CRBN este degradată eficient prin heterodimerizarea VHL-CRBN protacs

Tehnologia PROTAC utilizează ligazele E3 pentru a distruge proteinele țintă. Astfel, ne-am întrebat dacă o ligază E3 în sine poate fi ubiquitinată și degradată de o altă ligază E3 dacă două ligaze E3 diferite sunt plasate în apropiere. Degradanții VHL pot fi substituenți ai eritropoietinei prin activarea HIF1a. Pentru a proiecta acest lucru, am conectat pomalidomida, o moleculă care vizează CRBN, la VHL032, un ligand de ligază VHL E3 (Fig. 1A). Linker-ul a conectat gruparea amino a pomalidomidei și gruparea acetil terminală a VH032; deoarece acestea sunt regiuni expuse la solvent, o legătură între ele nu ar perturba probabil legarea lor la fiecare ligază E3. Pentru sinteza protacurilor heterodimerizante VHL-CRBN (Fig. 1b și suplimentar Fig. S1A), 4-fluorotalidomida (1) și ligandul VHL (5) au fost preparate conform celor raportate anterior33. 4-Fluorotalidomida (1) a fost tratată cu patru legături de amină (2) care poartă o grupare ester terț-butilic în prezența N,n-diizopropiletilamină (DIPEA) în dimetil sulfoxid (DMSO) pentru a forma un intermediar (3). După deprotecția grupării terț-butil în 3 prin tratament cu acid trifluoroacetic (TFA) în diclormetan (DCM), acidul (4) a fost cuplat cu ligandul VHL (5 sau 7) în prezența 1–1h-1,2,3-triazolopiridiniu 3-oxid hexafluorofosfat (HATU) și DIPEA pentru a produce PROTACS (6), TD-158, TD-165, TD-343 și TD-487 (8).

după tratamentul cu acești compuși, am examinat nivelurile de VHL și CRBN prin analiza Western blot. Tratamentul cu TD-158, TD-165 sau TD-343 a determinat o scădere dependentă de concentrație a nivelului proteinelor CRBN (Fig. 1C, panoul superior). Cu toate acestea, nivelurile atât ale formei lungi VHL, cât și ale formei scurte VHL au crescut, probabil datorită stabilizării prin interacțiunea Chimico-proteică (Fig. 1C, panouri superioare-medii și inferioare-medii) 34. În cazul tratamentului cu 10 centimm TD-158, nivelurile de CRBN au fost restabilite; acest efect de „cârlig” este o caracteristică tipică care apare în contextul degradării proteinelor induse de protac în doze mari9,35,36,37. Cu toate acestea, TD-487, un stereoizomer al TD-165, nu a reușit să inducă degradarea CRBN (Fig. 1C). TD – 343 a avut o activitate relativ slabă, ceea ce înseamnă că încorporarea oxigenului în linker inhibă activitatea PROTAC. O analiză cantitativă a reacției în lanț a transcripției inverse-polimerazei (RT-PCR) a indicat că scăderea nivelului CRBN indusă de protac-urile heterodimerizante VHL-CRBN nu a rezultat din modificări ale ARNm (Fig suplimentar. S1B). Valorile concentrației de degradare de 50% (DC50) și ale degradării maxime (Dmax) au fost măsurate pentru toți compușii sintetizați. Valorile DC50 și Dmax calculate pentru TD-158 au fost de 44,5 nM și 97.1%, respectiv, iar valorile corespunzătoare pentru TD-165 au fost de 20,4 nM și 99,6% (Fig. 1D și suplimentar Fig. S1D). Degradatorul cu conținut de linker mai scurt TD-156 (DC50 = 100,6 nM, Dmax = 96,9%) a prezentat o activitate mai slabă comparativ cu TD-165 (suplimentar Fig. S1C). TD – 343 (DC50 = 367,8 nM, Dmax = 85,1%), cu oxigen încorporat în linker, a dus la degradarea ineficientă a CRBN. Pentru a testa efectul legăturii cu talidomida, am examinat degradarea CRBN prin heterodimerizarea Protac-urilor VHL-CRBN cu o legătură diferită. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, Dmax = 82%), cu o legătură glicolică, și TD-033 (DC50 = 2546,1 nM), cu o legătură amidică, au prezentat o degradare redusă a CRBN, în timp ce TD-759 (DC50 = 28,8 nM), cu o legătură glicină, au prezentat o potență similară cu cea a TD-165. Pentru a determina dacă nivelurile relative de proteine ar putea contribui la această degradare părtinitoare a proteinelor, am tratat celulele supraexprimând VHL, CRBN sau ambele cu TD-158 și am analizat nivelurile de CRBN și VHL. În toate cazurile, nivelurile de CRBN au fost reduse, în timp ce nivelurile de VHL au rămas similare sau crescute (Fig. 1E). În experimentele de timp, TD-158 a degradat CRBN cu mai mult de 80% în decurs de 3 ore și l-a degradat complet după 12 ore (Fig. 1F). Degradarea CRBN indusă de TD-158 a fost observată și în diferite linii celulare umane (Fig suplimentar. S2A-D).

degradarea CRBN de către Heterodimerizarea VHL-CRBN protacs este dependentă de CRL2VHL

pentru a verifica dacă degradarea CRBN de către TD-158 a fost dependentă de UPS sau ligaze ubiquitin cu inel Cullin (CRL), am testat bortezomib, un inhibitor de proteazom, și MLN4924, un inhibitor de neddilare. Tratamentul concomitent cu TD-158 și bortezomib sau MLN4924 a prevenit degradarea CRBN (Fig. 2A și suplimentare Fig. S3A). Așa cum era de așteptat, formarea lanțului de poli-ubiquitină a crescut semnificativ în prezența TD-158 (Fig. 2B). În plus, eliminarea VHL prin ARN interferent mic (siARN) a atenuat degradarea CRBN indusă de TD-158 în celulele HEK293T (Fig. 2C). În schimb, expresia VHL în celulele 786-o, o linie celulară de carcinom renal cu deficit de VHL, a restabilit degradarea CRBN indusă de TD-158 (Fig. 2D). În conformitate cu aceste rezultate, eliminarea mediată de siRNA a Cullin2, o proteină de schelă a complexului CRL2VHL, a împiedicat degradarea CRBN indusă de TD-158 (Fig. 2E). În mod colectiv, aceste rezultate indică faptul că degradarea CRBN prin heterodimerizarea VHL-CRBN PROTACs este dependentă de complexul CRL2VHL.

degradarea eficientă prin Protac necesită formarea unui complex ternar cu proteina țintă și ligaza e39,38. Pentru a testa acest lucru, am efectuat experimente de co-imunoprecipitare. Am constatat că a exprimat exogen crbn marcat cu pavilion co-imunoprecipitat VHL endogen în prezența TD-158, dar nu și în absența acestuia (Fig. 2F). Experimentele de extragere GST folosind proteine purificate au arătat că CRBN a interacționat direct cu complexul VHL-Elongin B/C în prezența TD-158 (Fig. 2G). Mai mult, adăugarea excesului de pomalidomidă sau ligand VHL a inhibat degradarea CRBN indusă de TD-158 (Fig suplimentar. S3B, C). Exprimat exogen CRBN Y384/W386A (AA), un mutant defect de legare a pomalidomidei16, nu a fost degradat de TD-158 (suplimentar Fig. S3D). Astfel, aceste date sugerează că formarea unui complex ternar între CRBN, VHL și TD-158 este o condiție prealabilă pentru degradarea CRBN.

o analiză proteomică globală relevă faptul că TD-158 induce degradarea CRBN

pentru a examina degradarea CRBN într-un mod imparțial, am efectuat o analiză proteomică cantitativă. Pentru a minimiza efectele secundare ale degradării CRBN, am tratat celulele Jurkat, care au exprimat substraturi CRBN și IMID neo, cu TD-158 sau DMSO (controlul vehiculului) timp de 12 ore. proteinele din fiecare probă au fost digerate și peptidele digerate au fost etichetate pentru etichetarea izobarică cuplată la cromatografie lichidă-spectrometrie de masă tandem. Această analiză a identificat 7.148 de proteine care conțin mai mult de trei peptide unice non-redundante (tabelul suplimentar S1). Doar trei proteine-CRBN, CNIH1 și LMBRD2—au îndeplinit criteriile unei valori P = 0,05 și mai mult de o modificare de 1,5 ori. Dintre acestea, CRBN a fost singura proteină care s-a schimbat de mai mult de 2 ori (Fig. 3A). Cu toate acestea, nivelurile altor componente ale complexelor CRL4CRBN (CUL4A, CUL4B, DDB1 și RBX1) și ale complexelor CRL2VHL (elongin C , elongin B , CUL2 și RBX1) au rămas neschimbate (Fig. 3B, C). Interesant este că nivelurile neo-substraturilor IMID raportate anterior, inclusiv IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 și ZNF653, nu au fost modificate la tratamentul cu TD-158 (Fig. 3B) 39,40,41. Aceste rezultate au fost confirmate prin imunoblotting în Jurkat și diferite linii celulare de mielom multiplu (Fig. 3D și suplimentare Fig. S2A-D).

degradarea CRBN prin protac heterodimerizarea VHL-CRBN recapitulează o deficiență CRBN

un substrat endogen al CRL4CRBN este glul glutamin sintetaza, care este o enzimă cheie în biogeneza glutaminei. Acetiltransferaza CBP/p300 acetilează două reziduuri de lizină N-terminală ale GLUL în condiții de niveluri ridicate de glutamină, iar glul acetilat rezultat este capturat și ubiquitinat de CRL4CRBN și ulterior îndepărtat de proteazome22. Pentru a examina efectul TD-158 asupra nivelurilor GLUL, am înfometat celulele Hep3B de glutamină timp de 48 de ore și apoi am reaprovizionat glutamina în prezența sau absența TD-158. TD-158 a indus degradarea CRBN indiferent de statusul glutaminei, iar nivelurile de GLUL au scăzut mai lent în timp în prezența TD-158 decât în absența acestuia (Fig. 4A, B). Mai mult, testele de ubiquitinare in vivo au arătat că ubiquitinarea GLUL a scăzut în prezența TD-158 (Fig. 4C). De asemenea, am investigat dacă tratamentul TD-165 conferă rezistență celulară la IMiD. Două linii celulare sensibile la IMiD, WSU-DLCL2 și RPMI8226, au fost pre-tratate cu TD-165 sau DMSO timp de 24 de ore și apoi tratate cu pomalidomidă, TD-165 sau ambele pentru 3 zile. Pre-tratamentul cu TD-165 a redus efectele anti-proliferative ale pomalidomidei în ambele linii celulare (Fig. 4D, E). Luate împreună, aceste date indică faptul că degradarea CRBN prin heterodimerizarea VHL-CRBN protacs recapitulează o deficiență CRBN.

pentru a investiga efectele in vivo ale protac-urilor heterodimerizante VHL-CRBN, am încercat să determinăm dacă TD-165 poate induce degradarea CRBN la modelele animale. Deși reziduurile de aminoacizi din CRBN de șoarece (mCRBN) importante pentru teratogenitate nu sunt conservate, mCRBN a fost degradat distinct, deși într-o măsură puțin mai mică, de TD-165 în fibroblastele embrionare de șoarece (Fig suplimentar. S4A). Apoi am administrat TD-165 intraperitoneal la șoareci pentru a determina dacă TD-165 induce degradarea CRBN in vivo. Cu toate acestea, nivelurile de CRBN nu au fost modificate în splină, celulele mononucleare din sângele periferic (Pbmc) sau ficat (suplimentar Fig. S4B). Având în vedere că farmacocinetica TD-165 este rezonabilă (tabelul suplimentar S2), această absență a unui efect poate fi atribuită legării mari de proteinele plasmatice (99, 9%) A TD-165 (tabelul suplimentar S3).

n-trunchiat terminal CRBN nu este degradat prin heterodimerizarea Protac-urilor VHL-CRBN

pentru a determina ce domeniu al CRBN este important pentru degradarea CRBN mediată de TD–165, am generat o serie de mutanți de deleție CRBN (D1–D4), așa cum este descris în Fig. 5A. celulele care exprimă CRBN de lungime întreagă sau mutanții individuali de deleție au fost tratați fie cu DMSO, fie cu TD-165, iar lizații celulari au fost examinați pentru degradare după tratamentul cu TD-165. În mod surprinzător, niciunul dintre cei patru mutanți de ștergere a CRBN nu a fost degradat de TD-165, în timp ce CRBN de lungime completă a fost degradat eficient (Fig. 5B). În special, nivelurile VHL au fost ușor ridicate, probabil datorită stabilizării interacțiunii Chimico-proteice în prezența TD-165, dar nu au fost modificate prin expresia mutanților crbn trunchiați în prezența TD-165 (Fig. 5B). O posibilă explicație pentru acest lucru ar fi incapacitatea mutanților de ștergere de a forma un complex ternar. Cu toate acestea, mutantul D1 a format un complex ternar cu TD-165 și VHL (Fig. 5C), iar ubiquitinarea D1 a crescut în prezența TD-165 (Fig. 5D). Apoi am emis ipoteza că reziduurile de lizină amino-terminală ale CRBN sunt necesare pentru ubiquitinare. Pentru a testa această idee, am înlocuit toate cele trei reziduuri de lizină din n-capătul CRBN (a.a. 1-80) cu arginină, individual și în combinație, și apoi am examinat lizatele celulare pentru degradarea CRBN. TD-158 a degradat eficient toți mutanții în aceeași măsură ca crbn de tip sălbatic (Fig. 5E), indicând faptul că cele trei reziduuri de lizină la capătul N al CRBN nu sunt necesare pentru degradarea indusă de protac-urile heterodimerizante VHL-CRBN.

Regiunea dezordonată a proteinei vizate este necesară pentru degradarea eficientă indusă de PROTAC

în continuare am căutat să determinăm diferențele structurale dintre CRBN de lungime completă și mutantul de deleție CRBN D1. N-terminalul CRBN (a.a. 1-80) a fost prezis să conțină o regiune desfăcută sau intrinsec dezordonată, pe baza unei analize IUPred2A (Fig suplimentar. S5A). Această regiune dezordonată (a. a. 1-48) a fost într-adevăr indiscernibil în structura cristalină CRL4CRBN datorită flexibilității sale (intrare PDB; 6BN7). S-a demonstrat că regiunea intrinsec dezordonată este una dintre componentele principale ale degronului proteazomal și acționează ca inițiator al proteolizei proteazomale25. Alternativ, în cazul proteinelor globulare fără Regiune dezordonată, complexul proteic P97/valosin (P97/VCP) poate desfășura structura secundară, facilitând degradarea proteazomală a proteinelor. Pentru a examina relația dintre degradarea proteinelor induse de PROTAC și complexul p97/VCP, am testat efectul N2,N4-dibenzilchinazolină-2,4-diamină (DBeQ), un inhibitor p97/VCP, asupra degradării CRBN induse de TD-165. Aceste experimente au arătat că degradarea CRBN nu a fost influențată de tratamentul cu DBeQ (Fig. 6A). Nivelurile de transcript 3 inductibil de deteriorare a ADN-ului (DDIT-3; CHOP) și LC-3II lipidate, utilizate ca controale pozitive, au fost crescute la tratamentul cu DBeQ. Eliminarea p97 prin tratamentul cu siARN sau DBeQ a afectat căile ERAD și autofagia, ducând la reglarea în sus a CHOP, un marker UPR bine stabilit și acumularea de LC-3II, respectiv un marker reprezentativ de autofagie (Fig. 6A) 42. Prin urmare, pentru a investiga dacă Regiunea dezordonată a CRBN facilitează degradarea proteazomală indusă de PROTAC, am atașat Regiunea dezordonată (a.a. 1-80) a CRBN la mutanții D2, D3 și D4 și am examinat proteinele himerice pentru degradare. Toate proteinele chimerice, în special chimera D4, au fost degradate de TD-165 într-o manieră dependentă de concentrație (Fig. 6B). Cu toate acestea, introducerea unei regiuni dezordonate CRBN fie la capătul N – sau C al VHL nu a indus degradarea proteinei de fuziune (Fig. 6C), indicând faptul că atașarea regiunii dezordonate nu este suficientă pentru toate proteinele vizate. Pentru a extinde această idee la degradarea indusă de alte Protac-uri, am testat ARCC4, un receptor androgen (ar) protac43 raportat anterior, deoarece AR adăpostește, de asemenea, o regiune desfășurată la capătul N (a.a. 1-330), așa cum este determinat cu ajutorul instrumentului de analiză IUPred2A (suplimentar Fig. S5B). În urma tratamentului cu ARCC4, AR fără Regiunea dezordonată N-terminală (XVN330) a fost degradată mai puțin eficient decât ar de lungime întreagă. În mod intrigant, atașarea regiunii dezordonate CRBN (a.a. 1-80) la AR XVN330 a crescut eficiența degradării (Fig. 6D și suplimentare Fig. S5C). În conformitate cu aceasta, atașarea regiunii dezordonate AR (a.a. 1-170) la mutantul CRBN D1 a promovat, de asemenea, proteoliza prin TD-165 (Fig. 6E și suplimentare Fig. S5D).

pentru a consolida și mai mult aceste constatări, am selectat Protac-uri cu potență ridicată (DC50 < 1 intrinsec) pe baza unei căutări în literatură și apoi le-am analizat pentru o regiune intrinsecă dezordonată folosind instrumentul IUPred2A. Interesant este că două treimi din proteinele selectate vizate de PROTAC s-au dovedit a poseda o regiune dezordonată de peste 40 de aminoacizi, fie la unul dintre terminalele lor, fie intern (Tabelul 1)44, deși predicția bazată pe secvența de aminoacizi a regiunilor dezordonate sau nestructurate nu ia în considerare alți factori, cum ar fi interacțiunea proteină-proteină sau modificările post-translaționale44,45,46. În conformitate cu aceasta, s-a demonstrat că VHL-Homo-PROTAC induce degradarea formei lungi VHL, care adăpostește o regiune dezordonată la capătul său n, dar nu și forma scurtă VHL47. Astfel, acest lucru susține ideea noastră că regiunea dezordonată a proteinelor vizate este necesară pentru degradarea eficientă de către PROTACs.