ciuperca Candida guilliermondii este distribuită pe scară largă în natură, inclusiv microbiota umană a pielii și a suprafețelor mucoasei.22 deși această specie prezintă o virulență redusă în comparație cu alte specii de Candida,3 este considerată în prezent un agent patogen emergent, cu o incidență majoră în America Latină.18C. guilliermondii a fost recunoscut ca agent etiologic al unei largi varietăți de infecții clinice, inclusiv cele diseminate în principal la pacienții imunocompromiși,22 și focare nosocomiale la pacienții chirurgicali cu dispozitive intravasculare.13 în prezent, tratamentul recomandat pentru candidoza invazivă la pacienții neutropenici include caspofungina (CFG) sau micafungina (MFG) ca terapii de primă linie, amfotericina lipozomală B (LAMB) și anidulafungina (AFG) fiind alternative, în timp ce fluconazolul (FLC) este recomandat numai atunci când se confirmă susceptibilitatea la acest medicament.23 cu toate acestea,mai multe studii au arătat că C. guilliermondii are o sensibilitate scăzută la FLC8,15, 19 și au fost raportate eșecuri terapeutice asociate cu izolate cu concentrații inhibitoare minime de amfotericină B (AMB) ridicate (mic).9,12,24 deși aproape 90% dintre izolate prezintă echinocandine mici egale sau mai mici decât punctele de întrerupere clinică (CBP) de susceptibilitate (2 hectolitri/ml),17 similare cu alte specii de Candida, cum ar fi C. parapsiloza, unele izolate de C. guilliermondii prezintă mic considerabil ridicate.8,15 datele disponibile privind eficacitatea AFG în candidoza invazivă sunt limitate, iar rolul potențial al acestui medicament în practica clinică este puțin cunoscut.23 în acest context, studiile pe animale pot juca un rol important pentru o mai bună înțelegere a corelației in vitro–in vivo.11 prin urmare, obiectivul nostru principal a fost de a evalua activitățile in vitro și in vivo ale AFG împotriva diferitelor izolate de C. guilliermondii, comparând rezultatele cu cele ale AMB și FLC.

materiale și metodeizolate fungice

patru izolate clinice ale C. guilliermondii (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 și UTHSC 10-3207) au fost utilizate în studiul in vitro și două dintre ele (UTHSC 11-685 și UTHSC 11-142) au fost selectate pentru modelul murin pe baza diferitelor lor susceptibilități in vitro. Izolatele au fost identificate prin secvențierea regiunii distanțierului intern transcris (ITS) și a domeniilor D1–D2 ale ARNr, comparând secvențele cu cele ale tulpinii de tip a acestei specii.

studii in vitro

susceptibilitatea in vitro a celor patru tulpini la AMB, FLC și AFG a fost evaluată utilizând o metodă de microdiluție a bulionului de referință,6candida parapsilosis ATCC 22019 și Candida krusei ATCC 6258 fiind incluse ca controale de calitate.

curbele de timp-kill au fost dezvoltate pentru toate tulpinile conform studiilor anterioare.5,20 pe scurt, a fost preparată o soluție stoc a fiecărui antifungic, AMB (Sigma–Aldrich Co., St. Louis, SUA) și AFG (Pfizer Inc., Madrid, Spania) au fost dizolvate în dimetil sulfoxid și FLC (Pfizer Inc., Madrid, Spania) în apă distilată. Mai mult, diluțiile medicamentoase au fost preparate în 9 ml de mediu standard RPMI 1640 pentru a obține concentrații de 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 și 32 de grame/ml din fiecare medicament. Izolatele au fost subculturate la 35 centicc timp de 24h pe plăci de agar de dextroză de cartof (PDA). Culturile de C. guilliermondii au fost suspendate în soluție salină sterilă, iar suspensiile rezultate au fost ajustate la 5 unități de formare a coloniilor (CFU)/ml prin numărarea hemocitometrului și prin placarea în serie pe PDA pentru a confirma viabilitatea. Diluțiile și controalele (fără medicamente) au fost inoculate cu 1 ml de suspensii fungice, rezultând un inocul de pornire de 5% 105% Fu / ml și incubat la 35% C. Un alicot de 100% din fiecare tub a fost colectat la 0, 2, 4, 6, 8, 24, și 48h după inoculare și diluate în apă distilată; 30 ilect din acestea au fost cultivate pe plăci PDA și incubate la 35 ilect C timp de 48h pentru determinarea CFU/ml. O scădere a UFC de 99,9% sau 3 unități log10 față de inoculul inițial a fost considerată fungicidă, în timp ce o reducere de

unitate log10, a fost considerată fungistatică. Limita de detecție a fost de 50CFU / ml. Toate studiile asupra curbei de timp au fost efectuate în duplicate.In studiile vivo

masculi de-1 șoareci (Charles River; Criffa SA, Barcelona, Spania) cu o greutate medie de 30g au fost utilizate în experiment. Șoarecii au fost adăpostiți în cutii standard cu acces liber la alimente și apă. Toate procedurile pe animale au fost supravegheate și aprobate de Comitetul de etică și bunăstare a animalelor Universitat Rovira i Virgili.

șoarecii au fost neutropenici cu o zi înainte de infecție printr-o injecție intraperitoneală (I.p.) de 200 mg / kg de ciclofosfamidă (Genoxal; Laboratorios Funk sa, Barcelona, Spania) plus o injecție intravenoasă (i.v.) injecție de 5-fluorouracil (Fluorouracilo; Ferrer Farma SA, Barcelona, Spania) la 150 mg/kg.10,14 în ziua infectării, șoarecii au fost provocați i.v. cu 1 108cfu/animal din fiecare dintre cele două tulpini de C. guilliermondii, UTHSC 11-685 și UTHSC 11-142, în 0,2 ml de soluție salină sterilă în vena laterală a cozii.3,4

grupuri de opt animale au fost stabilite aleatoriu pentru fiecare tulpină și medicament. Grupurile au fost tratate după cum urmează: amfotericină B deoxicolat (AMBd) (Farmacia Xalabarder, Barcelona, Spania) la doze de 0,8 mg/kg i.v. o dată pe zi (QD); amfotericină B lipozomală (LAMB) (Gilead Sciences S. A., Madrid, Spania) la 10 mg/kg i.v., QD; FLC (Pfizer Inc., Madrid, Spania) la 25 mg/kg oral (p.o.) prin gavaj, de două ori pe zi (BID); și AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Marea Britanie) la 10 mg/kg greutate corporală/doză i.p., QD. Toate tratamentele au început la 24 de ore după provocare și au durat 7 zile. Controalele nu au primit tratament. Pentru a preveni infecțiile bacteriene, toți șoarecii au primit 5 mg/kg zi ceftazidimă subcutanat de la 1 la 7 zile după infecție. Șoarecii au fost verificați zilnic și au fost eutanasiați în ziua 8 post-infecție prin CO2 anoxie. Eficacitatea fiecărui medicament a fost evaluată prin reducerea sarcinii tisulare și studii histopatologice. Rinichii au fost îndepărtați aseptic, iar unul dintre ei a fost cântărit și omogenizat în 2 ml de soluție salină sterilă. Diluțiile seriale de 10 ori ale omogenaților au fost placate pe PDA și incubate timp de 48h la 35 CTC pentru calculul CFU/g. Pentru studiul histopatologic, rinichiul rămas a fost fixat cu formalină tamponată 10%, deshidratată, parafină încorporată și tăiată în secțiuni de 2 centimetri, care au fost colorate cu hematoxilină–eozină (H-E) și pată periodică acid-Schiff (PAS) pentru examinare prin microscopie luminoasă.

statistici

Numărul de colonii din țesut a fost analizat folosind testul U Mann–Whitney, folosind Graph Pad Prism 4.0 Pentru Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, SUA). Când valorile P au fost sub 0,05, diferențele au fost considerate semnificative statistic.

Rezultatelestudiile in vitro

mic–urile AMB au fost de 0,25–1 Hector/ml, 0,06–0,25 octogon/ml pentru AFG și 0,5-1 octogon/ml pentru FLC. În urma întreruperilor de susceptibilitate pentru AMB,FLC și AFG împotriva C. guilliermondii, 16 Toate izolatele au fost susceptibile la cele trei medicamente. Susceptibilitățile tulpinilor de control al calității s-au încadrat în intervalele acceptate.6

cinetica uciderii AMB a arătat o activitate fungicidă rapidă care a crescut odată cu concentrația medicamentului. La concentrații echivalente cu MIC, medicamentul respectiv a prezentat un efect fungicid împotriva a trei dintre cele patru izolate testate (Fig. 1). Această activitate a început imediat după inoculare la concentrații mai mari de 1%/ml, obiectivul fungicid fiind atins după 4 ore la 32%/ml. AFG la concentrații mai mari de 0,5%/ml a prezentat activitate fungicidă începând după 4 ore de incubare. Obiectivul fungicid a fost atins la 12-24h de incubare la 32 hectolitri/ml (Fig. 2). FLC a prezentat activitate fungistatică împotriva tuturor celor patru izolate (Fig. 3).

studii In vivo

mielul la 10 mg / kg a fost singurul medicament capabil să reducă încărcătura fungică în rinichii șoarecilor infectați cu fiecare dintre cele două tulpini, fiind reducerea semnificativ mai mare decât cea a celorlalte terapii (p 0,04). AMBd și FLC au reușit să reducă sarcina tisulară numai la șoarecii infectați cu tulpina care a prezentat cele mai mici mic-uri pentru aceste două medicamente, adică 0,25 0,5 0,5 0,5 0,008. În cazul AFG, reducerea încărcăturii fungice a fost modestă și mai mică decât cea pentru AMBd și a redus semnificativ sarcina tisulară în rinichi numai în ceea ce privește grupul de control pentru tulpina UTHSC 11-685 (P=0,002) (Fig. 4).

studiul histologic a arătat infiltrarea focală a celulelor fungice în rinichii animalelor netratate și la șoarecii tratați cu AMBd, FLC sau AFG. Rinichii șoarecilor tratați cu miel au arătat doar o invazie fungică ușoară. Semne de necroză, răspuns inflamator sau modificări ale parenchimului nu au fost observate nici la controale, nici la animalele tratate (Fig. 5).

discuție

studiile in vitro nu au evidențiat scăderea susceptibilității izolatelor C. guilliermondii la FLC sau AFG. În acord cu studiile anterioare, curbele de timp ale AMB au arătat o activitate fungicidă dependentă de concentrație împotriva tuturor izolatelor,4,5,7 și FLC au arătat un efect fungistatic indiferent de concentrația testată.7 Se știe că AMBd prezintă o eficacitate mai mare decât formularea sa lipidică, în special în rinichi, atunci când este administrată ambele în aceleași doze.1 cu toate acestea, studiile farmacocinetice au arătat că, după administrarea a 0,75 mg/kg de AMBd, Cmax de AMB atins în serul șoarecilor a fost de 0,30%/ml.25 cu toate acestea, AMB MIC al uneia dintre cele două izolate testate este mai mare decât această valoare; prin urmare, am folosit o doză mare de miel pentru a atinge concentrații mai mari.1 într-adevăr, administrarea mielului la 10 mg/kg a fost eficientă în reducerea încărcăturii fungice a ambelor tulpini. Acest fapt s-a corelat cu curbele de ucidere, unde AMB și-a atins activitatea fungicidă față de cele două izolate testate in vivo, la concentrații de 1 hectolitru/ml. Din cunoștințele noastre, acesta este primul studiu care a încercat să stabilească o relație între cinetica uciderii și eficacitatea experimentală in vivo a AFG și FLC împotriva izolatelor clinice ale C. guilliermondii. Există doar un studiu anterior asupra echinocandinelor, în special asupra caspofunginei (CFG) în infecția diseminată de C. guilliermondii. CFG la 1mg/kg a fost eficient în reducerea încărcăturii fungice renale la șoarecii infectați cu o tulpină de C. guilliermondii cu un MIC de 8 ectg/ml, în timp ce time killing a arătat că nu s-a obținut nicio activitate fungicidă la concentrații de 64 ectg / ml.4 Pe de altă parte, studiul nostru a arătat o activitate dependentă de concentrație a AFG, care la 32%/ml a exercitat o activitate fungicidă, așa cum s-a raportat anterior,17% la 24 ore și 8%/ml. Studiile anterioare au raportat concentrații de AFG în ser și rinichi de aproximativ 13% / ml după 7 zile de tratament la doze de 10 mg/kg.21 în acest caz, AFG a reușit să reducă doar în mod modest sarcina fungică în rinichii șoarecilor neutropenici infectați cu una dintre cele două tulpini testate, ceea ce nu pare să fie legat de diferența scăzută a MICs AFG între cele două tulpini testate (diluție 1), sugerând că răspunsul la tratamentul AFG este dependent de tulpină. În mod similar, FLC a fost,de asemenea, capabil să reducă ușor povara fungică la rinichii șoarecilor provocați cu una dintre cele două tulpini, în ciuda dozei administrate care atinge concentrații serice peste MICs, 2 care, de asemenea, nu a fost surprinzător datorită activității sale fungistatice.

În concluzie, studiul nostru a arătat activitatea și eficacitatea mai mare a mielului împotriva celor două tulpini de C. guilliermondii, spre deosebire de efectul slab al FLC și AFG. Cu toate acestea, ar trebui efectuate studii suplimentare cu mai multe izolate de C. guilliermondii reprezentând o gamă mai largă de microfoane AFG pentru a evalua dacă există vreo relație între valorile MIC și eficacitatea AFG.

Conflict de interese

nici unul de declarat.