studiu de caz: descoperirea inhibitorilor canalelor de sodiu cu tensiune
ca o modalitate de a ilustra problemele legate de descoperirea medicamentelor cu canal ionic prezentate mai sus, restul acestui articol va descrie un studiu de caz axat pe identificarea inhibitorilor canalelor de sodiu cu tensiune pentru tratarea durerii neuropatice cronice. Tratamentul durerii este o problemă medicală gravă și există un efort major în industria farmaceutică pentru a dezvolta noi terapii pentru această afecțiune. În special, tratamentul durerii neuropatice, definit ca” durere cronică care rezultă dintr-o leziune primară sau disfuncție a sistemului nervos periferic ” de către Asociația Internațională pentru Studiul Durerii (IASP), rămâne o nevoie medicală majoră nesatisfăcută.
este clar că canalele de sodiu cu tensiune (Nav1) joacă un rol cheie în inițierea și propagarea potențialelor de acțiune ale nervilor senzoriali necesare semnalizării durerii. Aplicațiile locale ale blocantelor de canale de sodiu selective nonsubtype, cum ar fi novocaina, asigură ameliorarea completă a durerii prin blocul de conducere. Cu toate acestea, această abordare a ameliorării durerii este limitată la foarte puține aplicații, cum ar fi procedurile dentare, deoarece canalele de sodiu sunt, de asemenea, vitale pentru conducerea în inimă, SNC, mușchii scheletici și neuronii senzoriali nonnociceptivi. Familia Nav1 Super este formată din 10 membri (Yu și Catterall, 2004). Șapte dintre aceste subtipuri, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8 și Nav1.9, sunt prezente în sistemul nervos periferic (PNS). Dintre acestea, Nav1.7, Nav1.8 și Nav1.9 sunt exprimate predominant în neuronii nociceptivi și Nav1.3 este predominant embrionar, dar este reglementat în PNS adult după rănire. Acest model de Expresie limitat face ca aceste subtipuri să fie ținte atractive pentru dezvoltarea de noi agenți analgezici. Cu toate acestea, contribuția lor relativă la semnalizarea durerii și, în special, la semnalizarea durerii neuropatice, este neclară și poate varia în funcție de diferite etiologii și calități senzoriale ale durerii.
în absența selectivității moleculare pentru un subtip Nav1, este posibil să se vizeze în mod specific canalele Nav1 într–o stare conformațională dată, păstrând în același timp conducerea impulsului dependentă de canalul de sodiu. Acest tip de inhibare dependentă de stare este baza ferestrei terapeutice observate cu anticonvulsivante și antiaritmice care blochează canalele de sodiu, cum ar fi lamotrigina și lidocaina. Aceste medicamente au o afinitate mai mare pentru canalele în stările deschise și/sau inactivate decât pentru canalele de repaus, închise. Acest mecanism de inhibare favorizează legarea în țesuturile cu ardere rapidă sau parțial depolarizate. Durerea neuropatică ar trebui să fie sensibilă la acest mecanism inhibitor, deoarece se crede că apare din zonele de depolarizări induse de leziuni, ipoteză care este susținută de eficacitatea clinică a lidocainei administrate sistemic la doze subanestezice. Mai mult, Blocul nonsubtype-selectiv, dependent de stat, poate permite cea mai mare eficacitate, deoarece eliminarea individuală a Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8 sau Nav1.9 nu a furnizat dovezi convingătoare pentru un rol dominant al oricăruia dintre aceste canale în semnalizarea durerii neuropatice.
pe baza acestui raționament, s-a luat decizia de a urmări inițial inhibitori selectivi Nonsubtipici, dependenți de starea Nav1, în timp ce monitorizarea selectivității moleculare prin testarea compușilor de interes pe Nav1.7, Nav1.5 (canalul primar de sodiu cardiac) și Nav1.8 în paralel.
a fost utilizat un test pe bază de potențial de membrană pentru a examina 200.000 de compuși pe Nav1.8 exprimați stabil într–o linie celulară recombinantă. Acest test HTS s–a bazat pe transferul de energie prin rezonanță fluorescentă (FRET) între doi membri ai unei perechi de coloranți sensibili la potențialul membranei dezvoltate de Aurora Biosciences (Priest și colab., 2004). Canalele Nav1.8 au fost preincubate cu compusul de testare și cu agonistul chimic deltametrin în absența sodiului extracelular. Adăugarea ulterioară de sodiu a dus la depolarizarea membranei și blocul Nav1 a fost cuantificat ca interferență cu acel proces de depolarizare celulară.
deși ecranul inițial pe Nav1.8 a dat o varietate de hit-uri, doar un singur compus a fost considerat un avantaj viabil pentru eforturile de chimie medicinale. Înainte de a angaja resurse pentru acest plumb, compusul, o succinimidă disubstituită denumită bpbts(N- {metil}-n’-(2,2′-bithien-5-il metil)succinimidă), a fost examinat în detaliu prin clemă manuală de tensiune a întregii celule. S-a constatat că BPBT inhibă toate subtipurile Nav1 cu potență similară, iar inhibarea a fost dependentă de potențialul membranei și de frecvența stimulării. Acest mecanism inhibitor a fost în concordanță cu afinitatea mai mare a compusului pentru canalele în stare deschisă și inactivată, comparativ cu canalele în stare de repaus. În plus, BPBT-urile au fost cu două ordine de mărime mai puternice decât blocanții Nav1 anticonvulsivanți și antiaritmici utilizați clinic, inhibând starea inactivată a Nav1.8, Nav1.7, Nav1.5 și Nav1.2, cu valori Ki de 0,09, 0,15, 0,08 și 0,14, iar starea de repaus cu valori Kr de 1,5, 1,3, 0,3 și, respectiv, 1,2, (Priest et al., 2004).
ca atare, BPBTS a fost un avantaj atractiv pentru chimia medicamentelor; principalele sale datorii fiind un profil farmacocinetic slab. Pe parcursul profilării analogilor BPBT, precum și a inhibitorilor Nav1 publicați, utilizând testul de screening fluorescent bazat pe potențial de membrană, au fost observate discrepanțe bazate pe structură între potențele determinate în testul fluorescent și prin electrofiziologie pentru câțiva compuși. Aceste discrepanțe au fost urmărite la o interacțiune între acești compuși și veratridina agonistă utilizată pentru a deschide canalele Nav1.7. Ulterior, testul fluorescent a fost modificat astfel încât canalele Nav1 au fost preincubate cu compus de testare în concentrații fiziologice extracelulare de sodiu și depolarizarea dependentă de Nav1 a fost inițiată prin adăugare agonistă (Fig. 1). Potențele inhibitoare ale canalelor măsurate în acest test modificat s-au corelat foarte bine cu inhibarea stării inactivate determinată de electrofiziologie în multe clase structurale de inhibitori Nav1 (Felix și colab., 2004; Liu și colab., 2006).
un test funcțional, cu potențial de membrană, pe bază de FRET pentru canalele Nav1.7. În absența altor conductanțe ionice care pot hiperpolariza celula, expresia heterologă a canalelor Nav1.7 oferă un sistem în care la potențialul membranei de repaus celular majoritatea canalelor vor locui în starea inactivată neconductoare. Eliminarea inactivării rapide prin adăugarea de veratridină schimbă echilibrul canalului la starea conductivă, deschisă, care permite intrarea sodiului care duce la depolarizarea celulelor. Modificările tensiunii pot fi monitorizate cu o pereche de coloranți de detectare a tensiunii, cumarină și oxonol. Depolarizarea celulară modifică distribuția oxonolului pe membrană, provocând o modificare a semnalului FRET. În prezența unui inhibitor Nav1.7, echilibrul canalului se deplasează spre conformația inactivată, legată de medicament, reducând numărul de canale care vor fi disponibile pentru modificarea veratridinei și prevenind semnalul FRET indus de agonist. Curba doză-răspuns pentru modificarea indusă de veratridină a semnalului FRET este abruptă, sugerând că modificarea unui număr mic de canale Nav1.7 este suficientă pentru a provoca depolarizarea celulelor.
deși analogii BPBT nu au reușit să depășească avantajul inițial în potență, chimia medicamentoasă a reușit să îmbunătățească profilul farmacocinetic, generând în cele din urmă trans-N-{metil }-N-metil-n’-ciclopentan-1,2-dicarboxamidă (CDA54) cu biodisponibilitate orală de 44%, timp de înjumătățire de o oră și o rată de clearance de 14 ml/min și kg, care a fost profilat extensiv in vivo (Brochu și colab., 2006). În două modele de șobolan de durere neuropatică, CDA54 (10 mg/kg, administrat oral) a redus semnificativ hipersensibilitatea comportamentală indusă de leziuni nervoase cu 44-67%. Aceeași doză / concentrație plasmatică de CDA54 nu a afectat nocicepția acută (testul plăcii fierbinți la șobolan), coordonarea motorie (testul rotorod la șobolan) sau conducerea cardiacă (parametrii electrofiziologici măsurați la câinele cardiovascular). Aceste proprietăți sunt în contrast cu cele ale blocantelor actuale ale canalelor de sodiu utilizate în clinică, care determină o coordonare motorie afectată la șobolani și efecte secundare ale SNC la om la toate dozele eficiente. Interesant, la administrarea orală, raportul creier-plasmă pentru CDA54 a fost de 0,03. În schimb, blocanții Nav1 utilizați clinic se acumulează în SNC, cu un raport creier / plasmă mai mare de 10 pentru mexiletină. Aceste date obținute cu CDA54 au sugerat cu tărie că inhibarea canalelor de sodiu PNS în monoterapie este eficace la modelele animale de durere neuropată și că limitarea expunerilor la SNC ale inhibitorilor Nav1 este o abordare viabilă pentru dezvoltarea inhibitorilor Nav1 cu un indice terapeutic îmbunătățit.
o campanie UHTS, folosind testul pe bază de potențial de membrană descris pentru a examina inhibitorii Nav1.7, a descoperit romanul inhibitori ai canalului 1–benzazepin-2-one (Hoyt și colab., 2007; Williams și colab., 2007). Această clasă de inhibitori a demonstrat o relație structură–activitate definită și, atunci când au fost evaluați in vivo, membrii acestei serii au fost eficienți pe cale orală în modelele de durere neuropată și epilepsie la rozătoare. Important, unii membri ai acestei clase au afișat selectivitate moleculară pentru canalele Nav1.7 (Williams și colab., 2007). De exemplu, compusul 2 din Fig. 2 a fost foarte dependentă de stat și de 10 ori selectivă pentru Nav1.7 peste Nav1.8 și Nav1.5. Cel mai puternic, deși nu selectiv Subtip, membru al acestei clase de inhibitori Nav1.7 (compus 1, BNZA; Fig. 2) a fost tritiat. BNZA se leagă cu afinitate ridicată (Kd de 1,6 nM) la canalele NaV1.7 recombinante. Aceasta este prima demonstrație a legării ligandului cu afinitate ridicată la Nav1.7 și oferă un instrument valoros de screening cu care să căutați compuși selectivi Nav1.7. Datele obținute cu seria structurală 1-benzazepin-2-onă sugerează că Nav1.7-se pot identifica analogi selectivi și, cu proprietățile farmacocinetice și de metabolizare a medicamentelor adecvate, astfel de compuși ar putea fi dezvoltați ca agenți analgezici, prezentând potențial o tolerabilitate îmbunătățită față de medicamentele existente utilizate pentru tratarea durerii neuropatice. Sprijinul pentru fezabilitatea dezvoltării inhibitorilor canalului de sodiu selectivi la Subtip ca analgezice noi provine din raportul recent al unui agent selectiv Nav1.8 cu afinitate ridicată, care administrat intraperitoneal a fost eficient într-o gamă largă de modele de durere la rozătoare (Jarvis și colab., 2007).
inhibitori Nav1 1-Benzazepin-2-onă. Structurile a doi inhibitori Nav1 1-benzazepin-2-onă sunt ilustrate împreună cu potențele lor pentru canalele hNav1.5, hNav1.7 și hnav1.8, așa cum sunt determinate în potențialul membranei funcționale, teste pe bază de FRET. Sunt prezentate, de asemenea, potențele estimate ale acestor compuși pentru starea inactivată a canalelor hNav1.5 și hNav1.7, determinate din înregistrările electrofiziologice. Rețineți că numai compusul 2 afișează selectivitatea pentru canalul hNav1.7. Ambii compuși sunt inhibitori mai slabi ai canalului hNav1.8.
o potențială abordare alternativă pentru căutarea inhibitorilor selectivi ai canalelor de sodiu Subtip ar fi examinarea compușilor care vizează mecanismele de închidere a canalelor. S-a demonstrat anterior că mai multe peptide modifică închiderea canalelor de sodiu, dar puține molecule mici, în special inhibitori, au fost descrise pentru a funcționa în acest mod. Un astfel de agent este ProTx-II, o peptidă de 30 de aminoacizi purificată din veninul tarantulei; această peptidă blochează canalele de sodiu și prezintă selectivitate pentru Nav1.7 (Smith și colab., 2007). ProTx-II se leagă de starea de repaus a canalelor de sodiu și schimbă dependența de tensiune a activării canalului la potențiale mai depolarizate. Depolarizările puternice depășesc inhibarea canalului, care este un semn distinctiv al acestui tip de peptidă modificatoare de închidere. O posibilă strategie de identificare a mimeticii moleculelor mici ale unei peptide modificatoare de închidere este marcarea radioactivă ProTx-II în formă biologic activă și dezvoltarea unui test de legare cu canalele Nav1.7 exprimate heterolog într-o linie celulară. Screeningul pentru molecule mici care modulează legarea ProTx-II ar putea dezvălui noi clase de inhibitori ai canalului care se împart în membrană și interferează cu mișcarea paletei de închidere, prevenind astfel deschiderea canalului. Un avantaj suplimentar al acestui tip de UHTS este că ar putea fi utilizate concentrații mari de compuși testați, situație care este exclusă în screeningul pe bază de coloranți datorită interferenței fluorescente care apare de obicei cu concentrații mari de multe molecule organice mici. Având în vedere că unele peptide modificatoare de închidere se leagă de regiuni care sunt unice pentru canalele specifice dintr-o super familie, inhibitorii selectivi de subtip ar putea fi identificați folosind o astfel de strategie.
