rezumat
presiunea crescândă a vieții sociale moderne intensifică impactul stresului asupra dezvoltării bolilor cardiovasculare, care includ tromboza venoasă profundă (TVP). Denervarea simpatică renală a fost aplicată ca una dintre abordările clinice pentru tratamentul hipertensiunii arteriale rezistente la medicamente. În plus, relația strânsă dintre stresul oxidativ și bolile cardiovasculare a fost bine documentată. Studiul de față este conceput pentru a explora mecanismul prin care sistemul nervos simpatic renal și stresul oxidativ afectează sistemul de coagulare a sângelui în dezvoltarea TVP. Modelul de șoc cronic al piciorului la șobolani a fost aplicat pentru a imita o stare de stres fiziologic similară cu cea a oamenilor. Rezultatele noastre au arătat că procedura de șoc cronică a piciorului ar putea promova TVP, care poate fi prin activarea agregării plachetare. Agravarea TVP și activarea trombocitelor au fost atenuate prin denervare simpatică renală sau tratament antioxidant (Tempol). Concomitent, tratamentul de denervare ar putea reduce, de asemenea, nivelurile factorilor de oxidare circulanți la șobolani. Aceste rezultate demonstrează că atât sistemul nervos simpatic renal, cât și stresul oxidativ contribuie la dezvoltarea TVP ca răspuns la stresul cronic, ceea ce poate oferi o strategie nouă pentru tratamentul pacienților cu TVP din clinică.
1. Introducere
tromboza venoasă profundă (TVP) este o boală cardiovasculară comună asociată cu sechele, embolie pulmonară, care este a treia cauză cea mai frecventă de deces din cauza bolilor cardiovasculare după atac de cord și accident vascular cerebral. Un flux sanguin lent, deteriorarea peretelui venei și o stare hipercoagulabilă sunt cei trei factori principali de risc pentru dezvoltarea TVP. În consecință, anticoagulantele și tromboliticele sunt cele două tratamente principale pentru pacienții cu TVP clinic. Triada factorilor de risc care predispun la formarea trombilor, postulată de Virchow, include modificări ale raportului dintre componentele sanguine, integritatea peretelui vasului și debitul sanguin. Sistemul de coagulare a sângelui joacă un rol cheie în protejarea mamiferelor împotriva sângerărilor letale. În toate formele de tromboză, coagularea și inflamația sunt cele două căi principale care acționează împreună pentru a coordona răspunsurile organismului la leziuni .în ultimele decenii, factorii psihologici, cum ar fi stresul și depresia, au fost recunoscuți ca factori importanți care afectează sănătatea umană . Perioadele lungi de anxietate vor induce dezvoltarea bolilor cardiovasculare. Mai mult, prin apariția simultană, depresia și anxietatea vor agrava și mai mult dezvoltarea bolilor cardiovasculare. În plus, stresul și alți factori psihologici s-au dovedit a fi strâns legați de apariția accidentului vascular cerebral și a infarctului miocardic . Numeroase studii au arătat, de asemenea, că stresul poate provoca leziuni structurale de lungă durată țesuturilor și organelor . Procedura cronică de șoc electric a piciorului a fost caracterizată ca un model de stres psihologic incontrolabil și imprevizibil , care s-a dovedit a fi capabil să inducă creșterea tensiunii arteriale sistolice . Cu toate acestea, nu există încă niciun raport legat de efectele șocului cronic asupra dezvoltării TVP.
rolul nervului renal simpatic în dezvoltarea hipertensiunii arteriale a fost demonstrat atât în observațiile experimentale, cât și în cele clinice . Există două tipuri de nerv renal simpatic: nervii aferenți renali și nervul eferent renal. Fibrele simpatice aferente provin din rinichi și, prin modularea fluxului simpatic Central, modifică direct hipertensiunea neurogenă. În același timp, nervul eferent îmbunătățește retenția de sodiu și apă, stimulează eliberarea reninei și modifică fluxul sanguin renal . În acest fel, atât tensiunea arterială pe termen scurt, cât și pe termen lung ar putea fi influențată de nervul simpatic renal . Studiile clinice au raportat efectele benefice ale denervării simpatice renale la pacienții cu hipertensiune refractară . În plus față de efectul de scădere a denervării asupra tensiunii arteriale, au fost raportate și beneficii suplimentare în bolile cardiovasculare, diabetul , disfuncția renală, hipertrofia cardiacă , insuficiența cardiacă și aritmiile . Hipertensiunea arterială, un factor de risc major pentru multe boli, poate crește disfuncția endotelială și poate promova tromboza și este, de asemenea, strâns legată de incidența bolilor vasculare cardiocerebrale . Prin urmare, denervarea simpatică renală poate oferi o nouă strategie în prevenirea și tratamentul bolilor cardiovasculare în condiții de stres ridicat.
recent, Experimentele arată că stresul oxidativ ar putea fi responsabil pentru schimbarea funcției endoteliale . Speciile reactive crescute de oxigen produse de endoteliul vascular și celulele sanguine circulante vor afecta funcțiile barierei vasomotorii și endoteliale și vor spori formarea trombilor . Stresul oxidativ s-a dovedit , de asemenea, a fi un determinant al activării plachetare, care a fost factorul de risc pentru aterotromboză. Cu toate acestea, dacă stresul cronic ar putea afecta sistemul de coagulare prin creșterea stresului oxidativ este încă necunoscut.
în prezent, nici un raport nu leagă direct stresul psihologic cu sistemul de coagulare și bolile vasculare cardiocerebrale. Având în vedere că activarea sistemului de coagulare are o influență importantă atât asupra hemostazei fiziologice , cât și asupra trombozei patologice, am aplicat modelul de stres al șocului piciorului la șobolani pentru a explora dacă cronica ar putea afecta dezvoltarea TVP și posibilele mecanisme implicate.
2. Materiale și metode
2.1. Pregătirea animalelor
șobolani masculi Sprague-Dawley în vârstă de zece săptămâni, obținuți de la Shanghai Laboratory Animal Center, au fost utilizați în acest studiu. Animalele au fost menținute într-un mediu cu temperatură controlată de 25 de centimetrii cu un ciclu de lumină : întuneric de 12 : 12 ore. Șobolanii expuși la Protocolul de stres au fost plasați individual într-o cutie de stres pentru șocul piciorului, unde au primit o sesiune de 4 ore de șoc electric pentru picior printr-o podea de rețea electrificată, oferind un șoc lung de 5 secunde de 0,15 mA la fiecare 30 de secunde. Nervul simpatic renal de șobolan a fost tăiat chirurgical în timp ce animalele erau sub o anestezie indusă de 10% hidrat de clor. După o perioadă de recuperare de o săptămână, a fost început protocolul de șoc picior. Tempol (10 mg/kg și zi) a fost administrat prin injecție intraperitoneală după începerea Protocolului de stres . Tromboza venoasă a fost indusă în condiții anesteziate cu 10% hidrat de cloral, așa cum a fost descris anterior de Leung . Pe scurt, abdomenul a fost deschis, iar vena cava inferioară (IVC), după ce a fost separată cu grijă de țesuturile înconjurătoare, a fost ligată strâns chiar sub vena renală stângă folosind un fir de bumbac. Apoi, abdomenul a fost închis cu un strat dublu de suturi, închizând mai întâi peritoneul cu mușchii și apoi pielea separat. După douăsprezece ore, animalele au fost anesteziate din nou, abdomenul a fost redeschis, iar plasma și trombul au fost colectate pentru analize ulterioare . Studiul de față a fost realizat în conformitate cu Convenția Europeană pentru protecția animalelor Vertebrate utilizate în scopuri experimentale și în alte scopuri științifice (Consiliul Europei numărul 123, Strasbourg, 1985). Toate procedurile chirurgicale au fost aprobate de Universitatea Soochow și efectuate în conformitate cu liniile directoare pentru îngrijirea și utilizarea animalelor stabilite de Universitatea Soochow.
2.2. Valorile concentrațiilor plasmatice de corticosteron
nivelurile plasmatice de corticosteron au fost măsurate utilizând un kit de testare imunosorbentă enzimatică (Elisa) Disponibil în comerț (TSZ Elisa, SUA).
2.3. Măsurători ale greutății trombului
din cavitatea abdominală redeschisă, segmentul ligat al venei cava a fost îndepărtat și deschis longitudinal pentru a îndepărta trombul format, care a fost clătit și cântărit pe hârtie de filtru.
2.4. Analiza parametrilor de coagulare a sângelui
timpul de protrombină (PT), timpul de tromboplastină parțială activată (APPT) și timpul de trombină (TT) au fost măsurate utilizând un analizor automat de coagulare a sângelui (Sysmex Corporation ca-50, Japonia). Din cavitatea abdominală redeschisă, sângele (4,5 mL) a fost colectat din vena cavă inferioară folosind o seringă de unică folosință, conținând 0,5 mL dintr-o soluție de citrat de sodiu 3,8% și transferat în tuburi de centrifugă autoclavate. Jumătate din sânge a fost centrifugat la 3000 rpm timp de 10 min și serul a fost colectat. O alicotă serică de 0,1 mL a fost combinată cu 0.1 mL de reactiv pt. După preîncălzire timp de 20 de minute, PT a fost măsurat folosind un analizor automat de coagulare a sângelui, așa cum s-a menționat mai sus. APPT și TT au fost măsurate folosind aceeași metodă ca și PT.
agregarea plachetară a fost măsurată cu ajutorul unui analizor de agregare plachetară (Chrono-Log 560 Ca, Germania). După redeschiderea cavității, s-au colectat 4,5 mL de sânge din vena cavă inferioară utilizând o seringă de unică folosință conținută cu 0,5 ml citrat de sodiu (3,8%) și apoi transferată în tubul de centrifugare. A doua jumătate a sângelui a fost centrifugată la 1000 rpm timp de 10 minute pentru a obține plasma bogată în trombocite. Sângele rămas în tub a fost centrifugat la 3000 rpm timp de 10 minute pentru a pregăti plasma săracă în trombocite. Apoi, coagularea probelor de plasmă a fost stimulată folosind proteine de colagen și adenozin difosfat disodic (ADP) (1 mM, 10 mL) ca agoniști plachetari.
2.5. Determinarea concentrației plasmatice de noradrenalină (NA)
concentrațiile plasmatice de noradrenalină (NA) au fost măsurate utilizând un kit de testare imunosorbentă enzimatică (Elisa) Disponibil în comerț (TSZ Elisa, SUA).
2.6. Măsurarea nivelurilor de peroxidare a lipidelor și a activității superoxid dismutazei plasmatice (SOD) și a peroxidazei glutationului (GSH-Px)
activitatea plasmatică SOD și GSH-Px și a nivelurilor de peroxidare a lipidelor (substanțe reactive cu acid tiobarbituric, TBar) au fost măsurate folosind kituri de testare imunosorbentă enzimatică (Elisa) disponibile în comerț (TSZ Elisa, SUA).
2.7. Analize statistice
toate datele au fost prezentate ca media sem-ului inqc. Semnificația statistică a comparațiilor dintre mai mult de două grupuri a fost testată folosind un ANOVA bidirecțional urmat de testul Newman-Keuls sau folosind un test de Student cu două cozi nepereche. valorile < 0,05 au fost considerate semnificative statistic.
3. Rezultate
3.1. Efectul șocului, denervării și tratamentului cu Tempol asupra concentrațiilor plasmatice de corticosteron
nivelurile plasmatice de corticosteron (markerul stresului) au fost semnificativ crescute în grupul de șoc al piciorului în comparație cu grupul de control (Figura 1) și au fost semnificativ suprimate atât în grupul de denervare plus șoc, cât și în grupul de șoc Tempol plus comparativ cu grupul de șoc al piciorului (figura 1). Acest rezultat a indicat faptul că șocul cronic al piciorului a crescut semnificativ corticosteronul plasmatic atunci când corpul era sub stres, iar atât denervarea, cât și tratamentul cu Tempol ar putea atenua starea de stres.
3.2. Efectul șocului, denervării și tratamentului Tempol asupra greutății trombilor induși de ligaturarea IVC
trombii au fost colectați la 12 ore după ligarea IVC și ponderați. În grupul de șoc picior, greutatea trombului a fost semnificativ crescută comparativ cu cea a grupului de control (, Figura 2). Cu toate acestea, greutatea trombilor a grupelor denervation plus shock și Tempol plus shock a rămas neschimbată în comparație cu grupul de control trombi, dar a scăzut semnificativ în comparație cu grupul de șoc picior trombi (, Figura 2). Aceste rezultate sugerează că șocul cronic ar putea facilita formarea TVP, în timp ce atât denervarea, cât și tratamentul cu Tempol ar putea inhiba creșterea formării TVP indusă de stres.
(a)
(A)
(B)
3.3. Efectul șocului, denervării și tratamentului Tempol asupra parametrilor de coagulare a sângelui
după recoltarea sângelui din IVC, s-au măsurat parametrii sângelui (PT, APPT, TT și agregarea plachetară). A existat o diferență semnificativă în parametrii PT, TT și agregarea plachetară între grupurile de control și șocurile piciorului. PT al grupului de șoc picior a fost mai mic decât cel al grupului de control; cu toate acestea, parametrii TT și agregarea plachetară au fost mai mari în grupul de șoc picior comparativ cu grupul de control. În paralel, s-a observat o scădere semnificativă a parametrilor TT și a agregării plachetare a grupurilor de denervare plus șoc și Tempol plus șoc comparativ cu grupul de șoc picior (, Tabelul 1 și Figura 3). Aceste rezultate arată că șocul cronic ar putea spori sistemul de coagulare prin activarea agregării plachetare.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PT, prothrombin time; APPT, activated partial thromboplastin time; TT, timpul de trombină; față de grupul de control; față de grupul de șoc. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.4. Efectul șocului, denervării și tratamentului cu Tempol asupra concentrațiilor plasmatice de noradrenalină (NA)
șocul piciorului a crescut semnificativ concentrațiile plasmatice de noradrenalină (NA) comparativ cu grupul de control (, Figura 4). Nivelurile plasmatice de NA din grupul denervation plus shock și Tempol plus shock au fost suprimate semnificativ în comparație cu grupul foot shock (, Figura 4). Aceste rezultate confirmă succesul procedurii chirurgicale de denervare renală.
3.5. Efectul șocului, denervării și tratamentului cu Tempol asupra activității plasmatice SOD și GSH-Px și asupra nivelurilor de TBARS
activitatea plasmatică SOD în grupul de stres a fost semnificativ redusă comparativ cu grupul de control (, Figura 5(a)). Activitatea SOD plasmatică în grupurile denervare plus șoc și Tempol plus șoc a fost semnificativ crescută comparativ cu grupul șoc picior (, Figura 5(a)).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
activitatea plasmatică GSH-Px în grupul de șoc picior a fost, de asemenea, semnificativ mai mare decât cea a grupului de control (, Figura 5(b)). Activitatea plasmatică GSH-Px în grupurile de denervare plus șoc și Tempol plus șoc a fost semnificativ crescută comparativ cu grupul de șoc picior (, Figura 5(b)).
șocul piciorului a dus la o creștere semnificativă a nivelurilor plasmatice ale substanțelor reactive ale acidului tiobarbituric (TBar) comparativ cu grupul martor (Figura 5(c)). Nivelurile plasmatice ale TBARS în grupurile denervare plus șoc și Tempol plus șoc au fost semnificativ suprimate în comparație cu grupul de șoc picior (, Figura 5(c)).
4. Discuție
în acest studiu, am identificat că formarea TVP este facilitată în condiții de stres și că modificările sistemului de coagulare a sângelui sunt induse de stres. Datele acumulate au arătat că stresul psihologic cronic a activat două sisteme: unul este sistemul hipotalamus-hipofizo-suprarenalian (HPA), care a fost mediat în principal prin eliberarea de catecolamină, cortizol, vasopresină, endorfine și aldosteron ; cealaltă este prin activarea sistemului medular simpatic-suprarenal . După cum se arată în date, nivelurile de corticosteron din grupul de șoc cronic au crescut semnificativ, indicând faptul că HPA a fost activat. Care este rolul sistemului nervos simpatic ca răspuns la stres? Deoarece s-a demonstrat că activarea sistemului simpatic renal este foarte legată de dezvoltarea hipertensiunii arteriale, iar denervarea renală este un nou tratament clinic pentru pacienții cu hipertensiune refractară , sistemul simpatic renal trebuie să joace un rol important în bolile cardiovasculare. În plus, observațiile recente arată că starea de stres ridicat este foarte legată de bolile cardiovasculare, în special infarctul cardiac și cerebral; prin urmare, speculăm dacă stresul cronic va activa sistemul de coagulare prin activarea sistemului nervos simpatic renal. În studiul de față, am constatat în primul rând că stresul cronic ar putea agrega formarea TVP, sugerând că stresul va crește riscul bolilor cardiovasculare. În plus, am măsurat parametrii care definesc activitatea sistemului de coagulare a sângelui, inclusiv PT, APPT, TT și agregarea plachetară. Datele noastre au arătat că a existat o modificare semnificativă a agregării plachetare indusă atât de ADP, cât și de colagen, sugerând că efectul agravant al stresului asupra formării TVP a fost mediat de activarea trombocitelor. Rezultatele noastre dezvăluie în primul rând mecanismul care leagă starea de stres ridicat și bolile cardiovasculare. Deși datele noastre actuale au demonstrat în mod clar rolul sistemului nervos simpatic renal în dezvoltarea cronică indusă de șoc a TVP, este greu de identificat dacă nervul aferent sau eferent joacă un rol major datorită limitării procedurii chirurgicale. Speculăm că ambele sunt implicate în; motivul este că nervul aferent ar putea afecta controlul neurogen al tensiunii arteriale, care poate contribui la dezvoltarea TVP; și nervul eferent ar putea regla secreția renală de noradrenalină, care poate contribui, de asemenea, la dezvoltarea TVP.
prezența endoteliului deteriorat și a factorilor de coagulare sau a trombocitelor activate facilitează dezvoltarea și progresia TVP . Agregarea plachetară (adică atunci când trombocitele aderă una la cealaltă) care apare la locurile de leziuni vasculare a fost recunoscută de mult timp ca fiind critică pentru dezvoltarea trombozei . În studiul de față, ne-am concentrat în principal pe funcția plachetară în TVP. Fenomenele de adeziune, eliberare sau agregare a trombocitelor sunt, de asemenea, cunoscute sub numele de activare a trombocitelor . Trombocitele activate joacă un rol important în procesul de tromboză. Datele noastre arată că agregarea plachetară a crescut după tratamentul de stres, împreună cu creșterea formării TVP. Numărul de trombocite a fost utilizat pentru a normaliza măsura activității trombocitelor; cu toate acestea, nu au fost efectuate statistici privind numărul de trombocite din fiecare grup.analizele noastre asupra activității plasmatice a GSH-Px și SOD, precum și a nivelului plasmatic al TBARS, au arătat că organismul se află într-o stare de stres oxidativ indus de tratamentul cronic al șocului piciorului, care a fost inhibat de denervarea renală. Mai multe rapoarte au arătat că activitatea oxidazei NAD(P)H ar putea fi crescută direct de către receptorii XV1 – și XV2-prin catecolaminele (CA) eliberate de nervul simpatic renal. Mai mult, s-a demonstrat că antagoniștii receptorului de la XV1 reduc stresul oxidativ vascular cauzat de activarea oxidazei nad(P)H. Prin urmare, putem spune că inervația simpatică renală crește direct nivelul de stres oxidativ. S-a raportat că agregarea plachetară, un factor de risc suplimentar pentru tromb, este asociată cu stresul oxidativ . Stresul oxidativ ar putea crește direct agregarea plachetară prin radicalii liberi de oxigen localizați pe suprafața trombocitelor . Dovezi solide au demonstrat că stresul oxidativ ar putea activa direct trombocitele printr-o varietate de moduri. Deoarece produsul stresului oxidativ O2 – ar putea reacționa cu trombocitele sau endoteliul, atunci nici un derivat din ONOO-, care are o importanță deosebită pentru tromboza vasculară, nu are, de asemenea, astfel de efecte. Mai multe studii au arătat că O2− ar putea reduce pragul de activare a trombocitelor la trombină, colagen sau ADP și O2− poate fi chiar capabil să inducă agregarea spontană . Trombocitele activate chiar ar putea produce ROS; rolul acestui ros endogen este similar cu Ros exogen în activarea trombocitelor. În general, există mai multe scenarii care duc la agregarea plachetară indusă de stres. În primul, nervul simpatic renal este activat de stres, ceea ce duce la un stres oxidativ crescut în tot corpul, care este apoi urmat de o creștere a agregării plachetare. În celălalt scenariu, stresul declanșează direct producția de stres oxidativ al organismului, ceea ce crește direct agregarea plachetară. Denervarea nervului simpatic Renal poate afecta direct activarea trombocitelor, cu toate acestea, mecanismul căruia rămâne de explorat.
datele noastre au arătat că tratamentul stresului cronic nu are niciun efect semnificativ asupra APPT sau PT, sugerând că TVP facilitat de stres poate să nu fie asociat cu sistemul de coagulare extrinsecă sau intrinsecă. Cu toate acestea, tratamentul stresului cronic ar putea crește semnificativ TT, ceea ce indică faptul că timpul de conversie a fibrinogenului în fibrină a fost prelungit din cauza unei hiperfibrinolize. Prin urmare, speculăm că hiperfibrinoliza fibrinolitică s-a datorat unei coagulări crescute a sângelui în condițiile stresului cronic. În același timp, denervarea renală și tratamentul antioxidant ar putea scădea agregarea plachetară, care la rândul său a suprimat coagularea sângelui. Pe baza datelor noastre, am putut observa că TT a avut tendința spre o rată normală în aceste două condiții în comparație cu grupul de șoc.
trebuie remarcat faptul că, în observația noastră actuală, am constatat că tratamentul cu Tempol ar putea reduce creșterea cronică indusă de stres a nivelurilor de corticosteron, sugerând implicarea stresului oxidativ în eliberarea hormonului indus de activarea HPA, indicând faptul că tratamentul antioxidant poate oferi unele efecte benefice în leziunea organelor induse de activarea HAP. Cu toate acestea, nu am găsit nicio diferență între denervare și tratamentele antioxidante în niciun parametru, indicând faptul că nervul simpatic și stresul oxidativ pot contribui independent la dezvoltarea TVP indusă de șocul cronic.
În concluzie, stresul cronic ar putea crește agregarea plachetară direct prin activarea nervului simpatic renal și creșterea stresului oxidativ. Apoi, TVP ajunge să fie facilitată de creșterea agregării plachetare. O serie de studii au arătat că ateroscleroza și alte boli cardiovasculare sunt strâns asociate cu stresul oxidativ și că pacienții prezintă adesea niveluri scăzute de antioxidanți din sânge și niveluri îmbunătățite de markeri de stres oxidativ . Deci, având în vedere bolile vasculare cardiocerebrale și TVP, putem preveni și trata aceste boli prin direcționarea terapiei la niveluri hormonale și antioxidante. În plus, este un nou mod de terapie prin nervul simpatic renal.
Conflict de interese
autorii declară că nu există interese financiare concurente.
contribuția autorilor
Guo-Xing Zhang a conceput și proiectat experimentele. Tao Dong, Yu-Wen Cheng, Pei-Wen Sun și Chen-Jie Zhu au efectuat experimentele. Fei Yang a asistat la agregarea plachetară. Guo-Xing Zhang a contribuit reactivi / materiale și date analizate. Guo-Xing Zhang, Tao Dong și Yu-Wen Cheng au scris lucrarea.
mulțumiri
autorii sunt recunoscători profesorului Li Zhu și altor membri ai laboratorului Zhu pentru consiliere și asistență experimentală. Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională de științe Naturale din China (81270316, 814170563) și de programul de Cercetare al Universității Soochow (Q413400111).
