rezultate

am evaluat mai întâi dacă CD63 și H,K-ATPază locuiesc în același compartiment subcelular în celulele parietale gastrice. Lucrările anterioare au arătat că celulele parietale de șobolan exprimă niveluri ridicate de CD63 (22). Microscopia de imunofluorescență pe secțiuni înghețate ale stomacului de șobolan indică faptul că CD63 este prezent în majoritatea celulelor din stomacul de șobolan, inclusiv celulele parietale (Fig. 1A). CD63 colocalizează parțial cu HKa în celulele parietale. În plus, am analizat un preparat TVE foarte purificat din stomacul de porc (un cadou amabil de la C. T. Okamoto). H, K-ATPaza contribuie cu 50% din conținutul de proteine în preparate similare (23). Analiza Western blot indică faptul că CD63 este prezent abundent în acest preparat purificat de TVEs (Fig. 1B).

pentru a investiga o posibilă interacțiune in situ între CD63 și H,K-ATPaza, am efectuat experimente pull-down folosind lectină de tomate biotinilată. Studiile anterioare au arătat că această lectină se leagă în mod specific și unic de HK XV în preparatele gastrice (24-27). Am șters un preparat TVE cu anti-HK XQC Mab și lectină de tomate biotinilată pentru a confirma că lectina se asociază în mod specific cu HK XQC glicozilat (Fig. 1C). Apoi am folosit lectina de tomate biotinilată pentru a izola proteinele care interacționează cu HK-ul în preparatul TVE. Analiza Western blot indică faptul că CD63 este precipitat de lectina de roșii (Fig. 1D), demonstrând că CD63 și H, K-ATPase se asociază in situ și sugerând că această asociere poate fi relevantă fiziologic. Pretratarea preparatului TVE cu SDS de 4%, urmată de o diluare de 20 de ori în tampon de liză, a redus semnificativ cantitatea de CD63 care a fost precipitată. Cantitatea de HK-uri care a fost precipitată nu a fost modificată de acest tratament (datele nu au fost prezentate). Aceste date sugerează că prezența CD63 în pull-down este atribuibilă asocierii sale cu HK XV și nu unei asocieri directe între CD63 și lectina de tomate.

pentru a investiga semnificația funcțională a interacțiunii dintre CD63 și HK în continuare, am transfectat celulele COS-7 cu un iepure care codifică ADNc HK în mod individual sau împreună cu un ADNc care codifică un construct CD63 marcat cu pavilion (CD63-FL). Am demonstrat că HK-ul nu trebuie să se asambleze cu HKA pentru a ajunge la suprafața celulei în celulele COS transfectate (20). Am folosit o construcție CD63 care poartă o etichetă de epitop steag pe capătul său N, deoarece capătul C al CD63 conține un motiv pe bază de tirozină care este necesar pentru traficul intracelular al acestei tetraspanine (13).

celulele COS cotransfectate cu HK și CD63-FL au fost supuse imunoprecipitării folosind un pAb Anti-FLAG. Analiza Western blot a materialului imunoprecipitat indică faptul că coprecipitarea HK cu CD63 (Fig. 2, HK + CD63-FL). CD63-FL și HK proteine Coimmunoprecipitat într-o varietate de detergenți, inclusiv 2% gușă, 1% Brij 96, și 1% Triton X-100. Asocierea dintre CD63 și HK XV constituie unul dintre puținele complexe de tetraspanină descrise care supraviețuiește solubilizării în Triton X-100 și, prin urmare, este probabil să reprezinte o interacțiune directă (28). Subunitatea de subunitate de la Secu are două forme: Secu (mature), care se modifică cu glucide complexe, și secu (core), care se modifică cu glucide de înaltă manoză (29). Ambele forme de coprecipitat cu CD63, deși raportul dintre XCC și XCM în precipitat variază în funcție de condițiile de solubilizare.

HK-ul nu a fost detectat în imunoprecipitările FLAG efectuate pe celule transfectate numai cu HK-ul-ul, demonstrând că pAb-ul FLAG nu interacționează cu subunitatea-ul-ul (Fig. 2, HK. HK-ul nu coimmunoprecipitează cu FLAG-ul pAb dintr-un amestec (50:50, vol/vol) de lizați preparați din celule transfectate individual cu CD63-FL și subunitatea-XV, confirmând că interacțiunea are loc in vivo (Fig. 2, a doua bandă). Probele incubate cu FLAG pAb nu precipită proteina lizozomală Lamp-1, indicând faptul că interacțiunea dintre CD63-FL și HK-ul este specifică și nu un artefact al solubilizării incomplete a compartimentului CD63 (Fig. 2).

am examinat apoi dacă interacțiunea dintre HK-ul și CD63 afectează localizarea subcelulară a subunității-aktiv. HK-ul este prezent la suprafața celulei în celulele COS transfectate tranzitoriu (Fig. 3 A-C). Există o redistribuire pronunțată a subunității de la XV la veziculele intracelulare care conțin CD63 atunci când celulele COS sunt cotransfectate atât cu HK, cât și cu CD63-FL (Fig. 3 D-F). Pentru a exclude posibilitatea ca această localizare modificată să fie un efect nespecific al supraexprimării CD63, am investigat efectul expresiei CD63 asupra distribuției AQP4. AQP4 este un canal de apă care este prezent în membranele plasmatice bazolaterale ale celulelor parietale. Nu suferă endocitoză și exocitoză reglementată cu H, K-ATPază (30, 31). Acest canal nu coimunoprecipitează cu CD63-FL într-un lizat Triton X-100 al celulelor COS cotransfectate (Fig. 4A). Când celulele cotransfectate sunt vizualizate prin microscopie confocală de imunofluorescență, AQP4 nu este prezent în compartimentul care conține CD63 (Fig. 4B), indicând faptul că redistribuirea indusă de CD63 către veziculele intracelulare este specifică proteinelor care interacționează cu această tetraspanină.

pentru a investiga mecanismele de redistribuire mediată de CD63 a HK-ului, am profitat de lucrările recente care au caracterizat traficul intracelular de CD63. Rous și colab. (13) a demonstrat că tirozina bazat pe motiv prezent la extreme C terminus al CD63 interacționează cu adaptor subunități μ2 și μ3. Proteina xift2 este un membru al complexului ap-2 heterotetrameric. Acest complex este prezent la nivelul membranei plasmatice și leagă proteinele cargo de stratul de clatrină, mediind endocitoza acestora (14). Proteina de la centa3 este un membru al complexului ap-3 heterotetrameric. Acest complex participă la direcționarea lizozomală și se găsește atât în rețeaua trans-Golgi, cât și într-un compartiment vezicular care se colocalizează parțial cu endozomi (12). Atunci când motivul pe bază de tirozină YEVM al CD63 este mutat la AEVM, CD63 nu poate interacționa nici cu 02, nici cu 3 și este exprimat în principal pe suprafața celulei (13). Atunci când HK-ul este coexprimat cu constructul CD63-aevm marcat cu pavilion, atât CD63-Aevm, cât și subunitatea-XV sunt distribuite pe suprafața celulei (Fig. 3 G-I). Astfel, distribuția intracelulară a HK-ului este afectată de semnalele de trafic încorporate în coada citoplasmatică CD63.

atunci Când YEVM secvență în coada de CD63 este mutată la YEVI, modificat motiv continuă să interacționeze cu μ3 dar nu mai asociati cu μ2 (13). CD63-YEVI este localizat în primul rând în compartimentul endozomal–lizozomal târziu, cel mai probabil deoarece proteina tetraspanină modificată se deplasează direct în acest compartiment după trecerea sa biosintetică inițială prin Golgi (13). Populația mică de CD63-YEVI care ajunge la membrana plasmatică prezintă o interiorizare afectată, deoarece nu mai poate interacționa cu centa2 (13). Când HK-ul și un construct CD63-YEVI etichetat cu pavilion sunt coexprimate în celulele COS, o mare parte din CD63-YEVI este localizată în compartimentul endozomal–lizozomal târziu; cu toate acestea, subunitatea-XV rămâne pe suprafața celulei și nu este redistribuită într-un compartiment intracelular (Fig. 3 J-L). Analiza coimunoprecipitării confirmă faptul că HK-ul se poate asocia atât cu CD63-YEVI, cât și cu CD63-AEVM (datele nu sunt prezentate). Aceste date sugerează că pentru ca HK-ul să fie distribuit într-un compartiment intracelular CD63-pozitiv, aceste proteine trebuie să interacționeze la suprafața celulei și să fie endocitozate ca un complex.

pentru a determina dacă HK-ul detectat în veziculele intracelulare corespunde proteinei care a fost endocitozată de pe suprafața celulei, am observat interiorizarea subunității-XV în prezența și absența expresiei CD63 exogene. Celulele COS au fost cotransfectate cu HK și CD63-FL. Celulele au fost apoi refrigerate la 4 centimetric C pentru a opri endocitoza și suprafața marcată cu HK Centimetric Mab. Celulele marcate au fost incubate la 37 de centimetrii C timp de 40 de minute pentru a permite reluarea endocitozei. După incubare, celulele au fost răcite la 4 C și suprafața au fost marcate cu IgG anti-șoarece de capră conjugat cu Cy5. Celulele au fost fixate și incubate cu PAB anti-pavilion și apoi au fost etichetate atât cu IgG anti-șoarece conjugat cu izotiocianat de fluoresceină, cât și cu IgG anti-iepure conjugat cu rodamină. Astfel, HK-ul care a rămas la suprafață a fost vizualizat pe canalul Cy5, HK-ul internalizat a fost vizualizat pe canalul izotiocianat de fluoresceină, iar CD63-FL a fost vizualizat pe canalul de rodamină. Această analiză a demonstrat că subunitatea interiorizată de la sec63 colocalizează cu CD63, sugerând că pool-ul HK-ului Colocalizat cu CD63 este derivat prin endocitoză din membrana celulară (Fig. 5 E-H). Celulele care nu supraexprimă CD63 prezintă o subunitate mult mai puțin interiorizată după o incubare de 40 de minute (Fig. 5 A-D).

pentru a cuantifica internalizarea HK-ului și a verifica în continuare dacă HK-ul și CD63 se asociază la suprafața celulei, am efectuat experimente de biotinilare celulă-suprafață. În primul experiment, PENTRU că celulele au fost transfectate cu β-subunitatea singur și biotinylated cu biotina-SS-N-hydroxysuccinimide ester la 4°C. Duplicat probele au fost apoi incubate la 37°C pentru diferite lungimi de timp pentru a permite endocitoză pentru a relua. Celulele au fost returnate la 4 C, iar o placă din fiecare punct de timp a fost dezbrăcată de biotina rămasă pe suprafața celulei prin expunerea la agentul reducător cu membrană impermeabilă MesNa. Celulele au fost lizate și incubate cu margele de streptavidină. Proteinele asociate cu mărgelele de streptavidină au fost separate prin SDS/pagină, iar membranele au fost probate cu HK-ul Mab (Fig. 6A). Fracțiunea de subunitate de pe suprafața celulei nu se modifică în mod apreciabil pe măsură ce se realizează internalizarea de 37 de C. După primele 10 minute, o mică parte din HK-ul cu etichetă de suprafață este sechestrat în interiorul celulei, iar raportul dintre suprafață și HK-ul internalizat rămâne ridicat. Aceste date sugerează că subunitatea-subunitate care nu este asociată cu CD63 fie se internalizează foarte încet, fie este internalizată, dar reciclată rapid înapoi la suprafață, la fel ca receptorul transferinei.

în continuare am căutat să caracterizăm comportamentul HK-ului care se asociază cu CD63. Celulele COS au fost cotransfectate cu HK și CD63-FL. Celulele au fost biotinilate și dezbrăcate așa cum este descris mai sus. Pentru a izola populația HK-ului care este asociată cu CD63, lizatul celular a fost incubat cu granule de agaroză conjugate cu PAB și proteină A. Materialul imunoprecipitat a fost eluat cu o cantitate mică de tampon conținând 3% SDS, diluat de 30 de ori cu 1% Triton X-100 și incubat cu margele de streptavidină. Proteinele asociate cu mărgelele de streptavidină au fost separate prin SDS/PAGE și probate cu HK-ul Mab (Fig. 6B). Pentru celulele care nu au fost supuse unui protocol de stripare, semnalul detectat în acest Western blot reprezintă grupul total de subunități de suprafață etichetate cu cd63, inclusiv complexe care erau încă la membrana plasmatică și complexe care au fost internalizate în vezicule. Pentru celulele care au fost supuse unui protocol de stripare, semnalul reprezintă populația de subunitate-subunitate asociată cu CD63 care a fost prezentă la suprafața celulei în timpul biotinilării și a fost ulterior internalizată și protejată de banda MesNa.

la ora 0-min, HK-ul Biotinilat este detectat cu ușurință în imunoprecipitates Anti-FLAG din celule unstripped, demonstrând că HK-ul și CD63 sunt capabile de Asociere la suprafața celulei. Toate HK-urile Biotinilate recuperate la punctul de timp 0-min sunt sensibile la banda MesNa. Cantitatea de cd63 asociată, biotinilată, subunitate XQC protejată de reactivul MesNa crește pe măsură ce celulele sunt lăsate să incubeze la 37 XQC.de fapt, cantitatea de HK XQC care este prezentă la suprafață și asociată cu CD63 la 0 min este aproximativ aceeași cu cantitatea de HK XQC care este asociată cu CD63 și protejată de stripare la 45 min. Aceste constatări sugerează că subunitatea-subunitate asociată cu CD63 este internalizată și nu revine la suprafața celulei.