când vine vorba de solubilizarea și denaturarea proteinelor înainte de focalizarea izoelectrică și electroforeza în gel 2-D, majoritatea cercetătorilor aleg ureea. Acest lucru nu este surprinzător, deoarece acest agent chaotropic ușor poate perturba complet interacțiunile dintre moleculele de proteine și poate crește eficiența activității proteazei în digestia proteinelor, prevenind în mod eficient agregarea și/sau precipitarea proteinelor. În plus, ureea este utilizată și pentru renaturarea proteinelor din probele denaturate anterior.

în ciuda popularității sale ca un denaturant eficient de proteine, utilizarea soluției de uree în digestia proteinelor vine cu o provocare deosebită – crește riscul de carbamilare. De ce ar trebui să te preocupe asta? Iată câteva motive pentru care carbamilarea poate fi în detrimentul experimentului dvs. și de ce ar trebui evitată cu orice preț.

1. În afară de blocarea capetelor n-terminale ale moleculelor de proteine, carbamilarea interferează cu caracterizarea proteinelor și le face indisponibile pentru utilizare ulterioară.
2. atacă agresiv lanțurile laterale ale reziduurilor de arginină și lizină și face ca proteina să nu fie potrivită pentru digerarea enzimatică.
3. împiedică digestia enzimatică a proteinelor și afectează negativ identificarea și cuantificarea proteinelor în analiza SM.
4. confundă rezultatele obținute din peptide cu timpi de retenție neașteptate și crește complexitatea eșantionului.
5. reduce eficiența ionizării și afectează negativ intensitatea semnalului vârfurilor detectate.
6. induce o schimbare a punctului izoelectric al proteinelor și duce la rezultate artifactuale.
7. poate afecta rezultatele studiilor de carbamilare in vivo.

Ce cauzează Carbamilarea?

prin definiție, carbamilarea se referă la modificarea post-translațională care modifică proprietățile structurale și funcționale ale proteinelor. Acest lucru este cauzat de reacția non-enzimatică dintre acidul izocianic și grupările amino libere.

în soluții apoase, ureea există în echilibru cu cianatul de amoniu. Este important de reținut că (1) ureea în soluție disociază spontan producând ioni cianat și amoniu, (2) se degradează în acid izocianic (CNOH), forma care reacționează activ cu grupările amino proteice și induce carbamilarea și (3) rata la care ureea disociază și gradul de carbamilare depinde de temperatură, pH și timpul de incubație.

prevenirea Carbamilării: câteva sfaturi utile de luat în considerare

nimic nu poate schimba faptul că ureea în prezența căldurii și a proteinelor va duce întotdeauna la carbamilare. Puteți utiliza ureea de cea mai înaltă calitate disponibilă și riscați în continuare carbamilarea.din fericire ,există mai multe modalități de a proteja peptidele de carbamilare. Iată câteva strategii eficiente care pot fi utilizate pentru a atinge acest obiectiv.

• utilizați întotdeauna reactivi pe bază de uree proaspăt preparați atunci când efectuați proceduri proteomice. Utilizați tampoane preamestecate și gata de utilizare pe bază de uree uscată de înaltă calitate din surse credibile și aveți grijă extremă la pregătirea probelor. Notă: depozitați materialul solid la temperatura camerei și mențineți manipularea la minimum.
• îndepărtați ureea din proba de proteine înainte de digestie prin utilizarea dializei și/sau a cromatografiei de fază inversată rapid sau prin utilizarea coloanelor de spin.
• se menține proba la o temperatură relativ scăzută pentru a scădea viteza cu care ureea se descompune. Evitați încălzirea tampoanelor care conțin uree peste 37oC pentru a reduce riscul de carbamilare.
• Deionizați soluția de uree folosind o rășină schimbătoare de ioni pentru a reduce concentrația de cianat.
• acidificați soluția de uree (100 mm HCl) pentru a împiedica formarea acidului izocianic.
• utilizați reactivi precum etanolamină, etilendiamină, metilamină și Tris-HCl pentru a minimiza carbamilarea proteinelor/peptidelor. Acești reactivi ajută prin curățarea moleculelor de cianat, făcându-le astfel indisponibile pentru peptide.

Desigur, aceste strategii au propriile dezavantaje (adică., necesită un timp extins de manipulare, induce precipitarea proteinelor ușor denaturate și poate fi nepotrivit pentru numeroase tehnici de digestie enzimatică), dar din moment ce digestiile enzimatice sunt efectuate la temperaturi ridicate pe o perioadă lungă de timp, nu aveți de ales decât să eliminați ureea din amestecul de digestie. În caz contrar, veți avea întotdeauna riscul de carbamilare. E un risc pe care n-ai vrea să ți-l asumi.