cu Hoechst 33342 (Invitrogen) conform recomandării producătorului, iar celulele transmigrate de pe fața inferioară au fost numărate pe un microscop de fluorescență folosind software de automatizare a microscopiei MetaMorph NX și analiză a imaginii (BioCompare, South San Francisco, CA). Nu au fost identificate celule în mediul din camera inferioară. În experimente pentru a evalua dacă migrația celulară a reprezentat chemotaxie sau chemokineză aleatorie în absența unui gradient de concentrație, factorul de creștere derivat din trombocite-BB (PDGF) a fost adăugat în camera inferioară, numai inserția superioară sau atât inserția superioară, cât și camera inferioară.
2.6. Testul dispozitivului Microfluidic
dispozitivele microfluidice [Figurile 1 (A)-1(c)] sunt pregătite conform descrierii din altă parte . După cum se arată în Figura 1 litera(d), gradienții reactivilor adăugați sunt stabili timp de cel puțin 72 de ore. În funcție de protocolul experimental, celulele care trebuie evaluate sunt plasate în puțul central și s-au dezvoltat diferiți gradienți chemotactici din cele două puțuri laterale. Alternativ, migrarea a două populații diferite de celule poate fi evaluată din puțurile laterale, experimentând gradienți de concentrație identici generați de reactivi plasați în puțul central. Concentrațiile celulare au fost întotdeauna de 4-5 XTX 105 / mL și 40 XTX din suspensiile celulare (1,6–2,0 XTX 103 celule) au fost încărcate în godeurile de testare.
celulele au fost incubate în dispozitive pentru diferite momente de timp și apoi colorate cu Hoechst 33342 (Invitrogen). Localizarea fiecărei celule a fost determinată utilizând microscopia fluorescentă (Nikon Eclipse TE2000-U; Nikon Instruments, Inc., Melville, NY), iar distanța migrată a fost evaluată folosind programul Matlab (MathWorks, Natick, MA). „Migrația totală” este definită ca suma distanțelor migrate de toate celulele dincolo de o locație inițială de pornire; acest indice de migrare este utilizat pentru analiza statistică (Figura 2).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
evaluarea migrației celulare în dispozitivele microfluidice. Celulele au fost placate în puțul inferior central al unui dispozitiv microfluidic, cu 50 ng / mL PDGF în mediu SMC plasat în puțul inferior stâng și mediu SMC singur plasat în puțul inferior drept, urmat de incubare la 37 cc timp de 48 h. (a, b) imagine de contrast de fază a chemotaxiei celulare de pe canalul central în direcția PDGF de 50 ng/mL în canalul stâng; imaginile sunt împărțite de-a lungul canalului între chiuvetă și puțurile sursă, astfel încât întreaga lungime a canalului să poată fi afișată la o mărire suficientă pentru a permite rezoluția celulară. (C, d) Imagine de contrast de fază a chemokinezei celulare din canalul central numai în direcția mediului SMC. (e, f) imagine fluorescentă de mică putere a stângii (e) sau a dreptei; (f) canal la 48 h după colorarea cu Hoechst 33342. (g) imagine fluorescentă de mare putere a canalului stâng din panoul (e); pătratul negru fără celule din partea dreaptă a imaginii (asterisc) este un post structural care marchează punctul de pornire pentru migrare. (h) exemplu de analiză a migrației. O linie roșie verticală denotă punctul de pornire; se măsoară distanța de la punctul de pornire la centrul fiecărui nucleu celular, iar suma tuturor acestor măsurători individuale devine distanța totală de migrare folosind Matlab.
colagenul de tip I (Invitrogen) este utilizat pentru a umple canalul dintre godeurile centrale și laterale și este substratul prin care celulele migrează. Se pot utiliza atât colagen de 1 mg/mL, cât și colagen de 2 mg/mL. Deși colagenul de 1 mg/mL are ca rezultat o chemokineză celulară nespecifică oarecum mai mare, iar încărcarea gelului este mai dificilă din punct de vedere tehnic decât cu colagenul de 2 mg/mL, concentrația mai mică de colagen permite o migrare mai mare a culturilor primare de SMC, iar sensibilitatea testului este mai bună. Dacă nu se specifică altfel, concentrația de colagen în canalele de migrare a fost de 1 mg/mL pentru toate experimentele.
2.7. Analiza statistică
comparațiile statistice au fost făcute folosind testul studentului sau ANOVA unidirecțională. Semnificația a fost definită la nivel.
3. Rezultate și discuții
așa cum se arată în Figura 3(a), proliferarea celulară este blocată de tratamentul MMC. Nu există nicio diferență semnificativă în viabilitatea celulară între SMC (%) tratat cu MMC și SMC (%) netratat timp de până la 48 de ore după tratament. Astfel, acumularea celulară în diferitele teste de migrare reprezintă o adevărată mișcare celulară fără nicio componentă a proliferării celulare. Acest lucru este important deoarece, fără tratamentul MMC, indicii de migrare din incubațiile pe termen lung pot fi confundați de proliferarea celulară coincidentă.
(a)
(B)
(c)
(d)
(a)
(B)
(c)
(d)
migrarea celulelor în testele Scratch și Boyden chamber. (a) inhibarea mitomicinei-c (MMC) a proliferării SMC. SMC tratate cu sau fără MMC (40 centig/mL timp de 30 min la 37 centigc) au fost placate în plăci cu 6 godeuri și ulterior recoltate. Numărul de celule a fost efectuat manual pe un hemocitometru după 1 h, 24 h și 48 h; numărul de celule este exprimat ca valoarea medie a deviației standard a triplicatelor. Excluderea trypan blue nu a arătat diferențe în viabilitatea celulară pe parcursul a 48 de ore (%). Tratamentul cu MMC conduce la un număr stabil de celule colectate la 24 de ore și 48 de ore, cu o proliferare semnificativ crescută la populațiile netratate cu MMC (). (b) Scratch test; nu s-au observat diferențe în ceea ce privește gradul de migrare între celulele cultivate în No chemokine față de 25-100 ng/mL PDGF; pe parcursul celor 3-6 ore ale acestui test, nu s-a observat nicio diferență semnificativă între celulele de control și cele tratate cu MMC. (c) testul Transwell; diferite concentrații de PDGF au fost adăugate în camera inferioară a dispozitivelor transwell la momentul zero; celulele de pe aspectul inferior al inserției transwell au fost enumerate după 6 ore, 12 ore sau 24 ore. Comparativ cu absența PDGF în camera inferioară, au existat un număr semnificativ mai mare de celule migrate în grupul PDGF de 10 ng/mL, 25 ng/mL și 50 ng/mL după 12 ore (). După 24 de ore, numerele de celule migrate în transwells cu 5-50 ng/mL PDGF nu au fost semnificativ diferite în raport cu camerele fără PDGF. După 24 de ore, numărul de celule migrate când 100 ng/mL PDGF a fost prezent în camera inferioară a fost redus semnificativ în raport cu grupul martor 0 ng / mL PDGF. (d) Chemokineza în transwells; aceeași concentrație de 50 ng/mL de PDGF a fost încărcată în camera inferioară, camera superioară sau ambele camere inferioare și superioare; migrația celulară a fost analizată după 6 ore, 12 ore sau 24 ore. în raport cu lipsa PDGF în nici o cameră, migrația celulară a fost semnificativ mai mare cu 50 ng/mL în camera inferioară la 12 ore (); până la 24 de ore, nu a existat nicio diferență semnificativă între camerele de control și 50 ng / mL PDGF. În special, adăugarea PDGF în camera superioară, cu sau fără PDGF în camera inferioară, a dus la o migrație semnificativ crescută la 12 ore în raport cu PDGF numai în camera inferioară ().
în testele de zgârieturi (Figura 3(b)) cu culturi SMC primare, celulele au migrat aleatoriu (chemokineză) pentru a completa defectele la rate comparabile, indiferent de concentrația PDGF, inclusiv în absența oricărui agent chemotactic. Fără tratamentul MMC, defectele plăgii tind să se închidă puțin mai devreme, sugerând un element de proliferare celulară.
Figura 3(c) prezintă rezultatele migrării pentru SMC utilizând testul Boyden chamber transwell. Punctul de timp timpuriu (12 ore) arată o migrare mică, dar semnificativ crescută, ca răspuns la 10-50 ng/mL PDGF față de nici o chemokină în puțul de jos. Cu toate acestea, nu a existat nicio diferență distinctă în migrare într-un interval de concentrație de 10 ori al PDGF, sugerând că testul este relativ insensibil, cel puțin pentru culturile SMC primare. Mai mult, până la 24 de ore, nu există diferențe între niciuna dintre concentrațiile de chemokine (inclusiv controlul mediu) care sugerează că migrația în acest moment este nespecifică odată ce concentrațiile de citokine au început să se echilibreze între godeurile de sus și de jos.
pentru a demonstra în mod oficial că migrarea peste membrană în puțul superior nu se datorează neapărat chemotaxiei direcționate, PDGF a fost adăugat la puțul superior, cu sau fără PDGF în compartimentul inferior. Chiar și în absența unui gradient de chemokină, PDGF în camera superioară a dus la o transmigrare semnificativ crescută (Figura 3(d)); Acest lucru poate fi atribuit doar chemokinezei crescute.
experimentele transwell, astfel, sugerează că, deși diferențele inițiale de concentrație PDGF pot induce un anumit grad de migrare celulară crescută către concentrații mai mari în godeurile inferioare, difuzia ulterioară a PDGF duce la chemokineză aleatorie.
în comparație, experimentele doză-răspuns utilizând dispozitivele microfluidice (Figura 4) demonstrează chemotaxie semnificativă la concentrații de până la 2.5 ng / mL PDGF (Figura 4 (b)) și prezintă o creștere dependentă de doză a chemotaxiei cu un vârf de aproximativ 25-50 ng/mL(Figura 4 (a)). Interesant este că concentrațiile mai mari de PDGF (de exemplu, 100 ng/mL) conduc la o migrare mai mică, în concordanță cu o arestare cu doze mari de chemotaxie (18). De remarcat, fără tratament MMC anterior, indicele de migrare este mai mare (figura 4 (a)), evidențiind contribuția nenegligibilă a proliferării la chemotaxia „aparentă” care apare cu timpi de testare mai lungi. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or „gold standard” Boyden chamber approaches.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Microfluidic device assay. (a) curbele doză-răspuns cu și fără tratament MMC anterior. SMC tratate și netratate au fost plasate în godeuri cu celule laterale, cu concentrații diferite de PDGF (5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL și 100 ng/mL) prezente în godeurile sursei centrale. Migrarea a fost măsurată după colorarea Hoechst 33342 și microscopia fluorescentă după 48 h, utilizând programul Matlab pentru a calcula migrarea totală. Controalele (numai Mediu SMC) și fiecare concentrație de PDGF au fost evaluate în dispozitive triplicate. Diferențe semnificative pot fi observate de la 5 ng/mL la 100 ng/mL PDGF comparativ cu martor (). (b) Chemokineza versus chemotaxia în dispozitivele microfluidice. SMC tratat cu MMC cu sau fără 2,5 ng/mL PDGF au fost placate în puțul celulei centrale; 2,5 ng/mL sau 50 ng/mL PDGF au fost adăugate în puțurile sursă laterale. Fără PDGF prezent în puțul celulei centrale, testul arată o migrare totală semnificativ mai mare după 48 de ore cu 50 ng/mL în puțul sursă („0-50”) față de 2,5 ng/mL în puțul sursă („0-2, 5”). Prezența a 2,5 ng / mL PDGF în puțul celulei centrale duce la o migrare totală semnificativ mai mare atunci când există un gradient de concentrație („2,5-50”; ) atribuibil unui efect local de chemokineză. În absența unui gradient („2,5-2,5”), există o migrare asociată chemokinezei, care este semnificativ mai mică decât migrarea observată atunci când este prezent un gradient („0-2, 5”;). (c) experiment de timp-curs efectuat ca panou (b).
nu numai că dispozitivul microfluidic poate fi utilizat pentru măsurarea chemotaxiei, dar poate distinge în mod specific contribuțiile chemokinezei și chemotaxiei la migrație (Figura 4(b)). Astfel, în absența unui gradient de chemokină (de exemplu, 2.5 ng / mL PDGF în ambele puțuri centrale și laterale), indicele de migrare reflectă chemokineza. În comparație, fără PDGF în puțul central și 2,5 ng/mL în puțul lateral, indicele de migrare reflectă chemotaxia direcționată. Dispozitivul microfluidic poate evalua, de asemenea, chemotaxia în prezența chemokinezei existente, ca atunci când puțul central conține 2,5 ng/mL PDGF, iar puțul lateral conține 50 ng/mL. Există o migrare mică, dar statistic mai mare, atunci când stimulul este mai degrabă un gradient chemotactic decât o chemokineză simplă.
deoarece gradientul de chemokină este stabilit în decurs de 2 ore (17) și este stabil timp de câteva zile, celulele pot migra continuu până la gradientul de concentrație în timp (Figura 4(c)). În comparație, alte metode clasice fie nu au gradient de concentrație (test de zgârieturi), fie au doar un gradient de chemokină tranzitorie, astfel încât chemokineza—mai degrabă decât chemotaxia direcționată—contribuie din ce în ce mai mult.
dispozitivul microfluidic raportat în această lucrare este superior în mai multe privințe în comparație cu alte abordări in vitro utilizate anterior pentru a studia chemotaxia. În special, camera Boyden-care implică un gradient de chemokină pe o membrană poroasă-a fost un test chemotactic standard încă din anii 1950. cu toate acestea, acest dispozitiv are limitări semnificative în sensul că gradienții nu sunt nici stabili, nici liniari, cu o creștere inițială a concentrației ascuțite care se deteriorează progresiv în timp. Mai recent, sistemele micro-electromecanice (MEMS) au fost dezvoltate tehnologii care utilizează biochipuri microfluidice pentru a imita condițiile in vivo; în aceste dispozitive, celulele sunt expuse continuu la forțe de forfecare sub flux controlat. Cu toate acestea, fluxul continuu al acestor dispozitive prezintă o provocare pentru menținerea gradienților stabili de chemokină. Deși hidrogelurile dintre sursă și canalul de chiuvetă pot crea gradienți de concentrație liniară , variațiile subtile ale puțurilor și canalelor pot genera gradienți de presiune care perturbă gradienții prin fluxul interstițial ; în plus, fluxul continuu al dispozitivelor tinde să dilueze orice chemoatractanți secretați de sursele celulare. În noul dispozitiv microfluidic descris anterior și validat pentru migrarea celulelor musculare netede în această lucrare, sursele de volum mare și puțurile de chiuvetă mențin gradienți de chemokină stabili în hidrogelul de legătură; orice flux interstițial este eliminat prin conectarea puțurilor sursă și chiuvetă cu canale și rezervoare suplimentare care servesc ca circuit rezistor-condensator. Gradienții de concentrație sunt, astfel, stabili și liniari timp de câteva zile. Lucrarea actuală a rafinat în continuare aplicația, încorporând tratamentul cu mitomicină – C pentru a reduce orice contribuție confuză a proliferării și demonstrând modul în care chemotaxia și chemokineza pot fi evaluate în aceeași configurație experimentală.
Conflict de interese
autorii declară că nu au niciun conflict de interese.
mulțumiri
această lucrare a fost susținută de un Grant de la BWH-BRI Fund pentru a susține excelența în cercetare-Bridge Research Grant. Chen Zhang a fost susținut de china Scholarship Council timp de 18 luni. Ovidiu C. Amati și Richard T. Lee a fost susținut parțial de centrul de știință și Tehnologie NSF CBET-0939511.
