rezumat
transcrierea HIV-1 este reglată de CDK9 / ciclina T1, care, spre deosebire de o kinază tipică dependentă de ciclul celular, este reglată prin asocierea cu complexul proteic ribonuclear nuclear 7SK (snRNP). În timp ce componentele proteice ale acestui complex sunt bine studiate, mecanismul formării complexe nu este încă pe deplin înțeles. Asocierea CDK9 / ciclină T1 cu 7SK snRNP este, în parte, reglementată de o fosforilare reversibilă CDK9. Aici, prezentăm o revizuire cuprinzătoare a kinazelor și fosfatazelor implicate în fosforilarea CDK9 și discutăm rolul lor în reglarea replicării HIV-1 și potențialul de a fi vizat pentru dezvoltarea medicamentelor. Propunem o nouă cale de reglare a transcripției HIV – 1 prin fosforilarea CDK9 Ser-90 prin cdk2 și defosforilarea CDK9 Ser-175 prin proteina fosfatază-1.
1. Introducere
eradicarea completă a infecției cu HIV-1 necesită abordări noi pentru a induce provirusul integrat HIV-1 care nu este afectat de medicamentele antiretrovirale existente și care este rebound la terminarea terapiei antiretrovirale . Latența HIV-1 poate fi rezultatul mai multor factori, cum ar fi deficiența proteinei activatorului transcripțional HIV-1 (Tat) sau a activatorilor transcripționali celulari, interferența transcripțională cu promotorii celulari, site-ul de integrare nefavorabil, epigenetica și probabil alți factori . Astfel, o mai bună înțelegere a mecanismelor de activare a transcripției HIV-1 este importantă pentru proiectarea unor noi terapii care vizează inducerea, precum și inhibarea transcripției HIV-1. Aici, analizăm kinazele și fosfatazele implicate în activarea CDK9/ciclinei T1 și discutăm despre modul în care aceste enzime pot fi utilizate potențial pentru a inhiba sau activa HIV-1 pentru dezvoltarea viitoarelor intervenții terapeutice pentru tratamentul infecțiilor cu HIV-1.
2. Activarea transcrierii HIV-1 de către P-tefb
transcrierea HIV-1 este activată de proteina HIV-1 Tat care se leagă de umflătura ARN-ului TAR, o structură cu buclă de ac de păr situată la capătul 5’al tuturor transcrierilor HIV-1 în curs de formare și recrutează CDK9/ciclina T1, o componentă a factorului de alungire a transcrierii pozitive B (P-TEFb) la promotorul HIV-1 (revizuit în detaliu în ; Vezi și ilustrația din Figura 1). În timpul inițierii transcrierii, CDK7/ciclina h asociată TFIIH fosforilează Ser-5 în cadrul secvenței heptapeptidice 1ysptsps7 repetată de 52 de ori în domeniul C-terminal (CTD) al RNAPII . Rnapii Fosforilați Ser – 5 se acumulează la 20-40 nucleotide (nt) în aval de locul de pornire a transcripției, parțial datorită acțiunilor complexului factorului de alungire cu acțiune negativă, NELF și complexului inducător de sensibilitate DRB, DSIF . Recent, CDK7 asociat TFIIH a fost demonstrat că fosforilează și reziduurile CTD Ser-7, care pot primi fosforilarea Ser-2 prin P-TEFb . Recrutarea P-tefb la promotorul HIV-1 situat în regiunea U3-R-U5 a 5′ LTR este facilitată de Tat care vizează CDK9/ciclina T1 la ARN TAR unde ciclina T1 se leagă de bucla bogată în G a ARN TAR . Recrutarea CDK9 / ciclina T1 promovează alungirea transcripției prin ARN polimeraza II (RNAPII) care altfel este întreruptă după sinteza ARN-ului de gudron . Eliberarea RNAPII din pauză prin complexul P-TEFb este însoțită de plafonarea ARNm și pierderea NELF . P – Tefb declanșează alungirea transcripției ARN polimerazei II (RNAPII) prin fosforilarea factorului de alungire negativ (NELF) și a complexului de inducere a sensibilității DRB (DSIF/Spt4/Spt5), promovând astfel eliberarea reziduurilor NELF și, de asemenea, fosforilarea Ser-2 în CTD RNAPII (revizuit în ). La disocierea NELF, DSIF devine un factor de alungire pozitiv și crește procesivitatea RNAPII . Deși P-TEFb se deplasează cu complexul de alungire, activitatea sa de kinază CTD nu mai este necesară odată ce complexul este eliberat din pauză .
Reprezentarea schematică a reglării transcripției HIV-1 prin fosforilarea și defosforilarea CDK9. Figura descrie o rețea de factori de celule gazdă care interacționează cu Tat care afectează fosforilarea CDK9. Săgețile indică fosforilarea (violet), defosforilarea (portocaliu) și tranziția complexelor complexe P-TEF și transcripție (negru). CDK2 fosforilează CDK9 Ser-90. Chelatorii de fier reduc activitatea celulară a CDK2 / ciclinei E și inhibă transcrierea HIV-1 (indicată prin linia roșie). CDK7 fosforilează CDK9 Thr-186. Defosforilarea Thr-186 de PPM1A sau PP1 facilitează disocierea CDK9/ciclină T1 din complexul mare P-TEFb și recrutarea CDK9/ciclină T1 de Tat sau BRD4. BRD4 leagă preferențial CDK ser-175-fosforilat. 9. Defosforilarea Ser-175 de către PP1 activează activitatea kinazei CDK9 și activează transcrierea HIV-1. Recrutarea CDK9 / ciclină T1 prin Tat la ARN de gudron duce la fosforilarea NELF care disociază și, de asemenea, fosforilarea reziduurilor DSIF și RNAPII CTD Ser-2, Care este facilitată de fosforilarea CTD Ser-7. CDK7 ca parte a TFIIH fosforilează reziduurile CTD Ser-5 și, eventual, Ser-7. CDK7 fosforilează, de asemenea, CDK9 Thr-186 și menține fosforilarea CDK9 Thr-186 în timpul alungirii transcripției.
Din cauza importanței P-TEFb, regulamentul trebuie să fie menținute pentru a asigura buna funcționare. Fosforilarea și defosforilarea siturilor specifice de pe CDK9 trebuie să aibă loc pe tot parcursul procesului de transcriere și trebuie să fie strict controlate. Această revizuire se concentrează pe reglementarea CDK9 prin modificări de fosforilare.
3. Compoziția P-TEFb și rolul său în activarea transcripției HIV-1
P-TEFb este un heterodimer format din kinaza 9 dependentă de ciclină (CDK9) și unul dintre ciclinele de tip C T1, T2a sau T2b dintre care ciclina T1 este cel mai abundent partener . Ciclina K, despre care se credea inițial că este o ciclină minoră a CDK9, este acum recunoscută ca fiind un partener de ciclină pentru CDK12 și CDK13 . Numai proteina ciclină T1 formează eficient un complex cu HIV-1 Tat legat de ARN TAR . Acest lucru se datorează prezenței unui reziduu de cisteină în ciclina T1 în poziția 261, mai degrabă decât o asparagină Găsită în proteinele ciclinei T2a și T2b. Ciclina T1 cu CYS-261 mutant se leagă de Tat, dar nu este în măsură să recruteze Tat la ARN TAR. Interacțiunea Tat cu ARN-ul TAR și ciclina T1 depinde de ionii de zinc care necesită din nou prezența Cys-261 .
există două izoforme funcționale ale CDK9: o formă de 42 kDa exprimată predominant în splină, timus și testicul și o formă de 55 kDa care este exprimată în diferite țesuturi, dar la niveluri semnificativ mai mici, care este izoforma de 42 Kd . Toate ciclinele se asociază cu ambele izoforme ale CDK9 și prezintă activitate kinazei către CTD în RNAPII . Aproximativ jumătate din P-TEFb se află într-un complex mare inactiv legat de snRNA 7SK și mai multe proteine suplimentare , inclusiv proteina 1 inductibilă cu hexametilen bisacetamidă (HEXIM1), proteina LARP7 legată de La și enzima de acoperire a metilfosfatazei mepce . Forma cu greutate moleculară mai mică A P-TEFb constă din CDK9 și ciclină T1 și este activă enzimatic . P-tefb cu greutate moleculară mare este inactiv din cauza HEXIM1 care introduce secvența sa inhibitoare pynt în situsul activ al CDK9 .complexul p-tefb cu greutate moleculară mare servește ca sursă de CDK9 / ciclină T1 pentru recrutarea de către HIV-1 Tat . În celulele induse de stres, complexul CDK9/ciclină T1 se disociază de proteina 7 SK ARN/HEXIM1 și apoi se leagă BRD4 și formează un complex mic activ transcripțional care este recrutat la diferiți promotori celulari . În ciuda inactivității complexului mare P-TEFb in vitro, complexul mare, și nu complexul mic, este important pentru activarea transcripției HIV-1 ca HIV-1. Tat concurează cu HEXIM1 pentru legarea la ciclina T1 promovând disocierea P-TEFb din complexul mare . Proteina HIV-1 Tat s-a dovedit, de asemenea, că recrutează un complex mare de p-TEFb la promotorul HIV-1, unde ARN-ul TAR a fost capabil să deplaseze 7 ARN SK și să activeze P-tefb .
Tat facilitează, de asemenea, formarea complexului de super elongație (SEC) care conține p-tefb activ și factori de alungire suplimentari și coactivatori de transcripție . Acești factori includ AFF4, ENL, AF9 și factorul de alungire ELL2 . Proteina AFF4 apare ca schela centrală care recrutează alți factori prin interacțiuni directe. AFF4 leagă ciclina T1, ELL2 și ENL sau AF9 acționând ca o punte care leagă acest complex de P-TEFB . Prin funcțiile de legătură ale Tat și AFF4, P-TEFB și ELL2 se combină pentru a forma un complex de alungire bifuncțională care activează foarte mult transcrierea HIV-1 . Fără Tat, AFF4 poate media interacțiunea ELL2-P-TEFb, deși ineficient. Tat depășește această limitare aducând mai mult ELL2 la P-TEFb și stabilizând ELL2 într-un proces care necesită p-tefb activ .
4. Fosforilarea CDK9
activitatea P-TEFb depinde de fosforilarea mai multor reziduuri de serină și treonină și vom discuta acest lucru mai jos și care sunt prezentate în modelul CDK9/ciclină T1 / Tat din Figura 2.
structura complexului CDK9/ciclină T1 / Tat (model bazat pe PDB 3MIA). Reprezentarea coloanei vertebrale a reziduurilor CDK9 prezente în structura originală PDB este prezentată în culoarea verde, ciclina T1—în violet și Tat—în roșu. Este indicată poziția clusterului Ser-29, Ser-175, Thr-186 și C-terminal Ser/Thr. De asemenea, sunt prezentate situsul de legare ATP și ionii Zn care facilitează interacțiunea Tat-ciclină T1.
4.1. C-terminal Cdk9 fosforilarea
un grup de reziduuri C-terminale CDK9 (Ser-347, Ser-353 și Ser-357; Thr-350 și Thr-354) este autofosforilat și această fosforilare este importantă pentru legarea CDK9/ciclina T1 de ARN-ul gudronului . Acest lucru a fost evidențiat de incapacitatea CDK9 trunchiat C-terminal activ enzimatic de a lega ARN-ul gudronului . Cdk9/ciclina T1 recombinantă care a fost autofosforilată in vitro a fost defoshorilată eficient de către protein fosfataza 2a (PP2A), dar nu și de proteina fosfataza-1 (PP1) . De asemenea, tratamentul cu PP2A a împiedicat legarea CDK9/ciclina T1 de Tat și ARN TAR in vitro . Aceste observații au sugerat că PP2A poate viza c-terminalul CDK9 și poate controla interacțiunea P-TEFb cu ARN TAR. Autofosforilarea CDK9 asociată cu complexul de preinițiere in vitro a fost inhibată de TFIIH . PP2A s-a dovedit ulterior a fi esențial pentru transcrierea bazală HIV-1 in vitro, deoarece depleția PP2A a inhibat transcrierea bazală HIV-1 și adăugarea PP2A la extractele epuizate a restabilit transcrierea . Obiectivul PP2A a fost considerat a fi Thr-29 (a se vedea mai jos), dar acest lucru nu a fost dovedit cu certitudine și efectul nu a fost reprodus in vivo. Într-un studiu timpuriu, am observat o inducție ușoară a transcripției HIV-1 bazală, dar nu indusă de Tat, prin concentrații scăzute inhibitoare PP2A de acid okadaic . De asemenea, am observat inducerea transcripției bazale și nu a transcripției HIV-1 activate de tat cu supraexprimarea proteinei LIS1 pe care am constatat că o leagă și inhibă PP2A in vitro și interacționează cu proteina HIV-1 Tat . În mod colectiv, aceste studii indică faptul că PP2A poate regla transcripția bazală HIV-1 și, de asemenea, poate controla interacțiunea P-TEFb cu ARN TAR prin defosforilarea terminalului C al CDK9.
4.2. N-terminal Thr-29 fosforilarea
fosforilarea THR-29 a CDK9 s-a dovedit a fi indusă de proteina fiscală HTLV-1 . CDK9 / ciclina T1 este recrutată pentru HIV-1 ltr cromatinizat și alți promotori de către BRD4 . Această recrutare BRD4 a fost legată de fosforilarea CDK9 Thr-29 și cerința de defosforilare PP2A de către grupul lui John Brady . Cu toate acestea , grupul lui Qiang Zhou a raportat că CDK9 este necesar să fie fosforilat pe Ser-175 pentru a se lega de BRD4, lucru confirmat recent de grupul lui Jonathan Karn (a se vedea discuția detaliată de mai jos). CDK9 Thr-29 este omolog cu Thr-15 pe CDK2, în care fosforilarea inhibă activitatea CDK2 . Într-adevăr, s-a demonstrat că fosforilarea Thr-29 inhibă activitatea CDK9 și transcripția HIV-1 . Cu toate acestea, nu am reușit să detectăm fosforilarea CDK9 Thr-29 în celulele tratate cu acid okadaic care a inhibat atât PP2A, cât și PP1 folosind o combinație de electroforeză în strat subțire Hunter 2D și spectrometrie de masă de înaltă rezoluție care a arătat doar fosforilarea clusterului Ser/Thr C-terminal și Ser-175 din care numai fosforilarea Ser-175 a fost indusă de acidul okadaic . Astfel, fosforilarea CDK9 Thr-29 poate să nu fie controlată de PP2A și trebuie validată în continuare pentru a-și clarifica rolul în timpul transcrierii HIV-1.
4.3. Bucla T A CDK9 Thr-186 fosforilare
bucla CDK9 t conține mai multe situsuri de fosforilare, inclusiv Ser-175 și Thr-186 (Figura 2). Fosforilarea THR-186 conservat este necesară pentru activitatea enzimatică a CDK9 . De asemenea, asocierea CDK9/ciclină T1 cu ARN 7SK snRNP necesită fosforilarea THR-186 a CDK9 . În CDK-uri, fosforilarea buclei T declanșează modificări conformaționale majore care deschid buzunarul de legare ATP și un situs de legare a substratului, făcând CDK-urile pe deplin active ca kinază .
recent, analiza Chimico-genetică utilizând inhibarea chimică selectivă a CDK7 a arătat că este singurul responsabil pentru fosforilarea CDK9 Thr-186 și pentru fosforilarea ser-2 CTD dependentă de P-tefb și ubiquitilarea histonei H2B in vivo . Astfel, CDK7 / ciclina H, care a fost identificată anterior ca kinază Activatoare CDK (Cak) pentru CDK-urile implicate în ciclul celular, cum ar fi CDK1, 2 și 4, funcționează, de asemenea, cak pentru CDK-urile implicate în reglarea transcrierii care includ CDK8, 9, 12 și 13 (revizuite în ). Analiza globală a kinazelor care pot fosforila bucla t CDK9 folosind siARN identificat ca(2+)/kinaza dependentă de calmodulină 1D (CaMK1D) doborâtă prin siARN scăderea fosforilării Thr-186 . În consecință, inhibarea moleculei mici a căii de semnalizare Ca(2+) a scăzut fosforilarea Thr-186 și a inhibat transcripția HIV-1 indusă de TAT, dar nu transcripția HTLV-1 mediată de impozite . Deoarece transcrierea mediată fiscal este determinată de P-TEFb, rămâne de investigat în continuare de ce a fost afectată doar transcrierea HIV-1.
fosforilarea CDK9 Thr-186 poate fi controlată și prin fosfataze celulare. Studiile noastre din ultimul deceniu s-au concentrat asupra PP1 pe care am observat-o inițial pentru a stimula transcripția HIV-1 dependentă de Tat in vitro . Când am supraexprimat una dintre principalele subunități de Reglementare Nucleară ale PP1, NIPP1 (inhibitor nuclear al PP1), am observat inhibarea specifică PP1 a transcripției HIV-1 și a replicării virale . Am observat că Tat conține o secvență similară cu un motiv rvxf de legare PP1 conservat și am arătat că acest motiv mediază legarea Tat la PP1 in vitro și in vivo și că mutația reziduurilor din motivul de legare PP1 (V36A și F38A) a împiedicat Tat să inducă transcrierea HIV-1 . CDK9 care a fost fosforilat în celule cultivate cu ortofosfat (32P) și tratat cu acid okadaic a fost defofosforilat eficient in vitro de PP1, dar nu PP2A, spre deosebire de CDK9 autofosforilat in vitro care a fost defosforilat de PP2A și nu de PP1 . Aceste rezultate au sugerat că PP1 poate controla fosforilarea CDK9 în timpul transcrierii HIV-1. Într-adevăr, subunitatea catalitică alfa a PP1, PP1a, s-a dovedit că acționează cooperativ și secvențial cu (Ca2+)-calmodulină-proteină fosfatază 2B (PP2B) în celule iradiate cu UV sau hexametilen bisacetamidă (HMBA) – tratate în care P-TEFb este eliberat din complexul 7SK snRNP . În timp ce PP2B induce o schimbare conformațională în 7SK snRNP, PP1a defosforilează CDK9 Thr-186 și facilitează eliberarea P-TEFb de la 7SK snRNP . CDK9 a rămas defosforilat în timp ce era asociat cu BRD4 și a fost recrutat în complexul de preinițiere, unde poate fi reactivat de CDK7 asociat TFIIH. În conformitate cu acest studiu, am observat o creștere a fosforilării CDK9 Thr-186 în celulele care au exprimat stabil o peptidă inhibitoare PP1, domeniul central al NIPP1 și, de asemenea, am observat o asociere crescută a CDK9/ciclină T1 cu ARN 7SK . Expresia stabilă a cdNIPP1 a perturbat interacțiunea dintre Tat și PP1 și a inhibat transcrierea HIV-1 , sugerând că trebuie menținut un echilibru între fosforilarea și defosforilarea CDK9 Thr-186 și că deplasarea acestui echilibru către fosforilare este inhibitoare pentru transcrierea HIV-1. Expresia cdNIPP1 într-o manieră relevantă fiziologic ca parte a genomului HIV-1 în locul replicării HIV-1 inhibată puternic de nef , sugerând în continuare că inhibitorii vizați de PP1 pot fi utilizați ca potențiali terapeutici anti-HIV-1. În timp ce PP1 este un candidat pentru defosforilarea Thr-186, am constatat, de asemenea, că defosforilează CDK9 Ser-175 (vezi mai jos). O fosfatază CDK9 Thr-186 suplimentară, proteină fosfatază 1A dependentă de magneziu (fostă 2C) (PPM1A) a fost identificată utilizând o bibliotecă de expresie a fosfatazei și anticorpi Thr-186-fosfospecifici . Supraexpresia PPM1A a scăzut fosforilarea Thr-186 și epuizarea mediată de siRNA au crescut-o, iar P-TEFb și PPM1A au coprecipitat împreună, sugerând că CDK9 poate fi un substrat fiziologic pentru PPM1A . Un studiu mai recent a arătat că fosforilarea THR-186 a CDK9 este scăzută în celulele T CD4(+) în repaus, care nu sunt permisive pentru replicarea HIV-1 și că această scădere s-a corelat cu abundența PPM1A și recrutarea limitată a CDK9 la complexul mare P-TEFb . Această constatare susține în continuare necesitatea complexului mare pentru transcrierea HIV-1 și rolul critic al PPM1A în suprimarea HIV-1 în celulele T în repaus. Deoarece expresia PPM1A nu a fost modificată la activarea celulelor T, totuși factori de reglementare necunoscuți pot fi implicați în reglarea activității PPM1A.
4.4. Fosforilarea Ser-175 a buclei T A CDK9
odată ce CDK9 / ciclina T1 se disociază de complexul mare P-TEFb, CDK9 poate deveni fosforilat pe Ser-175. În timp ce defosforilarea Thr-186 a inhibat total activitatea kinazei CDK9/ciclină T1, nu s-a găsit nicio diferență în activitățile kinazei mutanților CDK9 S175A și CDK9 s175d de către David Price și colegii săi . În schimb, Qiang Zhou și grupul său au arătat că mutantul CDK9 S175A era inactiv, în timp ce mutantul CDK9 s175d era activ ca kinază . De asemenea, au arătat că fosforilarea Ser-175 promovează legarea CDK9/ciclina T1 la Brd4 . S-a sugerat că fosforilarea Ser-175 poate provoca o modificare conformațională a CDK9, permițând BRD4 să se lege de ciclina T1 . În studiul nostru recent, am constatat că inhibarea dinamică a PP1 a dus la fosforilarea exclusivă a CDK9 Ser-175, determinată de o combinație de cartografiere a peptidelor Hunter 2D și analiză LC-MS in vivo . Inhibarea PP1 a condus la inhibarea activității CDK9 și la reducerea fosforilării RNAPII in vitro și in vivo . Am constatat că mutantul CDK9 S175A a fost activ enzimatic și a indus transcripția HIV-1 . Interesant este că, în timp ce mutantul CDK9 s175d a fost mai puțin activ ca kinază, a format mai ușor complexul p-TEFb mic, mai ales atunci când PP1 a fost inhibat. Astfel am ajuns la concluzia că PP1 activează transcripția HIV-1 prin defosforilarea reziduului CDK9 Ser-175. De asemenea, am observat că activitatea de fosforilare Ser-175 a fost mult mai abundentă decât activitatea Thr-186 în extractele celulare, sugerând că activitatea CDK9 poate fi suprimată în mod natural prin overfosforilarea Ser-175. Un studiu recent realizat de grupul lui Jonathan Karn a arătat că activarea celulelor T prin receptorul celulelor T (TCR) sau prin semnalizarea esterului phorbol (PMA) a indus puternic fosforilarea Cdk9 Ser-175 . Pe baza modelării moleculare au propus că Ser-175 fosforilat formează o legătură de hidrogen cu Tat Lys-14 întărind legarea Tat la CDK9/ciclina T1 și promovând activarea transcripției HIV-1 . De asemenea, în conformitate cu observațiile timpurii, s-a constatat că mutația CDK9 s175a elimină legarea la BRD4 . De asemenea, în conformitate cu observațiile noastre, s-a constatat că mutantul CDK9 S175A induce foarte mult reactivarea latentă HIV-1 dependentă de Tat, pe care Jonathan Karn și colegii săi au atribuit-o incapacității acestui mutant de a lega BRD4 în timp ce se poate lega de Tat . De asemenea , au descoperit că CDK9 fosforilat la Ser-175 este exclus din complexul 7SK RNP, care este paralel cu observația noastră anterioară că mutantul FOSFOMIMETIC CDK9 S175D a fost găsit în complexul mic P-TEFb . Astfel, acest ultim studiu indică Ser-175 ca o țintă importantă pentru reactivarea HIV-1 și dezvoltarea potențială a terapiei cu molecule mici.
am dezvoltat recent molecule mici orientate spre PP1 care au fost modelate pentru a se potrivi cavității rvxf pe PP1 . Am analizat practic aproximativ 300.000 de compuși și apoi am analizat fizic aproximativ 1000 de compuși și am identificat un compus hit, 1H4, care a inhibat transcripția și replicarea HIV-1 la concentrații noncitotoxice . 1H4 a împiedicat defosforilarea mediată de PP1 a unei peptide substrat care conține o secvență RVxF in vitro, a perturbat asocierea PP1 cu Tat în celulele cultivate și a împiedicat translocarea PP1 la nucleu . În prezent, suntem în proces de rafinare a compusului hit și, de asemenea, dezvoltăm compuși vizați de PP1 pentru activarea provirusului latent.
4.5. Fosforilarea Ser-90 a CDK9
noi și alții am arătat mai devreme că transcrierea HIV-1 este activată de Tat în faza G1, dar nu în faza G2 . Astfel, am emis ipoteza că Tat ar putea angaja o kinază reglatoare a ciclului celular, pe care am arătat-o a fi CDK2/ciclină E . HIV – 1 este inhibat în celulele cdk2 knockdown și , de asemenea, în diferențierea macrofagelor de celulele stem pluripotente induse cu cdk2 knockdown, sugerând în continuare că CDK2 este important pentru transcrierea și replicarea HIV-1. Legătura funcțională dintre CDK2 și CDK9 a fost găsită atunci când am analizat inhibarea HIV-1 de către chelatorii de fier. Transcripția HIV – 1 a fost inhibată în celulele T tratate cu chelatori de fier 311 și ICL670 care au inhibat, de asemenea, activitatea celulară a CDK2 și CDK9 . Chelatorii de fier tridentați pe bază de di-2-piridilcetonă pe bază de tiosemicarbazonă au inhibat transcrierea HIV-1 și replicarea virusului la concentrații mult mai mici decât 311 sau ILC670 și, de asemenea, au inhibat activitatea CDK2 și CDK9 . În timp ce mecanismul inhibării CDK2 nu este încă clarificat, este probabil să includă inducerea p21 prin reglarea în sus a factorului 1 indus de hipoxie (HIF-1), deoarece epuizarea fierului elimină fierul din prolil hidroxilază și crește nivelurile de proteine HIF-1 și HIF-2 imitând efectul hipoxiei . Am analizat fosforilarea CDK9 prin CDK2 in vitro și am identificat un motiv (90SPYNR94) care a reprezentat un situs de fosforilare cdk2 consens și care a fost eficient fosforilat . Fosforilarea CDK9 pe Ser-90 a fost detectată cu anticorpi fosfospecifici și a fost redusă după eliminarea CDK2. Asocierea mutanților CDK9 S90A cu complexul mare P-TEFb a fost redusă, iar supraexpresia sa a inhibat transcrierea HIV-1. În schimb, mutantul CDK9 s90d a arătat asociere neschimbată cu complexe p-tefb mari și mici și transcripție HIV-1 dependentă de Tat indusă. Cu toate acestea, fosfomimeticul S90 a arătat o scădere generală a expresiei CDK9 sugerând că trebuie menținut un echilibru de fosforilare/defosforilare pentru a forma complexele p-tefb mari și mici. Modelarea moleculară a arătat că Ser-90 de CDK9 a fost localizat pe o buclă flexibilă expusă la solvent, sugerând că ar putea fi supus fosforilării (văzută și în Figura 2). Astfel, studiile noastre recente au identificat un nou situs de fosforilare reglator pe CDK9 care poate fi vizat pentru activarea sau inhibarea transcripției HIV-1.
5. Concluzie
fosforilarea și defosforilarea unor situsuri specifice pe CDK9 are loc pe tot parcursul procesului de transcriere și trebuie să fie strict controlate. Modificările la anumite reziduuri de treonină / serină determină dacă CDK9 se asociază cu complexul mare P-TEFb pentru a deveni disponibil pentru recrutare și dacă disocierea complexului mare va avea loc eficient. Fosforilarea Thr-186 în bucla T A CDK9 și Ser-90 care se află în afara buclei t determină dacă CDK9 rămâne sechestrat în complexul mare inactiv și, de asemenea, dacă kinaza este activă enzimatic odată ce este disociată de 7SK snRNP. Defosforilarea la oricare dintre aceste site-uri duce la destabilizarea complexului mare și eliberarea CDK9/ciclină T1, restricționând astfel recrutarea Tat la HIV-1 LTR. Modificările în capătul C al CDK9 permit ciclina T1: legarea gudronului și defosforilarea la aceste locuri împiedică legarea ARN-ului toTAR. În schimb, fosforilarea la reziduurile Thr-29 sau Ser-175 inhibă CDK9. Astfel, imaginea emergentă a reglării CDK9 prin fosforilare pare a fi complexă și parțial paralelă cu ceea ce este cunoscut pentru alte CDK-uri. Kinazele identificate recent CDK9, CDK7, CDK2 și fosfatazele, PP1 și PPM1A vor apărea probabil ca ținte noi pentru anti-HIV-1 și terapia cancerului.
Conflict de interese
autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.
mulțumiri
acest proiect a fost susținut de Centrul de dezvoltare pentru cercetarea SIDA din Districtul Columbia (P30AI087714), RCMI-NIH 2g12rr003048 din cadrul Programului centre de cercetare în instituții minoritare (Rcmi) (Divizia de infrastructură de Cercetare, Centrul Național pentru resurse de cercetare, NIH), Fundația rusă pentru cercetare de bază (nr. 12-04-91444-NIZ) și Ministerul rus al Educației și științei (nr. 2012-1.5-12-000-1001-030). Autorii ar dori, de asemenea, să mulțumească membrilor laboratorului Nekhai pentru sugestii și să-și ceară scuze pentru cei a căror lucrare nu a fost citată din cauza lipsei de spațiu.
