gazdă fungică

ciupercile filamentoase pot servi drept gazde pentru o fabrică de celule de acid carminic microbian, deoarece au capacitatea de a furniza o cantitate amplă de blocuri de acetil-CoA și malonil-CoA schelă. De asemenea, oferă infrastructura celulară necesară pentru a găzdui membrana ER legată de C-glucoziltransferaza UGT28. Deoarece A. nidulans posedă un set de instrumente de inginerie genetică bine dezvoltat, am ales această specie ca punct de plecare spre dezvoltarea unei fabrici de celule de acid carminic fungic. La fel ca majoritatea ciupercilor filamentoase, A. nidulans este capabil să producă o multitudine de metaboliți secundari biosintetici diferiți, inclusiv un număr semnificativ de polichetide aromatice. Chiang și colab. au demonstrat anterior că deleția clusterelor de gene care sunt responsabile pentru formarea principalelor produse PKS endogene în A. nidulans11, a îmbunătățit potențialul A. nidulans ca o fabrică de celule pentru producția heterologă de polichetide. În acest fel, bazinele de blocuri de acetil-CoA și malonil-CoA sunt crescute, iar analizele chimice ulterioare pentru formarea de noi produse simplificate. Ca un prim pas către o fabrică de celule fungice pentru producția de acid carminic, am eliminat, prin urmare, căile biosintetice pentru polichetidele aromatice dominante care ar putea interfera cu producția de acid carminic și ar putea complica analiza și purificarea în aval. Mai exact, grupurile de gene pentru producerea de aspertecină, monodictifenonă și sterigmatocistină au fost eliminate, precum și genele responsabile pentru formarea pigmentului conidiei verzi, wA și yA, au fost eliminate într-un fundal A. nidulans defectuos. Pe lângă lipsa preconizată a pigmenților conidiali, tulpina rezultată, NID2252, nu a prezentat efecte vizibile asupra morfologiei și fitnessului (fișier suplimentar, Fig. 1). Prin urmare, am folosit NID2252 ca tulpină de referință și ca bază pentru construirea unei fabrici de celule fungice pentru producția de acid carminic.

proiectarea unei căi semi-naturale pentru formarea antronului acidului flavokermesic

blocajul major pentru construirea unei fabrici de celule de acid carminic microbian a fost lipsa unui PKS natural care sintetizează antronul acidului flavokermesic, primul intermediar presupus în cale. Pentru a ocoli această limitare, am urmărit o cale biosintetică alternativă pentru producerea acestei Polichete. Antrona acidului flavokermesic octaketide, cu modelul său de ciclizare C7-C12, C5-C14 și C2-C15, ar putea fi teoretic formată într-o singură etapă printr-un PKS iterativ de tip I care nu reduce fungii care posedă un domeniu șablon de produs adecvat (Fig. 1 stânga). Cu toate acestea, astfel de enzime nu au fost încă descrise în literatură. Un mecanism alternativ pentru formarea antronei acidului flavocermezic este printr-o reacție în două etape în care un PKS sintetizează un lanț octacetidic liniar neredus, care ulterior este ciclizat în structura dorită prin ciclaze/aromataze cu acțiune trans (Fig. 1 dreapta). Reacțiile de acest tip există în natură, de exemplu, în calea actinorhodinei (Act) în Streptomyces coelicolor12. În acest caz, coloana vertebrală a octaketidei este sintetizată de un sistem PKS de tip II bacterian multi-subunitate, KSa, Kscq și ACP (act minimal PKS), care este redus de actKR în poziția C9 și apoi pliat de aromataza/ciclaza, actARO/CYC și ciclaza actCYC2, pentru a produce compusul triciclic 3,8-dihidroxi-1-metilantrachinonă-2-acid carboxilic (DMAC)7. DMAC afișează același pliu ca antrona acidului flavokermesic, dar este redusă la poziția C9.

de interes special pentru studiul de față, este zhui ciclaza și zhuj aromataza din Streptomyces sp. R1128, care catalizează două reacții de ciclizare secvențială a polichetidelor liniare nereduse în pliuri similare cu cele ale acidului flavocermezic un tron13. Mai exact, ciclaza ZhuI este responsabilă pentru închiderea primului inel, C7-C12, și aromataza ZhuJ pentru închiderea celui de-al doilea inel, C5-C14. Al treilea inel, C2-C15, se formează spontan. ZhuI și ZhuJ au fost anterior co-exprimate în S. coelicolor cu octacetida care formează tipul II acționează PKS minim, rezultând formarea acidului flavocermezic, cunoscut sub numele de acid 3,6,8-trihidroxi-1-metilantrachinonă-2-carboxilic (TMAC) în literatura bacteriană14. Din păcate, o strategie identică poate fi dificil de implementat în A. nidulans, deoarece PKS-urile minime de tip II nu au fost implementate cu succes la gazdele heterologe din afara genului Streptomyces, în ciuda mai multor încercări15. Și într-adevăr, încercările noastre de a reconstitui minipks act în A. nidulans și Saccharomyces cerevisiae s-au dovedit în mod similar nereușite (datele nu sunt prezentate). O modalitate alternativă de formare a octacetidei nereduse necesare este de a se baza pe enzimele PKS de tip III, care au fost exprimate cu succes în drojdie, de exemplu în legătură cu biosinteza flavonoidelor16. De interes special este Aloe arborescens octaketide sintaza( OKS), care a fost descrisă pentru a produce octaketide nereduse care se pliază spontan în sek4 și SEK4b în vitro17 (Fig. 2a). Cu toate acestea, în Aspergillus a rămas netestat dacă produsele PKSs de tip III, care sunt enzime independente de ACP care eliberează acizi carboxilici, pot fi pliate de tipul de ciclază ZhuI care a fost descris ca acționând asupra substraturilor legate de ACP. Prin urmare, în studiul actual ne-am propus să testăm Compatibilitatea OKS de plante de tip III cu cea a ciclazelor/aromatazelor din sistemele PKS bacteriene de tip II, cu scopul de a dezvolta o cale biosintetică Artificială de novo pentru formarea precursorului antronic al acidului flavocermezic pentru formarea acidului carminic.

producția de precursori de polichetide pentru producția de acid carminic în A. nidulans

pentru a testa performanța in vivo a OKS într-o gazdă fungică, am introdus OKS controlate de promotorul gpdA A. nidulans ca o singură copie într-un locus definit (site de integrare 5, IS5) în A. genomul nidulan18. Au fost construite două tulpini, una care exprimă secvența de codificare OKS nativă și una care exprimă o versiune optimizată a codonului pentru exprimare în A. nidulans. După șapte zile de incubare pe medii solide de creștere, a se vedea secțiunea Metode pentru detalii, ambele tulpini au prezentat o puternică colorare roșu-maronie a miceliului (Fig. 2b). Profilarea metabolică prin HPLC-HRMS a tulpinilor nu a evidențiat urme ale unei octacetide nereduse, ci mai degrabă sek4 și SEK4b așteptate împreună cu acidul flavocermezic și alți trei compuși abundenți de identitate necunoscută (Fig. 2c), care nu au fost prezente în tulpina de referință NID2252. SEK4 și SEK4b au fost identificate pe baza analizei HPLC-HRMS/MS (fișier suplimentar, Fig. 2) și a fost în conformitate cu valorile raportate anterior19, în timp ce acidul flavocermezic a fost comparat cu o referință autentică izolată din D. coccus9 (fișier suplimentar, Fig. 3). Metabolitul se eluează la 13,0 min. avea un ion pseudomolecular + de m / z 303.0867, corespunzând unei formule moleculare de C16H14O6, în concordanță cu produsul de șunt octacetidă cunoscut, mutactină, descris anterior în experimentele bazate pe Streptomyces cu Clusterul genei Act7. Această identificare a fost confirmată prin analiza detaliată a spectrului UV și susținută de timpul de retenție relativ la SEK4 și SEK4b (fișier suplimentar, Fig. 4). Cei doi metaboliți suplimentari cu formule moleculare de C16H12O6 (- m/z 299.0566) au indicat produse de octacetidă, dar totuși nu corespund unui produs comun de șunt (fișier suplimentar, Fig. 5). Prin urmare, metaboliții au fost izolați și elucidarea structurii pe baza experimentelor RMN 1D și 2D i-a identificat ca dehidro-SEK4 (cunoscut și sub numele de B26 în literatura bacteriană) și dehidro-sek4b20 (fișier suplimentar, figurile 6-11). Formarea celor șase polichetide noi observate în tulpina OKS poate fi explicată prin trei reacții spontane diferite de închidere a primului inel: C7-C12 (SEK4, dehidro-SEK4 și acid flavokermesic), C10-C15 (SEK4b și dehidro-sek4b) și C7-C12 după reducerea cetonei C9 (mutactină) (Fig. 2a și dosarul suplimentar, Fig. 12). Dintre acestea, numai primul tip de închidere a inelului (C7-C12) permite formarea ulterioară a antronei dorite a acidului flavokermezic printr-o a doua închidere a inelului C5-C14 și a treia închidere a inelului C2-C15. SEK4 și SEK4b s-au raportat anterior că se deshidratează spontan pentru a forma dehidro-SEK4 și, respectiv, dehidro-sek4b, în timp ce formarea mutactinei depinde de reducerea enzimatică a poziției C9 a lanțului polichidic înainte de pliere21. Formarea acidului flavocermezic, un intermediar cunoscut în calea acidului carminic (Fig. 1), a fost neașteptat, deoarece nu s-a raportat că acest metabolit se formează spontan din lanțuri de octacetide nereduse. Acest lucru sugerează că A. nidulans produce în mod natural un număr de ciclaze/aromataze care promovează modelul de pliere dorit. Profilarea metabolitului celor două tulpini care exprimă OK nu a evidențiat diferențe substanțiale în nivelurile de producție și am decis să ne concentrăm asupra tulpinii care exprimă versiunea nativă a OKS ca bază pentru dezvoltarea ulterioară a unei fabrici de celule fungice pentru producția de acid carminic.

Ingineria căii de pliere a octacetidelor nereduse

plierea promiscuă a octacetidei nereduse reduce randamentul acidului flavocermezic dorit. Prin urmare, ne-am imaginat că producția de acid flavokermesic ar putea fi crescută prin eficientizarea procesului de pliere în direcția dorită prin exprimarea versiunilor optimizate de codon ale ZhuI și ZhuJ. Pentru a examina dacă ZhuI și ZhuJ interferează cu metabolismul nativ al A. nidulans, am construit mai întâi tulpini care exprimă ZhuI și ZhuJ individual și în combinație din loci genomici definiți (IS6 și IS7) în A. nidulans nid2252 tulpina de referință. Profilarea metabolică prin HPLC-HRMS a celor trei tulpini nu a evidențiat diferențe metabolice detectabile (Fig. 3b). Apoi am construit o tulpină care exprimă OKS cu ZhuI, care codifică ciclazele care catalizează formarea închiderii primului inel C7-C12 (Fig. 3a). În comparație cu tulpina care exprimă doar OK, această tulpină a prezentat creșteri de 2,5, 2,2 și 2,1 ori ale nivelurilor de acid flavokermesic, SEK4 și, respectiv, dehidro-sek4. În acord cu zhui ghidarea plierii în direcția dorită, aceste modificări metabolice au fost însoțite de niveluri reduse de metaboliți care conțin primele pliuri inelare nedorite (Fig. 3b și Tabelul 1). O tulpină coexprimând OKS și ZhuJ, care codifică aromatazele care catalizează închiderea inelului secund C5-C14 (Fig. 3a), a produs o creștere de 2,7 ori a nivelurilor de acid flavokermesic. Această creștere a fost însoțită de o reducere a nivelurilor de metaboliți cu un prim inel C7-C12 (SEK4 și dehidro-SEK4), în timp ce, așa cum era de așteptat, nivelul metaboliților cu primul inel C10-C15 nedorit (SEK4b și dehidro-sek4b) nu a fost afectat (Fig. 3b și Tabelul 1). În cele din urmă, analiza tulpinii care exprimă ZhuI, ZhuJ și OKS a arătat o creștere de 4,1 ori a producției de acid flavocermezic comparativ cu momentul în care OKS a fost exprimat singur. Mai mult, această creștere este cu 60% mai mare decât cea observată la tulpinile care exprimă OKS în combinație fie cu ZhuI, respectiv ZhuJ (Tabelul 1). Acest rezultat indică faptul că ciclaza și aromataza, în mod aditiv, sunt capabile să crească fluxul în calea Artificială de novo către produsul dorit, acidul flavocermezic (Fig. 3b).

în mod surprinzător și foarte încurajator, analiza metabolică ulterioară a tulpinii coexpresoare OKS, ZhuI și ZhuJ a arătat că formarea crescută a acidului flavokermesic a fost însoțită de producerea acidului kermesic (Fig. 4). Prin Urmare, A. nidulanii furnizează monooxigenaza necesară pentru transformarea acidului flavocermezic în acid kermesic, care poate servi drept intermediar final în calea acidului carminic (Fig. 1).

producerea acidului carminic în A. nidulans

ultima etapă în formarea acidului carminic implică c-glucozilarea acidului kermesic (Fig. 5a). Enzima responsabilă pentru această etapă în calea biosintetică a acidului carminic a fost identificată anterior în D. coccus și caracterizată prin Expresie heterologă în S. cerevisiae8. Prin urmare, am introdus gena de codificare UGT2, optimizată pentru exprimare în A. nidulans, în locusul IS4 al tulpinii de referință NID2252 și pentru a completa calea biosintetică a acidului carminic semi-natural în A. nidulans, în același locus în tulpina care exprimă Co-ZhuI, ZhuJ și OKS. Expresia UGT2 singur în tulpina de referință nu a afectat aspectul culorii mediului de creștere și nici profilul metabolic al A. nidulans în comparație cu tulpina de referință NID2252 (Fig. 5b, c). În schimb, coexprimarea OKS, ZhuI, ZhuJ și UGT2 a dat naștere unei colorări roșii a mediului, sugerând că s-a format un colorant(coloranți) mai solubil (i) în apă (Fig. 5b). Analiza direcționată LC-HRMS a acestei tulpini a confirmat formarea acidului carminic22 (fișier suplimentar, Fig. 13), împreună cu dcII9, 23 și un izomer dcII (fișier suplimentar, Fig. 14), arătând că UGT2 a fost funcțional în A. nidulani și ar putea finaliza cu succes calea biosintetică (Fig. 5c). Identificarea pozitivă a acidului carminic și a dcII s-a bazat pe Timpi de retenție similari, Spectre UV, modele de fragmentare MS și MS/MS pentru standardele pure ale celor doi compuși. Trei izomeri ai acidului carminic au fost descriși în literatură (acid carminic, DCIV și DCVII) de Stathopoulou și colab.23, toate cele trei prezintă timpi de retenție diferiți în analiza bazată pe LC-MS/MS. În analiza noastră am detectat doar acid carminic și nu DCIV și DCVII pe baza timpului de retenție și a modelului de fragmentare a standardului autentic de acid carminic izolat de D. coccus (fișier suplimentar, Fig. 13). Împreună, datele noastre demonstrează ferm că este posibil să se producă acid carminic în A. nidulans pe baza unei căi semi-naturale.