prepararea componentelor proteice pentru reconstituire

componentele aparatului de translație E. coli, inclusiv factorii de translație și RA, au fost preparate conform descrierii anterioare46. Prepararea componentelor RNaseP, a ARN-ului M1 și a proteinei C5 au fost, de asemenea, preparate conform descrierii anterioare29. Am modificat protocolul pentru proteina C5 prin precipitarea acesteia cu 80% sulfat de amoniu saturat și dizolvarea acesteia prin dializare împotriva tamponului A (50 mm acetat de sodiu pH 6,5, 5 mm EDTA, 0,25 M NaCl și 7 mM 2-mercaptoetanol). Precipitatul rezultat a fost recuperat prin centrifugare și dizolvat prin dializă împotriva tamponului B cuprinzând 50 mm HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM NH4Cl, 6 m uree și 10 mM ditiotreitol (DTT). Proteinele dizolvate au fost aplicate pe o coloană HITRAP SP HP de 5 mL (#17115101, GE Healthcare, SUA), spălate cu tampon B conținând 7 mM 2-mercaptoetanol ca înlocuitor pentru 10 mM DTT și eluate cu un gradient liniar de la 100 mM la 2 m nh4cl în tampon B. fracțiile care conțin proteine C5 au fost analizate prin SDS-PAGE, recuperate, dializate împotriva tamponului D (50 mm HEPES-KOH pH 7,6, 0,8 m NH4CL, 10 mM MgCl2, 2 m uree, 7 mm 2-MERCAPTOETANOL), apoi dializat în continuare împotriva tamponului D fără uree. Soluțiile rezultate au fost concentrate folosind un Amion Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, SUA) și dializate împotriva tamponului D fără uree conținând 50% glicerol. Proteina C5 purificată a fost depozitată la -30 centimetric C. observăm că putem împărți toate plasmidele la cerere.

prepararea enzimelor de modificare pentru iVTtRNAs

enzimele de Modificare pentru iVTtRNAs au fost preparate după cum urmează. Genele E. coli ale TsaB, TsaC, TsaD, TsaE, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE și GidA au fost amplificate din genomul E. coli A19 folosind primeri adecvați (date suplimentare 5). Genele amplificate pentru TsaC, TsaD, TsaE, GlyA, MnmC, MnmE și GidA au fost clonate în pET15b (#69661, Merck Millipore, SUA) ca mici proteine de fuziune a proteinelor de tip ubiquitin (SUMO), unde his-tag, proteina SUMO și enzimele de Modificare au fost aranjate Tandem. Genele pentru TsaB și TrmD au fost clonate în pET15b ca proteină de fuziune his-tag. Toate genele au fost clonate cu tehnica de asamblare Gibson (#e2611, New England Biolabs, SUA). Plasmidele rezultate au fost transformate într–o tulpină de E. coli BL21(DE3) și crescute în mediu de 1 L LB până la un OD660 de 0,6-1,0 la 37 C. Supraexprimarea a fost indusă prin adăugarea de IPTG la o concentrație finală de 1 mM pentru TsaB, TsaC, TsaD, TsaE și TrmD sau 0,1 mM pentru GlyA, MnmC, MnmE și GidA. După 3 ore de cultivare la 37 C, s-au recoltat celule. TsaB, TsaC, TsaE, TrmD, și mnme-celulele supraexprimate au fost omogenizate în 40 mL de tampon de liză (50 mm Hepes-KOH, pH 7,6, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2, și 7 mM 2-mercaptoetanol) și perturbat prin Sonicare. Lizatul rezultat a fost centrifugat și supernatantul a fost recuperat și amestecat cu 5 mL de rășină completă de purificare his-tag (#05893801001, Roche, Elveția) timp de 1 oră cu rotator. Rășina a fost spălată cu 100 mL tampon de liză și apoi proteina a fost eluată cu 25 mL tampon de eluție (50 mm Hepes-KOH, pH 7,6, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, 400 mm imidazol și 7 mM 2-mercaptoetanol). TsaB și TrmD au fost concentrate de Amion Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, SUA) și apoi dializate împotriva stocului tampon (50 mm Hepes-KOH, pH 7.6.500 mm KCl, 10 mM MgCl2, 7 mM 2-mercaptoetanol și 30% glicerol). Acestea au fost congelate flash cu azot lichid și depozitate la -80 la sută C. Pentru TsaC, TsaE și MnmE, Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, SUA) a fost adăugat la fracțiunile recuperate la o concentrație finală de 23 la sută g/ml pentru a elimina proteina SUMO marcată cu His. Fracțiile au fost dializate împotriva tamponului de clivaj (50 mm Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl și 7 mM 2-mercaptoetanol) peste noapte, în timp ce tamponul de clivaj conținea 500 mM KCl pentru prepararea MnmE. Probele dializate au fost din nou amestecate cu 5 mL de rășină completă de purificare his-tag cu rotator. Apoi au fost colectate fracțiile de curgere care conțin enzime de modificare. Probele recuperate au fost concentrate de Amion Ultra 3 kDa pentru TsaE sau Amion Ultra 10 kDa (#UFC901024, Merck Millipore, SUA) pentru TsaC și MnmE. Acestea au fost dializate împotriva tampon stoc, flash congelate cu azot lichid, și depozitate la -80 C. pentru prepararea GlyA, toate tampon conținut 10% glicerol și celelalte proceduri au fost aceleași ca și prepararea MnmE. TsaD sa dovedit a fi insolubil după Sonicare. Prin urmare, proteina a fost peletizată prin centrifugare la 20.400 de grame la 4 de grame C timp de 45 de minute și a fost omogenizată în tampon de liză suplimentat cu 4% Triton X-100. Suspensia a fost din nou peletizată prin centrifugare la 20.400 centimetric g timp de 45 min. Peleta a fost dizolvată cu tampon de liză suplimentat cu 6 m uree. Cealaltă procedură a fost aceeași cu prepararea MnmE, cu excepția faptului că toate tampoanele conțineau 2 m uree. Pentru prepararea MnmC, toți pașii până la îndepărtarea proteinei SUMO etichetate au fost aceiași cu prepararea GlyA. Deoarece MnmC legat nespecific de rășina de purificare his-tag, a fost selectată purificarea cu cromatografie cu schimb de anioni. Soluția după tratamentul cu Ulp1 a fost dializată împotriva tamponului IEX (50 mm Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 și 7 mM 2-mercaptoetanol) și apoi au fost aplicate pe o coloană HiTrap Q HP de 5 mL (#17115401, GE Healthcare, SUA). Coloana a fost spălată cu 25 mL de tampon iEx și apoi MnmC a fost eluat cu un gradient de căptușeală de la 100 mM la 1 m KCl în tampon IEX. Fracțiile care conțin MnmC au fost concentrate de către Amicon Ultra 30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, SUA), dializate împotriva stocului tampon, congelate flash cu azot lichid și depozitate la -80 C. observăm că putem împărtăși toate plasmidele la cereri.

prepararea arnvv

genele pentru fiecare arnvv (date suplimentare 1) au fost clonate în vectorul pGEMEX-1 (#P2211, Promega, SUA) între situsurile de restricție XbaI și BamHI. Folosind plasmidele rezultate ca șabloane, șabloanele ADN pentru transcripția in vitro au fost amplificate prin PCR folosind un primer promotor T7 ca primer înainte și primeri inversi adecvați pentru fiecare iVTtRNA (date suplimentare 1). Fiecare primer invers conținea o modificare 2 ‘- metoxi la a doua nucleotidă de la capătul 5’pentru a preveni adăugarea independentă de șablon a unei nucleotide suplimentare28. Produsele au fost purificate prin extracția fenolului/cloroformului/alcoolului izoamilic (25:24:1), urmată de precipitarea etanolului, iar precipitanții au fost dizolvați în apă. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). Componentele rnazei P compuse din proteina C5 și ARN M1 au fost adăugate ulterior la amestecurile de reacție la 150 nM pentru îndepărtarea celor 27 de nucleotide suplimentare, iar reacțiile au fost incubate timp de 1 oră la 37 C. Ivttrn-urile transcrise au fost apoi prelucrate cu extracție de fenol acid urmată de extracție de cloroform/alcool izoamilic (10:1), apoi purificare prin cromatografie cu schimb de anioni. Probele care conțin iVTtRNAs au fost încărcate pe coloane HiTrap Q HP de 10 mL (#17115401, GE Healthcare, SUA) și spălate cu tampon Q (20 mm HEPES-KOH pH 7,6 și 200 mM KCl). iVTtRNAs au fost eluate cu un gradient liniar de la 200 mM la 1 m KCl în tampon Q. Fracțiile conținând iVTtRNAs țintă, determinate de uree-PAGE, au fost recuperate prin precipitarea izopropanolului, iar iVTtRNAs precipitate au fost dizolvate în apă și depozitate la -80 C până la utilizare. Observăm că putem împărtăși toate plasmidele la cereri.

modificarea iVTtRNA

modificarea t6A37 a fost efectuată în amestecul de reacție conținând 50 mm Hepes-KOH, pH 7.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mM piridoxal-5′-fosfat, 1 mM Ser, 1 mM Gly, 36.4 µM SAM, 0.1 unitate/µL recombinant RNase inhibitor (#2313 O, TaKaRa, Japonia), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM MnmE, 2.5 µM MnmC, 6 A260 unitate/mL tRNAGluUUC sau tRNAGluCUC. După incubare la 37 C pentru 2 ore pentru modificarea t6A37 și m1g37 sau 4 ore pentru modificarea mnm5U34, Arnt-urile au fost prelucrate cu extracție de fenol acid urmată de extracție de cloroform/alcool izoamilic (10:1) și recuperate prin precipitare de izopropanol. Arnt-urile precipitate au fost dizolvate în apă și depozitate la -80 ct. Pentru modificarea mnm5U34, reacția a fost efectuată din nou cu Arnt recuperate. Au fost prelucrate cu extracție acidă de fenol urmată de extracție de cloroform / alcool izoamilic (10:1), desalinizate de coloanele MicroSpin G-25 (#27532501, GE Healthcare, SUA) și recuperate prin precipitare cu izopropanol. Arnt-urile precipitate au fost dizolvate în apă și depozitate la -80 CTC.pentru a cuantifica eficiența modificării, s-a utilizat 57,1 CTC în loc de 1 mm CT, iar amestecul fără TsaD a fost utilizat ca martor pentru modificarea t6A37. 36.4 s-a utilizat adenozil-metionină, iar amestecul fără TrmD a fost utilizat ca martor pentru modificarea m1G și fără GidA a fost utilizat ca control pentru modificarea mnm5u34. După incubare la 37 centimetric C, alicote (10 centimetric) au fost retrase și reperate pe discuri de filtrare Whatman 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, SUA). Discurile de filtrare au fost spălate de două ori cu 10% TCA, apoi etanol, urmată de măsurarea radioactivității de către un contor de scintilație lichidă. Pentru cuantificarea modificării mnm5U, Arnt – urile au fost purificate ca mai sus și apoi unitatea 0.02 A260 a fost reperată pe discurile de filtrare.

Aminoacilarea

experimentele de Aminoacilare au fost efectuate conform unui raport anterior47. Amestecurile de reacție (10 ilft) conțineau 100 mm HEPES-KOH pH 7,6, 15 mM MgCl2, 40 mM KCl, 1 mM DTT, 4 mm ATP, 1 unitate/ilft inhibitor de Rnază recombinant (#2313 a, TaKaRa, Japonia), 50 nM sau 1,5 LFT corespunzătoare fiecărui aminoacid, 20 ilft-aminoacid sau 68 ilft Asn pentru aminoacilarea asparaginei și 2 A260 unitate/mL Arnt. Pentru măsurarea metilării, s-a utilizat în schimb un amestec de 0,6 met și 3,4 L-metionină rece. Cys s-a obținut prin reducerea-cistinei cu 50 mM DTT la 37 XCT timp de 15 min. Pentru măsurarea cisteinilării, concentrația DTT a fost de 5 mM. când s-au utilizat amestecuri native de Arnt, s-au adăugat în schimb 40 A260 unități/ml amestecuri de Arnt (#10109541001, Sigma-Aldrich, SUA). După incubare la 37 centimetric C timp de 30 min, alicote (8 centimetric) au fost retrase și reperate pe discuri de filtrare Whatman 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, SUA). Discurile de filtrare au fost spălate de două ori cu 10% TCA, apoi cu etanol, urmată de măsurarea radioactivității printr-un contor de scintilație lichidă.

sinteza Octapeptidelor cu sistemul pur

șabloanele ADN care codifică octapeptidele au fost amplificate PCR cu primeri corespunzători (date suplimentare 2) folosind vectorul pURE1 (#PUREV001, BioComber, Japonia) conținând o secvență promotor T7 și situsul de legare a ribozomilor (secvența Shine-Dalgarno) ca șablon. Șabloanele ADN amplificate au fost purificate folosind un kit de purificare QIAquick PCR (#28104, QIAGEN, Germania). Reacțiile de sinteză a octapeptidelor au conținut 50 mm HEPES-KOH pH 7.6, 100 mm glutamat de potasiu, 13 mm acetat de magneziu, 2 mm spermidină, 1 mM DTT, 2 mm ATP, 2 mM GTP, 1 mM UTP, 1 mm CTP, 20 mm fosfat de creatină, 10 hectolitri/mL acid 10-formil-5,6,7,8-tetrahidrofolic, ribozom 0,2 centimm, șablon ADN 4 nM, componente proteice PURE ale sistemului, inclusiv factori de translație și enzime, aminoacizi și Arnt. Concentrațiile componentelor pure ale sistemului proteic au fost descrise într-un protocol anterior46. Observăm că toate cele 20 de Aars au fost incluse în acest experiment, indiferent de șabloanele ADN și codonii de testare. Compoziția și concentrația aminoacizilor, care depind de codonii de testare, sunt enumerate în datele suplimentare 2. Compoziția iVTtRNAs depinde de șablon, iar reacțiile au fost efectuate utilizând iVTtRNAs bazale (date suplimentare 2) în prezența sau absența iVTtRNAs de testare (date suplimentare 2). Concentrația fiecărui ARN iVTtRNA a fost fixată la 6 centimetrii. Când s-au utilizat amestecuri native de Arnt, s-au adăugat în schimb 56 A260 unități/ml amestecuri de Arnt (#10109541001, Sigma-Aldrich, SUA). Reacțiile au fost efectuate timp de 60 de minute la 37 de centi C și au fost retrase alicote, reperate pe hârtii de filtru Whatman de 3 MM (#1822-025, GE Healthcare, SUA), fierte în 10% TCA la 90 centi C timp de 30 de minute pentru a deacila aminoacil-ARN. Radioactivitatea în fracția insolubilă TCA de 10% a fost măsurată cu un contor de scintilație lichidă.

sinteza proteinelor cu sistemul pur

experimentele de sinteză a proteinelor au fost efectuate cu un kit PUREfrex 2.0 (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japonia) fără amestecuri de Arnt în soluția I (amestec tampon). Am adăugat în plus 0.2 met-uri de la x-mt, șablon ADN amplificat prin PCR de 4 nM pentru expresia DHFR sau sfGFP (date suplimentare 3) și o cantitate specificată de amestec de Arnt IV sau amestec nativ de Arnt. Reacțiile au fost efectuate la 30 sau 37 de centi C timp de 12 ore și au fost analizate proteinele sintetizate.

analiza proteinelor sintetizate

DHFR sintetizate și sfGFP conținând met radioactiv au fost analizate cu 15% SDS-PAGE, iar imaginea gelului a fost vizualizată folosind un analizor bio-imagistic BAS-5000 (GE Healthcare, SUA). Analiza temporală a expresiei sfGFP a fost realizată prin măsurarea fluorescenței sfGFP la fiecare 3 minute folosind un sistem StepOne qRT-PCR (#4376373, Applied Biosystems, SUA). Imaginile fluorescente ale sfGFP sintetizate în amestecuri de reacție au fost obținute folosind un instrument LAS-4000 (GE Healthcare, SUA). Activitatea DHFR sintetizată a fost măsurată conform descrierii anterioare44. Amestecurile de reacție (2 mL) conțineau 50 mM mes-KOH pH 7,0, 25 mM TRIS-HCl pH 7,0, 25 mm etanolamină, 100 mm Naci, 10 mM 2-mercaptoetanol, 0.EDTA de 1 mM, acid dihidrofolic de 100 mm și o alicotă de 10 mm din amestecul de reacție pură, și au fost incubate la 37 mm C timp de 15 min. În continuare, s-a adăugat NADPH de 20 mM la o concentrație finală de 200 mm, iar scăderea absorbanței la 340 nm a fost măsurată pe o perioadă de 10 min cu un spectrofotometru V-550 (Jasco, Japonia). O unitate de DHFR a fost definită ca fiind cantitatea de enzimă necesară pentru a procesa 1 centimol de acid dihidrofolic în 1 min la 37 centimol C.

analiza LC-MS a proteinelor sintetizate

DHFR cu secvență FLAG la capătul său (date suplimentare 3) a fost sintetizată cu un PUREfrex 2.0 kit (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japonia) fără amestecuri de Arnt în soluția I (amestec tampon). Am adăugat în plus 4 nM PCR-amplificat ADN șablon pentru DHFR etichetat cu secvență de pavilion la C-terminal (date suplimentare 3) și o cantitate specificată de amestec iVTtRNA sau amestec nativ Tarn. Reacțiile au fost efectuate la 30 C pentru 12 ore. Dhfr sintetizat a fost purificat cu margele magnetice anti-Pavilion m2 (#M8823, Sigma-Aldrich, SUA). Alicote (55 unqql) din amestecurile de reacție au fost amestecate cu 245 unqql din tamponul de spălare FLAG (50 mm Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mm NaCl, 20 mm Mg(OAc)2), și apoi amestecat cu 30 de bile de oktl timp de 1 h. perlele au fost spălate cu 210 oktl de tampon de spălare Pavilion urmată de spălare cu tampon fără Mg (OAc)2 de două ori (210 oktl și 180 oktl). Apoi, DHFR a fost eluat cu 50 unqtl din tamponul de spălare FLAG fără Mg (Oac) 2, dar suplimentat cu 100 de peptide 3xflag (#F4799, Sigma-Aldrich, SUA) după amestecarea ușoară timp de 1 oră. pregătirea probelor pentru analiza LC-MS a fost efectuată conform unui protocol asistat de surfactant de transfer de fază (PTS) 48. La probele eluate s-a adăugat un tampon PTS dens (100 mm deoxicolat de sodiu, 100 mM N-lauroilsarcosinat de sodiu și 500 mM NH4HCO3) de 40 de unqql. Acestea au fost reduse cu 10 mm TCEP la 37 centimetric C timp de 30 min, alchilate cu 20 mM iodoacetamidă la 37 centimetric C timp de 30 min și stinse cu 20 centimetric Cys. Fiecare soluție de reacție a fost împărțită în două porțiuni. Unul a fost digerat de 10 ng / ilfovl Lys-C (#90051, Thermo Fisher Scientific, SUA) și 10 ng/ilfovl tripsină (#90057, Thermo Fisher Scientific, SUA) la 37 Ilfov C peste noapte. Cealaltă a fost digerată de 10 ng / unqql Asp-N (#90053, Thermo Fisher Scientific, SUA) la 37 UNC C peste noapte. După digestie, s-a adăugat 10% acid trifluoroacetic (TFA) la o concentrație finală de 1%, iar soluțiile de reacție au fost centrifugate la 15.000 centimetric g timp de 5 min pentru a precipita detergenții. Supernatanții au fost desalinizați folosind vârfuri de etapă auto-pregătite49 și uscați cu SpeedVac. Analiza LC-MS a fost realizată folosind un spectrometru de masă Orbitrap (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, SUA) echipat cu o sursă de ioni nanospray (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, SUA) și un sistem nano-LC (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, SUA). Amestecurile de peptide uscate au fost dizolvate într-o soluție conținând 5% acetonitril și 0,1% TFA și fiecare probă a fost aplicată sistemului nano-LC. Peptidele au fost concentrate folosind o coloană de capcană (#164535, 0.075 de 20 mm, 3 de 3 mm, Acclaim PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, SUA) și apoi separate cu ajutorul unei coloane Nano capilare (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 centimm, C18, Nikkyo Technos, Japonia) folosind două faze mobile A (0,1% acid formic) și B (acetonitril și 0,1% acid formic) cu un gradient (5% B timp de 5 min, 5-45% B în 45 min, 45-90% B în 1 min și 90% B în 4 min) la un debit de 500 Nl/min. Eluția a fost electrosprayed direct (2.2 kV) în MS (modul pozitiv, gama de scanare de 200-1500 m/z, rezoluție 60.000 FWHM)50.