animale

peștele zebră s-a menținut la 28,5 CTC pe un ciclu luminos de 14 ore pornit/10 ore oprit în soluția Danieau . Mutantul cristalin combinatorial (albb4 / b4;nacrew2/w2; roya9/A9) a fost generat prin încrucișarea secvențială a trei tulpini mutante unice diferite, și anume nacrew2/w2 (ref. 9), roya9 / a9 (ref. 4) și albb4 / b4 (ref. 18) mutanți. Important este că atât larvele, cât și peștii Zebra cristali adulți sunt viabili și nu prezintă anomalii morfologice, funcționale sau comportamentale vizibile, altele decât fenotipul pigmentării. Mutantul casper a fost obținut prin încrucișarea mutanților nacrew2/w2 și roya9/A9, așa cum s-a descris anterior4. Linia AB a fost utilizată pentru a obține pește zebră de tip sălbatic. Liniile transgenice utilizate în acest studiu includ Tg(elavl3:GCaMP5G)21 și Tg (elavl3:GCaMP6f)28. Experimentele imagistice funcționale confocale au fost efectuate la mutantul de perle. Experimentele imagistice cu foi ușoare au fost efectuate în sidef, casper și mutanți de cristal. Experimentele imagistice funcționale cu doi fotoni au fost efectuate în larve de cristal. Pentru tratarea larvelor de pește zebră cu PTU am urmat procedurile standard8, în special larvele au fost crescute în 200 de ptu (Sigma) în soluție de Danieau de la 24 de ore după fertilizare (hpf). Larvele TG (elavl3:GCaMP5G) utilizate pentru imagistica funcțională confocală a activității neuronale evocate vizual în tectumul optic au fost tratate cu 200 ptu de la 24 hpf la 3 dpf și imaginate la 4 dpf. Această lucrare a fost aprobată de organismul local pentru bunăstarea animalelor și revizuirea etică (King ‘ s College London) și a fost efectuată în conformitate cu Legea privind animalele (proceduri științifice) din 1986, sub licență de la Biroul de acasă al Regatului Unit (PPL70/8057).

imagistica

microscopie in vivo cu animale întregi

imaginile cu animale întregi ale peștilor Zebra adulți au fost realizate cu o cameră digitală SLR Nikon D7000 echipată cu un obiectiv macro Sigma de 150 mm. Peștii Zebra adulți au fost anesteziați cu 0.2% tricaină (MS222, Sigma) în apa instalației de pește și plasată într-un vas petri de 90 mm care conține apă din instalația de pește. Imagistica larvelor a fost realizată folosind un microscop ZEISS Axioskop conectat la camerele CCD EXi Blue (Retiga) și software-ul de achiziție Volocity (PerkinElmer). Peștii Zebra larvari au fost anesteziați cu 0,02% tricaină în soluție de Danieau și imobilizați în 1% agaroză cu punct de topire scăzut (Sigma) pe lamele de sticlă.

imagistica confocală cu calciu

imagistica a fost realizată cu ajutorul unui microscop confocal ZEISS lsm 710 echipat cu un cap de scanare cu detecție spectrală și un 20X / 1.0 na obiectiv imersiune în apă (Carl Zeiss). Seriile temporale funcționale ale răspunsurilor de calciu evocate vizual în celulele ganglionare retiniene (RGC) au fost dobândite la o rată de 4,1 Hz și 0,415 0,415 0,415 rezoluție (256 256 pixeli) și 1 AU deschidere a orificiului. Lumina de excitație a fost furnizată de un laser cu mai multe linii de 488 nm. Larvele TG neanestezizate (elavl3: GCaMP5G) au fost imobilizate în agaroză cu punct de topire scăzut de 2% (Sigma) preparată în soluție de Danieau și montată cu partea dorsală în sus pe o platformă de sticlă ridicată care a fost plasată într-o cameră umplută cu Danieau la comandă. Agaroza a fost suficientă pentru a reține larvele, astfel încât anestezia să nu fie necesară. Imagistica a fost efectuată după-amiaza (1-8 pm).

imagistica în foi de lumină

imagistica în foi de lumină cu creier întreg a fost realizată folosind un microscop ZEISS Lightsheet Z. 1 echipat cu două obiective de iluminare de 10X/0,2 NA și un obiectiv de detectare prin imersie în apă de 20x / 1,0 NA (Carl Zeiss). Lumina de excitație laser de 488 nm a fost utilizată pentru a obține fluorescența GCaMP6f și un filtru de 505-545 BP a fost utilizat pentru detectarea luminii emise. Scanerul pivot (Carl Zeiss) a fost utilizat pentru a oferi o iluminare omogenă și, prin urmare, pentru a evita umbrele de-a lungul axei de iluminare. Grosimea tablei luminoase a fost de 5,39 MMC la centru și 10,8 MMC la marginile câmpului vizual. Timpul de expunere a fost 29.97 ms. Dimensiunea imaginilor volumetrice a fost de 623 x 798 x 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 pixeli), cu o rezoluție de 0.415 × 0.415 × 0.631 µm. 4 DPF nacre, casper și crystal TG(elavl3:GCaMP6f) larvele au fost paralizate pentru prima dată timp de 10-15 minute în X-bungarotoxină (1 mg/ml; Biotium) preparată în soluție de Danieau. Ulterior, larvele au fost imobilizate în agaroză cu punct de topire scăzut de 2% (Sigma) și plasate în interiorul unui capilar de sticlă (volum de 20 unqql, 701904; marcă). Ulterior am extrudat secțiunea cilindrului de agaroză care conține capul larvei din capilar și am orientat larvele astfel încât partea dorsală a capului să fie orientată spre obiectivul de detectare, iar ochii să fie orientați spre cele două obiective de iluminare. Imagistica cu tablă de lumină a creierului întreg al larvelor mutante casper a fost realizată folosind un microscop cu tablă de lumină personalizat construit de Dr.Martin Meyer (King ‘ s College London) și echipat cu un obiectiv de detectare xlumplanfln cu imersie în apă de 20x/1,0 NA (Olympus).

imagistica cu calciu cu doi fotoni

imagistica funcțională cu doi fotoni în retină a fost realizată folosind un microscop Nikon A1R MP echipat cu un GAASP NDD cu 4 canale și un obiectiv Apochromat 25x / 1.1 NA imersiune în apă (Nikon). Excitația a fost asigurată de un laser de titan-safir blocat în modul Chameleon Ultra II (coerent) reglat la 930 nm. Seriile de timp ale răspunsurilor de calciu evocate vizual au fost obținute la o rată de 4 Hz și 0,248 0,248 0,248 pixeli (512 256 pixeli). După activarea scanării laser, am așteptat 60 de secunde înainte de a începe stimularea vizuală pentru a asigura retina adaptată la nivelul luminii de fundal cauzat de laserul multi-foton. 4 DPF crystal TG(elavl3:GCaMP6f) larvele au fost paralizate pentru prima dată timp de 10-15 minute în X-bungarotoxină (1 mg/ml; Biotium) preparată în soluție de Danieau. Ulterior, larvele au fost imobilizate în agaroză cu punct de topire scăzut de 2% (Sigma) și montate pe o platformă de sticlă ridicată la comandă, cu partea dorsală în sus (înclinare cu unghi de 45%) și un ochi orientat spre un ecran LCD (vezi stimularea vizuală) care a fost plasat sub o cameră umplută cu Danieau la comandă. Imagistica a fost efectuată după-amiaza (1-8 pm).

stimularea vizuală

barele în mișcare în prepararea confocală

stimulii barelor în mișcare au fost generați așa cum s-a descris anterior22,33. Un filtru de difuzie (3026, Rosco) a fost lipit de o parte a camerei pentru a servi drept ecran de proiecție. Agaroza din fața ochiului orientată spre ecranul de proiecție a fost îndepărtată, permițând o vedere neobstrucționată a imaginii proiectate pe partea laterală a camerei. Larvele au fost poziționate la o distanță de 3 cm față de ecran, iar imaginea proiectată a umplut un câmp vizual de ~97 xtct 63 xtct. Stimulii vizuali au constat în lumină (56 cd/m2) sau bare întunecate (8 cd/m2) (175% și, respectiv, 25% din luminanța medie) pe un fond gri mediu (32 cd/m2). Deoarece nu s-au observat diferențe calitative între barele luminoase și cele întunecate, datele obținute utilizând cei doi stimuli au fost combinate. Fiecare bară avea o lățime de 10 centimetrii care se deplasa cu o viteză de 20 centimetrii/s și era separată de bara precedentă cu 30 centimetrii, permițând mai mult de o bară pe ecran în orice moment. Axele lungi ale barelor erau ortogonale în direcția mișcării. Fiecare dintre cele 12 direcții de mișcare a fost prezentată o dată (3 secunde) într-o ordine pseudo-aleatorie unică pentru fiecare felie din fiecare animal imaginat. Fiecare interval inter-epoch a fost de 10 secunde pentru a permite semnalelor GCaMP5G să revină la valoarea inițială. O condiție nulă a ecranului gol de 2 secunde a fost, de asemenea, intercalată. Experimentele vizuale au fost generate și controlate folosind Labview și Codul MATLAB (MathWorks), implementate pe un prezentator de stimulare a Vizajului (Cambridge Research Systems) și livrate printr-un proiector Pico DLP (Optoma).

grătare în mișcare în pregătirea cu doi fotoni

grătare în mișcare stimulii în pregătirea cu doi fotoni au fost Generați și controlați folosind Psihopia39 și livrați printr-un ecran LCD (SKD5VA-3, tehnologia GoodWell) poziționat sub o cameră Perspex personalizată. Un filtru de sticlă roșie cu trecere lungă (FGL610, Thorlabs) a fost poziționat între ecranul LCD și cameră pentru a permite imagistica simultană și stimularea vizuală. Larvele au fost poziționate la o distanță de 2 cm față de ecran, iar imaginea de pe ecranul LCD a umplut un câmp vizual de ~140 XCT 100 XCT (luminanța medie de fundal 30,4 cd/m2). Stimulii vizuali au constat din grătare cu undă pătrată (contrast 100%, frecvență spațială 1,66 cicluri/cm, frecvență temporală 1 cicluri/s). Fiecare bară de grătare avea o lățime de 8,5 centimi, iar axele lungi ale barelor erau ortogonale față de direcția de mișcare. Fiecare dintre cele 12 direcții de mișcare a fost prezentată o dată (6 secunde) cu un interval inter-epoch de 10 secunde pentru a permite semnalelor GCaMP6f să revină la linia de bază. O condiție nulă a ecranului gol de 6 secunde a fost, de asemenea, intercalată. TTL declanșează (0-5-0 volți) pentru a înregistra evenimente epoch time unde sunt generate printr-un dispozitiv LabJack USB DAQ (U3-LV, LabJack Corporation). După activarea scanării laser, am așteptat 60 de secunde înainte de a începe stimularea vizuală pentru a asigura retina adaptată la nivelul luminii de fundal cauzat de laserul multi-foton.

test de răspuns Optomotor

larvele individuale de 5 dpf au fost poziționate într-un vas petri de 35 mm conținând soluția de Danieau. Ecranul LCD al unui iPhone 5 (Apple) controlat de un MacBook Pro (Apple) prin intermediul afișajului Duet (Kairos Technologies) a fost utilizat pentru a afișa grătare cu undă pătrată alb-negru (contrast 85%, frecvență spațială 0,33 cicluri/mm, frecvență temporală 3,5 cicluri/s) deplasându-se în 4 direcții (90 distanță unghiulară la sută) în partea de jos a vasului petri. Stimulii vizuali au fost generați în Keynote (Apple). Fiecare larvă a fost testată de 5 ori în total (fiecare încercare a durat 6 s urmată de 10 s de grătare statice) și a fost punctată în funcție de încercările la care a răspuns (adică peștele se întoarce și înoată în direcția grătarelor în mișcare). Comportamentul larvelor a fost monitorizat vizual cu ajutorul unui stereomicroscop M165 FC (Leica).

analiză

analize funcționale

datele imagistice in vivo privind calciul au fost analizate conform descrierii anterioare22,33. În rezumat, seriile de timp funcționale au fost procesate înainte de analiză după cum urmează: imaginile din seria de timp din fiecare experiment au fost corectate pentru mișcare cu un algoritm cu corp rigid (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), median filtrat cu o dimensiune a nucleului de 1 voxel pentru a elimina zgomotul întunecat și împușcat și netezit spațial cu un nucleu Gaussian 2d = 2 voxeli pentru a îmbunătăți semnalul la zgomot. O linie de bază (B) care corectează drifturile de joasă frecvență a fost determinată folosind un algoritm cubic-spline extrapolând între noduri în medie de la 5 s din datele intervalului inter-epocă. Ambele modificări ale intensității relative a semnalului (XVF = F-B; unde F = fluorescența brută) și modificările normalizate ale intensității semnalului au fost calculate la fiecare voxel. Pentru datele funcționale ale populației (analiza voxel-wise), s-a utilizat un procent de 7FF/F0 pentru regiunile de interes definite manual (Roi). Pentru fiecare voxel sau ROI răspunsul integral pe intervalul de epocă a fost calculat pentru a oferi o singură metrică de răspuns a fiecărei direcții prezentate de mișcare a stimulului. Integrala din fiecare fereastră de epocă este o metrică sumară mai rezistentă la efectele de saturație ale sondei de calciu decât schimbarea maximă a semnalului. Un prag pentru fiecare voxel dintr-o secvență de imagine de achiziție a fost determinat din variația modificărilor de la 0FT în intervalele inter-epoch și condiția nulă, prag = 5 FDS de la 7ft. Toți voxelii care au fost supra-prag în cel puțin două epoci de prezentare vizuală au fost considerați ca fiind receptivi vizual și supuși unei caracterizări ulterioare.

pentru a analiza direcția și selectivitatea orientării indicilor selectivi de direcție și Orientare voxeli receptivi vizual (DSI și OSI)40, pe baza profilurilor von – Mises sau Gaussi41 montate, au fost calculate împreună cu o estimare pentru bunătatea lor de potrivire, R2. DSI a fost definit ca (Rpref-Rnull)/(Rpref + Rnull), unde Rpref, răspunsul la direcția preferată, a fost răspunsul integral pe intervalul de epocă al Direcției preferate. Rnull a fost calculat în mod similar ca răspuns integral evocat de direcția opusă direcției preferate. OSI a fost definit ca (Rpref-Rorth)/(Rpref + Rorth), unde Rpref, răspunsul la orientarea preferată, a fost răspunsul integral pe intervalul de epocă de orientare preferată. Rorth a fost calculat în mod similar ca răspuns integral evocat de orientarea ortogonală. Pentru a minimiza discuțiile încrucișate și potrivirea excesivă asociată cu valorile DSI și OSI, a fost întreprinsă o abordare strictă. Pentru ca un voxel să fie considerat selectiv pe direcție (DS) sau selectiv pe orientare (OS), s-au folosit criterii care se exclud reciproc: DS if DSi > 0,5 și OSI < 0.5; și OS dacă OSI> 0.5 și DSI< 0.5. În ambele cazuri, bunătatea fit (R2) pentru DSI și, respectiv, OSI, a trebuit să fie >0,8; astfel, curbele montate au explicat cel puțin 80% din răspunsurile integrale. O singură distribuție von-Mises a fost utilizată pentru a se potrivi răspunsurilor voxelilor DS și pentru a estima direcția preferată a unghiului de mișcare din centrul curbei montate. Suma a două von-Mises (distanță unghiulară de 180 de centimi) a fost utilizată pentru a se potrivi răspunsurilor voxelilor OS și pentru a estima orientarea preferată a unghiurilor de mișcare din centrele curbelor montate. Varianța circulară a fost, de asemenea, calculată pentru comparație ca o metrică alternativă a selectivității orientării (varianța circulară < 0.4)41.

analize morfologice

pentru a determina volumul creierului imaginat în 4 DPF sidef, casper și crystal TG (elavl3:Gcamp6f) larve, am calculat numărul de GCaMP6f + voxeli în fiecare imagine volumetrică prin aplicarea funcției adjust >prag urmată de analiza>histogramă>comandă listă în ImageJ42. Ulterior, valorile obținute au fost înmulțite cu volumul unui singur voxel(0,415 0,415 0,631 0,631 0,3 = 1,086 10-1 1,3).

analize statistice

rezultatele testelor statistice sunt raportate în cifre și legende. Analizele și testele statistice au fost efectuate folosind Prism 6 (GraphPad) sau MATLAB R2014b (MathWorks). Înainte de a efectua teste statistice, statistici descriptive (de exemplu, teste de normalitate pentru a vedea dacă valorile provin dintr-o distribuție Gaussiană sau F-test pentru a compara varianțele) au fost utilizate pentru a alege testul statistic adecvat (raportat în legendele figurilor împreună cu rezultatele testelor). Criteriul semnificației statistice a fost stabilit la p < 0,05.