materialele vegetale și condițiile de creștere

plantele sălbatice și mutante utilizate în acest studiu au fost toate în ecotipurile Col-0, cu excepția liniilor RGA-GFP-RGA10, care au fost în ecotipul Ler. semințele phyB-931 au fost obținute de la Centrul de resurse biologice Arabidopsis. Liniile de supraexprimare PIF4 și mutațiile knockout pif4 (mutant slr2) au fost cele descrise în ref. 3. Mutanții dubli pif4 pif5 au fost obținuți prin încrucișarea alelei de inserție a ADN-ului T pif4-101 și a mutantului SALK-08701218 cu o inserție în gena PIF5. 20ox linii care transportă o inserție de ADN t knockout în gena AtGA20ox1 (At4g25420) au fost furnizate de P. Hedden. Liniile Gai insensibile GA au exprimat proteina Gai stabilă sub controlul promotorului 35S. Mutanții dubli și tripli au fost generați prin încrucișarea acestor linii și genotiparea descendenților prin amplificarea PCR sau analize northern blot.

semințele au fost sterilizate la suprafață și semănate pe plăci de agar GM fără sucroză32. Plăcile au fost tratate la rece timp de 2 d la 4 C și germinarea a fost sincronizată cu 3 h de iradiere cu lumină albă și incubarea ulterioară în întuneric timp de 22 h, înainte de transferul la diferitele condiții de creștere. Alb-lumina-cultivate răsaduri au fost cultivate la 20 centi C sub fluorescență lumină albă (rata de fluență de 40-60 centi m-2 s-1) cu o lumină 16 h/ 8 h întuneric fotoperioadă. Pentru tratamentele cu lumină roșie, puieții au fost crescuți sub lumină roșie continuă (rata de fluență de 35 centimol m-2 s-1 furnizată de LED-uri). Pentru răsadurile de culoare închisă, plăcile au fost învelite în mai multe straturi de folie de aluminiu. Plăcile au fost plasate într-o orientare verticală și scanate pentru lungimea hipocotilului folosind software-ul ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). Pentru tratamentul PAC, semințele au fost transferate pe plăci cu inhibitor, după inducerea germinării. Au fost măsurate cel puțin 20 de răsaduri pentru fiecare set de experimente.

transformarea plantelor

un fragment ADN complementar care include ORF de lungime întreagă a PIF4 a fost amplificat cu primeri PIF4-GFPf și PIF4-GFPr, clonat în vectorul pENTR/D-TOPO (Invitrogen) și introdus în vectorul binar pK7FWG2 (http://www.psb.ugent.be/gateway/) cu clonaza LR (Invitrogen). Acest construct binar a fost introdus în tulpina Pgv3101 de Agrobacterium și transformat în plante Col-0 și Phyb Arabidopsis de tip sălbatic, folosind metoda de transformare a scufundării florale33. Transformanții au fost selectați pe mediu care conține kanamicină și analizați pentru fluorescența nucleară PIF4–GFP. Liniile homozigote au fost selectate pentru Expresoare puternice.

tratamentele GA, PAC și MG132

stocurile GA3 (GA) și paclobutrazol (PAC) au fost preparate proaspăt în etanol. Inhibitorul proteazomului MG132 a fost dizolvat în DMSO. Pentru tratamentul cu MG132, răsadurile au fost pre-incubate timp de 2 ore într-o soluție de inhibitor de 100 MMC. Tratamentele PAC și GA au fost efectuate la 0,1 și, respectiv, 50, dacă nu este indicat. Sensibilitatea la inhibitor a fost calculată ca raportul inversat al reducerii lungimii hipocotilului observat pentru răsadurile cultivate în PAC de 0,1 MMC față de reducerea observată la plantele Col-0 (100%). Valorile sunt Media a trei experimente independente. Sensibilitatea GA a fost calculată ca raportul dintre creșterea lungimii hipocotilului răsadurilor în 5,0 mm GA3 și se face referire la răsadurile Col-0 de tip sălbatic, ca înainte.

drojdie două-hibrid teste

della represoarele sunt codificate în cartofi de cel puțin două gene, transcrierea reprezentată de tag-ul de secvență exprimat TC113247 fiind cel mai abundent exprimat în țesuturile vegetative. Cadrul de citire deschis pe toată lungimea pentru această proteină DELLA a fost amplificat folosind primeri FPG1 și FPG2 și introdus în cadru cu GAL4-BD în vectorul pBridge (Clontech). Pentru a evita activitatea de autoactivare asociată cu această construcție de lungime completă, construcțiile n-end (reziduurile de la 1 la 188), F1 (reziduurile de la 1 la 362), M5 (reziduurile de la 188 la 588) și Cter (reziduurile de la 362 la 588) fuzionate cu GAL4-BD au fost obținute prin digestie la locurile unice de restricție SpeI și EcoRI. Plasmidele care conțin aceste construcții, vectorul pbridge gol (pGB) sau o fuziune p53–GAL4BD în vectorul pgbkt7 (control) au fost transformate în celule de drojdie AH109 și placate pe plăci SD-Trp și SD-Trp-Ade-His, pentru a testa activarea bazală (suplimentar Fig. 1). Tulpinile de drojdie care conțin construcțiile F1, M5 sau Cter au dat cea mai mică activitate de fond și au fost folosite ca momeală. Celulele de drojdie care conțin aceste construcții au fost transformate cu o bibliotecă de ADN complementară de cartofi de frunze fuzionată cu GAL4-AD în vectorul pAD-GAL4 (Stratagene) și 1-3 106 transformanți independenți de la sută selectați pe SD-Leu-Trp-Ade-His pentru interacțiune pozitivă.

un fragment de ADN corespunzător proteinei de lungime completă Arabidopsis PIF4 a fost generat prin amplificarea PCR cu primeri PIF4yf și PIF4yr și introdus în situsul EcoRI al vectorilor de drojdie pGBKT7 și pGADT7. Construcțiile pentru fuziunile Arabidopsis PIF3-GAL4BD și PIF3–GAL4AD au fost furnizate de P. Quail.

construcțiile de deleție pentru proteinele DELLA și PIF4 au fost obținute prin reacția PCR inversă pe construcțiile RGA–BD și PIF4–AD în vectorii pbridge și pAD-GAL4. Construcțiile del1RGA și del2RGA au fost generate folosind primeri RGAdel1 sau RGAdel2 și pBridBam, care introduc un site de restricție BamHI la fiecare capăt. Pentru a genera constructe del1PIF4, del2PIF4 și del3PIF4, site-ul unic XbaI în polilinker pAD-GAL4 a fost șters de completare. Această plasmidă a fost apoi utilizată ca șablon pentru reacții PCR inverse cu primeri PIF4del1, PIF4del2 sau PIF4del3 și pGADXba, introducând un site de restricție XbaI la fiecare capăt. Produsele PCR au fost digerate fie cu BamHI, fie cu XbaI, religioase și transformate în Escherichia coli pentru a obține diferitele construcții. Aceste plasmide au fost transformate în tulpina de drojdie AH109 și placate pe plăci SD-4 pentru a testa interacțiunea. activitatea galactozidazei a fost determinată pe culturile lichide ale acestor transformanți utilizând substratul ONPG și condițiile protocolului standard.

construcțiile echivalente cu fragmentul de cartof RGA M5 pentru genele Arabidopsis DELLA RGA1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) și RGL3 (At5g17490) au fost generate prin amplificarea PCR cu seturile de grunduri RGL1pGB-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r, rgapgb-F/Rgapgb-R și RGAPGB-F/Gaipgb – r (tabelul suplimentar 1). Aceste fragmente au fost inserate în vectorul drojdiei pGBKT7 folosind enzimele de restricție BamHI / SalI pentru RGL1, SalI/PstI pentru RGL3 și BamHI/PstI pentru RGA1 și GAI.

teste Pull-down

un fragment de ADN care codifică proteina de lungime completă Arabidopsis RGA a fost obținut prin amplificarea PCR cu primeri RGAgst-f și RGAgst-r și clonat în situsul BamHI al vectorului pZEX, pentru a obține o fuziune în cadru cu regiunea de codificare GST. Vectorul RGA-pZEX și vectorul pzex gol au fost transformate în tulpina E. coli BL21(de3)pLysS (Stratagene) și culturile acestor celule au crescut la 37 C la un D600 = 0,8. Exprimarea proteinelor GST a fost indusă cu 1 mm IPTG, timp de 3 ore suplimentare la 30 centicc, iar extracția proteinelor și legarea la bilele de glutation-Sepharoză (Clontech) au fost efectuate conform protocolului furnizat de producător.

construcțiile phya pif4, PIF3 și carboxi-terminale din vectorul pGBKT7 au fost utilizate ca șabloane pentru transcriere / traducere in vitro, în prezența 35S-metioninei, utilizând sistemul TnT (Promega). În fiecare reacție s-a utilizat ADN plasmidic (1 hectolitru). Pentru pull-down, 10 unqql din reacțiile de translație au fost incubate timp de 30 min cu bile RGA–GST și GST (1 unqq de proteină legată de bile) în PBS, 0,05% tergitol, 10% glicerol. Margelele au fost spalate bine, omogenizate in tamponul de incarcare a 2–a si analizate prin SDS-PAGE pentru legarea de proteine.

teste de Expresie tranzitorii

fragmente de ADN care codifică proteinele Arabidopsis full-length PIF4 și RGA, iar delețiile de la ECCRGA și del1RGA au fost obținute prin amplificarea PCR cu perechi de primeri PIF4yf și PIF4yr, RGAgst-f și RGAgst-r, NEKRGA-f și RGAgast-r și del1RGA-f și Rgagst-r și inserate site-uri ale vectorului pjit60, sub controlul promotorului 2 35S de la circulatie. Un fragment de motiv G-box raportat de testele de schimbare a gelului ca fiind un element țintă pentru recunoașterea PIF434 a fost fuzionat cu gena reporter GUS și utilizat ca Construct reporter. Nu am putut detecta stimularea mediată de PIF4 a acestui construct reporter, indicând faptul că secvențele nucleotidice suplimentare din jurul motivului CACGTG ar putea fi necesare pentru activarea eficientă. Pentru a căuta un element promotor adecvat pentru a fi utilizat în aceste teste, au fost efectuate experimente preliminare de profilare ARN a mutanților 35S-PIF4 și pif4, identificând astfel LTP3 (At5g59320) ca o transcriere puternică reglată în sus în răsadurile 35S-PIF4. Regiunea promotor pentru această genă a fost amplificată folosind primeri LT3p-f și LTP3p-r și inserată în siturile EcoRI și BamHI ale vectorului pGUS pentru a obține constructul reporter LTP3-GUS. Fuziunea 2 35S-luciferază a fost utilizată ca control intern. Celulele Arabidopsis au fost răspândite pe hârtie de filtru și incubate peste noapte pe mediu LT87 (4,4 g L-1 Murashige și săruri Skoog + vitamine, 0,5 g l-1 MES, 0,5 g L-1 NAA, 30 g L-1 zaharoză, 8 g L-1 agar). Cu două ore înainte de bombardament, filtrele au fost transferate în mediul LT87 cu manitol de 200 mM pentru a induce retragerea vacuolului. Precipitarea ADN și bombardarea particulelor au fost efectuate folosind un accelerator de particule acționat de heliu (PDS-1000; Bio-Rad), conform instrucțiunilor producătorului. Celulele au fost transformate cu 0,5 µg de LTP3-GUS reporter plasmidic + 0,5 µg de 2×35S-LUC standard intern, și 2 µg de pJIT60 gol vector (LTP3), 1 µg de 2×35S-PIF4 efectoare construct + 1 µg pJIT60 (PIF4), sau 1 µg din fiecare 2×35S-PIF4 și 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA sau 2×35S-del1RGA efectoare constructe (PIF4 + RGA, PIF4 + ΔRGA, PIF4 + del1RGA). Filtrele au fost transferate pe plăci LT87 proaspete (- GA) sau pe plăci LT87 + 50 mm ga3 (+GA) și incubate timp de 16 ore. celulele au fost extrase în tamponul de liză celulară furnizat în kitul de testare a Luciferazei (Promega) și eliminate prin centrifugare la 12.000 g timp de 5 min. Activitatea LUC a fost determinată în funcție de activitatea kit și GUS determinată prin testul fluorometric35. Activitatea promotorului LTP3 a fost calculată ca raportul dintre GUS și activitatea LUC în fiecare eșantion. Pentru fiecare tratament au fost utilizate patru plăci de replică.

extracții de ARN și revers transcriptază (RT)–PCR

pentru analizele de expresie genetică, ARN-ul total a fost extras din răsaduri vechi de 4 zile folosind metoda guanidine-Hcl36 și ulterior tratat cu DNaseI (Roche) înainte de curățare prin Mini coloane Qiagen Rneasy (Qiagen). ARN-ul (1 hectolitru) a fost utilizat pentru sinteza ADNc de primă catenă utilizând kitul de arhivă ADNc de mare capacitate (biosisteme aplicate) și 1,0 ect din această reacție a fost utilizat ca șablon pentru amplificarea PCR. Seturile de grunduri AtLTP3-f/AtLTP3-r, Atexpan-f/Atexpan-r și Atactin8-f / Atactin8-r au fost utilizate pentru amplificarea transcrierilor LTP3 (At5g59320), XV-expansin (At2g20750) și actin-8 (At1g49240).

testele de completare a fluorescenței Bimoleculare (BiFC)

secvențele cadrului de citire deschis de lungime întreagă pentru proteinele Arabidopsis PIF4 și RGA au fost amplificate cu primeri PIF4YFP-f/ PIF4YFP-R și, respectiv, RGAYFP-f / RGAYFP-R. Produsele PCR au fost clonate în vectorul pENTR / D-TOPO (Invitrogen) și inserate prin reacția LR (Invitrogen) în vectorii binari pBiFC (F. Parcy) conținând fragmentele amino-sau C-terminale ale proteinei fluorescente eYFP (eYFPN și eYFPC). Toate cele opt combinații posibile în perechi ale acestor construcții au fost transformate în Agrobacterium tumefaciens și co-infiltrate în suprafața abaxială a plantelor Nicothiana benthamiana de 2-3 săptămâni, așa cum este descris37. Proteina p19 a virusului stufos stunt de roșii a fost utilizată pentru a suprima reducerea la tăcere a genelor. Tulpinile de Agrobacterium conținând construcțiile pBiFC și plasmida de tăcere p19 au fost la un raport D600 de 0,7: 0,7: 1 pentru infiltrare. Fluorescența a fost vizualizată în straturile celulare epidermice ale frunzelor după 2 zile de infiltrare, folosind un microscop fluorescent Leica DMR. Frunzele au fost incubate cu 1 ml-14′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) pentru colorarea nucleelor.

pif4/RGA–GFP Co-imunoprecipitări

studii de Co-imunoprecipitare a proteinelor RGA și PIF4 au fost efectuate pe răsaduri transgenice RGA-GFP-RGA vechi de 7 zile10 cultivate sub lumină albă. Răsadurile au fost fie incubate în întuneric, fie transferate în mediu care conține PAC sau GA și incubate timp de 12 ore suplimentare înainte de extracție. Imunoprecipitarea proteinei GFP-RGA a fost efectuată la 4 centimetric C timp de 6 ore, utilizând un anticorp anti-GFP (Santa Cruz Biotechnology) într-un tampon conținând 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mm Naci, 0,5% Triton X-100, PMSF (1 mM) și inhibitori de protează (Sigma). Proteina G agaroză (Sigma) a fost utilizată pentru precipitarea complexelor imunoproteice. Detectarea PIF4 a fost efectuată cu un anticorp anti-PIF4.

imunoprecipitările cromatinei și amplificările PCR

testele de Imunoprecipitare a cromatinei au fost efectuate conform descrierii anterioare29. Răsadurile pif4-HA20 au fost cultivate pe mediu GM timp de 6 zile sub lumină roșie continuă și apoi au fost transferate pe plăci care conțin fie GA, fie PAC și păstrate peste noapte în întuneric. Pentru imunoprecipitarea cromatinei s–au utilizat puieți (1,5-2 g) și 40 de centicli din matricea de afinitate anti-HA (Roche). ADN-ul precipitat a fost dizolvat în 50 ilqtl de TE, iar 0,5 ilqtl a fost utilizat pentru amplificarea PCR utilizând primerii enumerați în tabelul suplimentar 1. Condițiile PCR au fost următoarele: 94 CTF pentru 2 min, 35 cicluri de 94 CTF pentru 15 s, 55 CTF pentru 30 s și 72 CTF pentru 30 s, urmate de 72 CTF pentru 7 min. ADN-ul de intrare sonicat (0,3%) a fost utilizat pentru un control cantitativ. Analizele Western blot au fost efectuate pentru a cuantifica cantitatea de proteină pif4 recuperată după imunoprecipitarea cromatinei. Bloturile au fost imunodetectate cu un anticorp anti-HA peroxidază cu afinitate ridicată (Roche).

microscopie

testele de stabilitate a proteinelor au fost efectuate cu ajutorul sistemului de scanare laser Radiance 2100 (Bio-Rad) cuplat la un microscop Zeiss Axiovert 200. Pentru GFP și excitația clorofilei, au fost utilizate un laser cu ioni de argon la lungimea de undă de 488 nm și, respectiv, o diodă roșie la 637 nm. Combinația de filtre utilizate a fost: 560 dclpxr Beam splitter și HQ 515/30 filtru de emisie pentru GFP, și HQ 660LP pentru detectarea clorofilei. Imaginile au fost realizate secvențial folosind software-ul LaserSharp v5.0 (Bio-Rad) și fuzionate folosind software-ul de imagine LaserPix v. 4 (Bio-Rad).

gel-shift assay

oligonucleotidele pLTP-WTF/r și pLTP-MUTf / r au fost utilizate pentru a genera sondele LTP3 și concurenții specifici utilizați în testele EMSA. Oligonucleotidele au fost recoapte într-un tampon enzimatic de restricție de 5 oct m și etichetate final prin completarea cu Klenow. Pentru extractele de proteine, N. frunzele de benthamiana au fost infiltrate cu tulpinile de Agrobacterium pentru construcțiile 35S–PIF4-HA (PIF4) și 35S–RGA-GFP (RGA) sau cu un amestec 1:1 (PIF4 + RGA) ale acestor tulpini și cu constructul p19 așa cum este descris mai sus. Extractele de frunze au fost obținute prin omogenizare în tampon de sare ridicat (20 mm HEPES, pH 7,9, 0,5 m KCl, 1 mm EDTA, 1 mM MgCl2, 0,5% nonidet P-40, 1 mM DTT, + inhibitor de protează), curățare prin centrifugare și Dializă ulterioară față de 1 October BB (20 mm HEPES, pH 7,9, 0,1 m KCl, 1 mm EDTA, 0,05% nonidet P-40, 0,5 mM DTT, 10% glicerol). Prezența unor cantități echivalente de proteine PIF4 și RGA în extracte a fost evaluată prin detectarea western blot cu anticorpi anti-HA (Roche) și anti-GFP (Santa Cruz). Pentru reacția EMSA s-au utilizat cantități tot mai mari din aceste extracte (5,0, 10,0, 15,0 ECQ). Extractele au fost incubate timp de 15 minute la temperatura camerei cu sonda etichetată și 100 ng poli (dI-dIC) în 20 xtil 1 xtil bb și separate cu 6% PAGE în 0,5 xtil TBE. Un exces de 100 de ori de oligonucleotide recoapte de tip sălbatic (WT) și mutant (MUT) a fost utilizat pentru o concurență specifică.